آزمایش‎ها و آزمایشگاه, مقالات

مروری بر تست‌های بیوشیمیایی برای تشخیص کوکسی‌های گرم مثبت

باکتری گرم مثبت

تهیه و تنظیم: دکتر محمد قهری

4.7 (93.33%) 3 vote[s]

مقدمه:

آزمایشگاه میکروب شناسی بالینی نقش مهمی را در تشخیص بیماری‌های عفونی بازی می‌کند. توانایی آزمایشگاه برای ایفای این نقش خود، به کیفیت نمونه جمع‌آوری‌شده از بیمار، چگونگی انتقال از بیمار به آزمایشگاه و روش‌های مورد استفاده برای ردیابی میکروب در نمونه بستگی دارد.

تشخیص آزمایشگاهی بیماری‌های باکتریایی:

ردیابی و شناسایی باکتری‌ها توسط پنج روش رایج در نمونه‌های بالینی صورت می‌گیرد:

  • میکروسکوپی
  • ردیابی آنتی‌ژن باکتریایی
  • ردیابی اسید نوکلئیک اختصاصی باکتری
  • کشت
  • ردیابی آنتی‌بادی اختصاصی باکتری (سرولوژی)

هرچند بیشتر ارگانیسم‌ها را می‌توان با تکنیک‌های متنوع به‌صورت اختصاصی شناسایی نمود، اما رایج‌ترین روش مورد استفاده در آزمایشگاه تشخیص طبی برای شناسایی و تعیین هویت یک ایزوله (متعاقب کشت) توسط تست‌های بیوشیمیایی صورت می‌گیرد؛ بنابراین با شناخت روش‌ها و تست‌های بیوشیمیایی و با کمک از مورفولوژی میکروسکوپی و ماکروسکوپی می‌توان به وجود عامل بیماری پی‌برد و آن را شناسایی کرد. در این نوشته تست‌های متنوع و پرکاربرد برای تشخیص کوکسی‌های گرم مثبت مورد بررسی قرار می‌گیرد.

کوکسی‌های گرم مثبت مجموعه‌ای ناهمگن از باکتری‌ها می‌باشند که خصوصیات مشترک آن‌ها عبارتند از:

  1. کروی بودن
  2. رنگ‌آمیزی گرم مثبت
  3. عدم وجود اندوسپور

بیشتر بخوانید: اختلاف های بین باکتری های گرم مثبت و باکتری های گرم منفی

محیط کشت مانیتول سالت آگار

این محیط کشت انتخابی برای ایزوله کردن باکتری‌های بیماری‌زای Staphylococci طبق متد‌های هماهنگ‌شده فارماکوپه و استانداردهای ایزو ۲۲۷۱۸:۲۰۰۶ توصیه شده‌ است. این محیط از درصد بالای نمک و معرف فنول‌رد تشکیل شده است و محیط کشت افتراقی برای تشخیص باکتری‌هایی است که در درصد بالای نمک می‌توانند رشد کنند. این محیط کشت قدیمی برای شمارش و شناسایی Staphylococci می‌باشد. در ضمن بین Staphylococci بیماری‌زا و توانایی آن‌ها برای تخمیر مانیتول رابطه مستقیم وجود دارد. تخمیر مانیتول در نتیجه تجمع تولید اسید پدیدار می‌شود که فنل قرمز را زرد رنگ می‌کند و هاله زرد رنگی اطراف کلنی‌ها که در فرض اولیه بیماری‌زا نیز هستند را دربر می‌گیرد. در حالی‌ که بقیه کلنی‌ها قرمز/نارنجی خواهند بود.

فقط Staphylococci و halophilic enterobacteria می‌توانند در این غلظت نمک در این محیط کشت رشد کنند و بقیه باکتری‌ها قابلیت رشد را در این محیط ندارند.

استافیلوکوک کواگولاز مثبت در این محیط کلونی‌های زرد رنگی تولید می‌کند و استافیلوکک‌های کواگولاز منفی کلنی‌های کوچک و صورتی یا قرمز رنگی تولید می‌کنند و هیچ‌گونه تغییر رنگی در محیط ایجاد نمی‌کنند.

واکنش باکتری‌های بیماری‌زای (+Staphylococci (Coagulase به مانیتول مثبت خواهند بود. کلنی‌های بزرگ با هاله زرد رنگ تولید می‌شود.

باکتری‌های غیربیماریزای (-Staphylococci (Coagulase به مانیتول منفی خواهند بود و کلنی‌های کوچک بدون هاله و یا بدون تغییر رنگ تولید خواهد شد.

باید وجود Coagulase با تکنیک‌های قدیمی آزمون شود تا بتوانیم ثابت کنیم که بیماری‌زا بودن حقیقت بالقوه این مدل باکتری‌ها است.

انواع باکتری های گرم مثبت

اولین آزمایش برای تشخیص کوکسی‌های گرم مثبت، انجام تست کاتالاز می‌باشد این تست استافیلوکوک‌ها را از استرپتوکوک‌ها جدا می‌کند. استافیلوکوک‌ها کاتالاز مثبت و استرپتوکوک‌ها کاتالاز منفی هستند.

بیشتر بخوانید: تست های بیوشیمیائی برای تشخیص افتراقی گونه‌های شایع استرپتوکوکی

بیشتر بخوانید: تست‌ های بیوشیمیایی برای شناسایی افتراقی گونه‌های شایع استافیلوکوکی

تست کاتالاز:

یکی از موارد استفاده از این تست برای جداسازی استافیلوکوک‌ها از استرپتوکوک‌ها می‌باشد. استافیلوکوک‌ها کاتالاز مثبت، ولی استرپتوکوک‌ها کاتالاز منفی هستند. آب اکسیژنه یکی از محصولات نهایی متابولیسم اکسیداتیو باکتری‌های هوازی و بی‌هوازی اختیاری است که تجمع آن برای باکتری خطرناک است. آنزیم کاتالاز موجود در باکتری، این ماده خطرناک را به H2O و O2 تجزیه می‌کند.

یک یا دو قطره آب اکسیژنه ۳% روی لام ریخته و چند کلونی داخل آن حل می‌کنیم. در صورتی که باکتری کاتالاز مثبت باشد به‌سرعت شروع به تولید O2 می‌کند که به‌صورت حباب‌هایی روی سطح لام مشاهده می‌شود. باید توجه داشت که استفاده از لوپ فلزی ممکن است مثبت کاذب دهد.

چنانچه از محیط بلادآگار استفاده شود، از ریختن آب اکسیژنه به‌طور مستقیم بر روی آن خودداری نموده و حتماً تست را روی لام انجام دهید زیرا گلبول‌های قرمز خود آنزیم کاتالاز دارند و تست به‌صورت مثبت کاذب، خوانده می‌شود. آب اکسیژنه موجود در بازار به‌صورت ۳۰% می‌باشد، بنابراین آب اکسیژنه ۳% از فرمول C1V1=C2V2 بدست می‌آید.

  غلظت H2O2 اولیه (۳۰ درصد) =C1

 میزان حجم H2O2 اولیه =V1

 غلظت H2O2 نهایی (۳ درصد) =C2

میزان حجمی که از H2O2 3 درصد لازم داریم  =v2

 

كاتالاز آنزيمي است كه H2Oرا به آب و اكسیژن تجزیه می‌کند. H2Oیكی از محصولات نهایی اكسیداسیون در متابولیسم كربوهیدرات است.

این تست به‌منظور:

  1. تشخیص استافیلوكوك و میكروكوك (كاتالاز مثبت) از استرپتوكوك (كاتالاز منفی)
  2. افتراق كلستریدیوم از باسیلوس‌ها (كاتالاز مثبت)
  3. افتراق لیستریا مونوسیتوژنز (كاتالاز مثبت) از استرپتوكوك بتاهمولیتیك

صورت می‌گیرد.

مراحل انجام كار:

  1. با یك اپلیكاتور چوبی از مركز یك كلنی به سطح لام شیشه‌ای انتقال می‌دهیم.
  2. یک قطره H2O2 را بلافاصله به كلنی روی لام اضافه می‌کنیم و ايجاد حباب روی لام بررسی می‌شود.
  3. ايجاد حباب‌های سریع و ماندگار با حالت جوش زدن (كف) نشانگر مثبت بودن تست است.

تست اکسیداز

این آزمون برای شناسایی و طبقه‌بندی باکتری‌های گرم منفی بکار می‌رود. آزمون اکسیداز نوعی تست غیرمستقیم برای تعیین وجود آنزیم سیتوکروم اکسیداز می‌باشد. سیستم سیتوکروم معمولاً فقط در ارگانیسم‌های هوازی وجود دارد که توانایی استفاده از اکسیژن را به‌عنوان گیرنده‌ی هیدروژن نهایی دارند. محصول نهایی این متابولیسم، آب و یا هیدروژن پراکسید (با کاتالاز شکسته می‌شود) می‌باشد.

ماده‌ای که معرف اکسیداز را احیا می‌کند سیتوکرم C می‌باشد. پس نتیجه مثبت آزمون، وجود سیتوکروم  C را نشان می‌دهد و این باکتری‌ها سیتوکروم C را به‌عنوان آنزیم تنفسی دارا می‌باشند.

معرف این آزمون، تترامتیل پارافینیلین دی‌آمین دی‌هیدروکلراید است که به‌آسانی توسط سیتوکروم C اکسید شده و رنگ ارغوانی تولید می‌کند. این معرف به نور حساس است و سریع اکسید می‌شود، بنابراین در شیشه‌های تیره رنگ نگهداری می‌شود.

ارگانیسم‌های دارای سیتوکروم، سازنده‌ی آنزیم اکسیداز درون سلولی می‌باشند. این آنزیم اکسیداز، کاتالیز‌کننده‌ی اکسیداسیون سیتوکروم C می‌باشد. ارگانیسم‌هایی که دارای سیتوکروم C به‌عنوان بخشی از زنجیره‌ی تنفسی خود هستند، اکسیداز مثبت بوده و معرف را به رنگ آبی یا بنفش درمی‌آورند. ارگانیسم‌هایی که فاقد سیتوکروم C به‌عنوان بخشی از زنجیره‌ی تنفسی خود هستند، اکسیداز منفی بوده و طی انجام تست، رنگی تشکیل نمی‌دهند.

مطلب مرتبط: تست اکسیداز

مراحل انجام كار:

چنانچه بعد از ایزوله کردن و رنگ‌آمیزی گرم، کوکوباسیل‌های گرم منفی مشاهده شود مشکوک به باکتری‌های خانواده انتروباکتریاسه و گروه سودوموناس می‌شویم.

  1. دو تا سه قطره از معرف را مستقیم بر روی کلنی‌های مشکوک در داخل پلیت می‌ریزیم.
  2. سپس تغییرات رنگ را طی ۱۰ ثانیه بررسی می‌کنیم.
  3. کلنی‌هایی که به رنگ بنفش یا آبی تیره درآیند اکسیداز مثبت و کلنی‌هایی که تغییر رنگ ندهند اکسیداز منفی هستند.

تست حساسیت به دیسک اُپتوچین[۱]

برای تشخیص استرپتوکوک پنومونیه از استرپتوکوک‌های آلفاهمولیتیک استفاده می‌شود. پنوموکوک‌ها به دیسک اپتوچین (اتیل هیدروکوپرئین هیدروکلراید) حساس هستند و منطقه‌ی عدم رشد را در اطراف دیسک تشکیل می‌دهد.

مراحل انجام كار:

یک یا دو کلنی از کشت جوان را برداشته و در سطح پلیت بلادآگار به‌صورت یکنواخت کشت می‌دهیم. سپس با پنس استریل، دیسک اپتوچین را برداشته و در وسط پلیت قرار داده و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷-۳۵ درجه انکوبه می‌کنیم و سپس پلیت را از نظر هاله عدم رشد بررسی می‌کنیم. اگر هاله عدم رشد در حدود ۱۴ میلی‌متر و بیشتر برای دیسک ۶ میلی‌متری و ۱۶ میلی‌متر و بیشتر برای دیسک ۱۰ میلی‌متری باشد نمونه موردنظر احتمالاً استرپتوکوکوس پنومونیه می‌باشد.

 تست حساسیت به دیسک باسیتراسین[۲]

باسیتراسین ماده‌ای است که از میکروارگانیسم‌های گرم مثبت مانند گروه باسیلوس سوبتیلیس تهیه می‌گردد. بیشتر استرپتوکوک‌های گروه A به باسیتراسین حساس هستند. دیسک دارای ۰/۰۴ واحد باسیتراسین (نوعی آنتی‌بیوتیک پلی‌پپتیدی) مانع از رشد استرپتوکوکوس‌های β همولیتیک گروه A شده و بر استرپتوکوکوس‌های بتاهمولیتیک گروه B اثری ندارد.

این تست تشخیصی تنها برای β همولیتیک‌ها ارزش دارد چون برخی از α همولیتیک‌ها (پنوموکوکوس) نیز به تراکم‌های پائین باسیتراسین حساسند.

مراحل انجام كار:

۱- بر روی محیط بلاد آگار باکتری موردنظر کشت داده می‌شود.

۲- دیسک باسیتراسین ۰/۰۴ (U) را با پنس بر روی منطقه کشت‌شده قرار داده و کمی فشار داده می‌شود.

۳- در دمای ۳۵ درجه‌ی سانتریگراد برای مدت ۲۴-۱۸ ساعت در شرایط، انکوبه می‌کنیم.

۴- قطر هاله فقدان رشد اندازه‌گیری می‌شود. قطر بیش از ۱۰ میلی‌متر مثبت تلقی خواهد شد.

  • مثبت: استرپتوکوکوس‌های β همولیتیک گروه A دارای هاله نبود رشد با قطر بیش از ۱۰ میلی‌متر است.
  • منفی: استرپتوکوکوس‌های β همولیتیک گروه B در اطراف دیسک باسیتراسین رشد می‌کنند.

تست حساسیت به دیسک نووبیوسین[۳]

تعیین حساسیت به نووبیوسین، جهت غربالگری استافیلوكوك‌های کوآگولاز منفی جداشده از نمونه‌های مختلف بکار می‌رود. چنانچه در اطراف دیسک هاله ممانعت از رشد ایجاد شود نشانه حساسیت باکتری بوده و بیانگر اپیدرمیدیس است و چنانچه هاله ایجاد نشود، نشانه مقاومت باکتری و بیانگر ساپروفیتیکوس است.

مراحل انجام كار:

  1. باکتری را بر روی محیط مغذی مانند بلاد آگار به‌صورت یکنواخت کشت می‌دهیم.
  2. دیسک نووبیوسین (حاوی ۵ میکروگرم) را در سطح محیط قرار می‌دهیم.
  3. پلیت را در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۸ ساعت نگهداری می‌کنیم.

ایجاد هاله عدم رشد در اطراف دیسک نشانه حساسیت به آنتی‌بیوتیک نووبیوسین می‌باشد.

تست کواگولاز

در سطح برخی باکتری‌ها نظیر استافیلوکوک ارئوس، ماده‌ای به نام کواگولاز متصل شده است که کواگولاز متصل به دیواره‌ی سلولی یا فاکتور توده‌کننده نام دارد. کواگولاز نوعی آنزیم پروتئینی است که به‌وسیله چندین نوع ریزاندام به‌وجود می‌آید. کواگولاز ممکن است ترشحی باشد و به بیرون ترشح شود. کواگولاز به فیبرینوژن محلول متصل‌شده و به کمک مواد و عواملی که در سرم وجود دارند و در حضور پلاسما، موجب لخته شدن، انعقاد پلاسما و تجمع پلاکت‌ها می‌شود. درواقع این آنزیم باعث می‌شود فیبرینوژن محلول به فیبرین نامحلول تبدیل شود و لخته را به‌وجود می‌آورد.

کواگولاز در تشکیل دیواری از فیبرین در اطراف ضایعات استافیلوکوکی دخالت می‌کند که موجب مقاومت و پایداری این باکتری‌ها در بافت می‌گردد، زیرا عوامل دفاعی بدن قادر نیستند به آنجا راه یابند و از طرف دیگر با ایجاد رسوبی از فیبرین در سطح استافیلوکوک‌ها از فاگوسیتوز شدن و تخریب باکتری‌ها جلوگیری می‌کنند. در آزمایشگاه‌ها از وجود یا عدم وجود کواگولاز در تشخیص بین انواع گوناگون استافیلوکوک استفاده می‌کنند. این پروتئین همچنین از یرسینیا پستیس نیز تهیه می‌گردد.

این واکنش باید طی ۱۰ ثانیه قرائت شود و گذاشتن یک کنترل جهت واکنش اتوآگلوتیناسیون تعداد نتایج مثبت کاذب را کاهش می‌دهد. پلاسمای خرگوش با EDTA و یا سیترات نسبت به پلاسمای انسانی جهت انجام آزمایش کوآگولاز ترجیح داده می‌شود، زیرا پلاسمای انسانی ممکن است دارای فاکتورهای مهارکننده واکنش باشند. آزمایش فاکتور جمع‌کننده جهت شناسایی احتمالی استافیلوکوک اورئوس با استفاده از معرف‌های ایمونولوژیک اختصاصی جهت آزمایش آگلوتیناسیون ذرات دگرگون شده است، زیرا از این معرف‌ها می‌توان جهت شناسایی آنتی‌ژن‌های سطحی سلول مانند پروتئین A و فاکتور جمع‌کننده استفاده نمود و بدون احتیاج به آزمایش‌های اضافی بر روی باکتری‌هایی که فاکتور جمع کننده‌شان منفی است آنها را به‌طور سریع و قطعی مورد شناسایی قرار داد.

مراحل انجام كار:

به‌عنوان معرف از پلاسمای انسان یا پلاسمای خرگوش که با EDTA (ماده ضد انعقادی) یا سیترات تهیه شده، استفاده می‌شود.

  1. روی لام یا اسلاید شیشه‌ای یک قطره آب مقطر یا سرم فیزیولوژی را به‌عنوان کنترل قرار داده و یک قطره پلاسما در گوشه دیگر قرار می‌دهیم.
  2. با یک لوپ یا آنس، مقداری از کلنی را در هر یک از دو قطره مخلوط کرده تا سوسپانسیون یکنواختی تهیه شود.
  3. هر دو قطره را از نظر تشکیل لخته بررسی می‌کنیم.

تجمع سریع و لخته در لام نشان از مثبت بودن تست و در غیر این صورت نشان از منفی بودن تست دارد و سوسپانسیون در شکل یک محلول شیری رنگ صاف و یکنواخت باقی می‌ماند.

تست کوآگولاز اسلایدی:

روی یک لام یک یا دو کلونی در سرم فیزیولوژی حل می‌کنیم تا سوسپانسیون یکنواختی حاصل شود. یک قطره پلاسما به سوسپانسیون افزوده و با کمک لوپ، سوسپانسیون یکنواختی ایجاد می‌کنیم. ایجاد توده لخته مانند در مدت ۵ تا ۱۰ ثانیه بیانگر مثبت بودن تست است و در صورتی که تست کوآگولاز اسلایدی منفی شود باید روش لوله‌ای را انجام داد.

تست کوآگولاز لوله‌ای:

در میکروب‌شناسی از این تست برای جداسازی استافیلوکوک اورئوس از بقیه استافیلوکوک‌ها استفاده می‌شود.

در این تست از پلاسمای خرگوش یا انسان همراه با EDTA یک درصد (۱%) یا سدیم سیترات ۳-۲% استفاده می‌شود. در ۰/۵ سی‌سی پلاسمایی که به نسبت ۱ به ۵ با سرم فیزیولوژی رقیق شده است، چند کلنی را حل کرده و در ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌شود. بعد از ۱ تا ۴ ساعت از نظر ایجاد لخته بررسی نموده و در صورت منفی بودن ۲۴ ساعت بعد نیز بررسی می‌شود.

تست DNase:

اغلب سویه‌های استافیلوکوک اورئوس توسط تست کوآگولاز مشخص می‌شوند، ولی برخی از آن‌ها واکنش کوآگولاز ضعیف دارند که می‌توان از تست DNase برای تشخیص آن‌ها استفاده کرد. تقریباً تمامی استافیلوکوک اورئوس‌ها DNase مثبت هستند.

روش انجام تست:

باکتری‌ها را روی محیط DNase کشت داده و به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه کرده و پس از آن چند قطره HCL یک نرمال روی کلونی‌ها می‌ریزیم. اگر در اطراف کلونی‌ها ناحیه شفاف ظاهر شد دلیل بر مثبت بودن تست و اگر ناحیه تیره و مات ایجاد شود دلیل بر منفی بودن آن است.

تست هیدرولیز  PYR (ءL- پیروگلوتامیک اسید بتانفتیل آمید):

هدف انجام این تست تشخیص احتمالی استرپتوکوک گروه A و انتروکوک از سایر استرپتوکوک‌هاست.

استرپتوکوک پیوژنز و گونه‌های جنس انتروکوک قادر به هیدرولیز PYR هستند این تست برای تشخیص استرپتوکوک پیوژنز اختصاصی‌تر از تست حساسیت به باسیتراسین بوده و برای انتروکوک به‌اندازه تست بایل‌اسکولین و کلریدسدیم اختصاصی می‌باشد. باکتری توسط پپتیدازهای خود PYR را هیدرولیز می‌کند و بتانفتیل آمید تولید می‌شود که با اضافه کردن معرف سیانامید رنگ قرمز تولید می‌گردد.

روش انجام تست:

به دیسک کاغذی آغشته به PYR که قبلاً مرطوب شده مقداری از باکتری را تلقیح می‌کنیم و بعد از گذشت دو تا سه دقیقه مقداری از معرف سیانامید به آن اضافه می‌کنیم. تولید رنگ قرمز نشان‌دهنده مثبت بودن تست است.

تست حلالیت در صفرا:

حلالیت در صفرا یکی از خصوصیات باکتری پنوموکوک است که به‌موازات تست حساسیت به اپتوچین برای تشخیص این باکتری بکار می‌رود. این باکتری بعد از اینکه با صفرا مواجه می‌شود، اتولیزین‌های موجود در باکتری فعال شده و استرپتوکوک‌ها را لیز می‌کنند.

از صفرای ۱۰% گاوی یا خرگوش که استریل شده است، استفاده می‌شود. سوسپانسیون غلیظی از باکتری موردنظر را به دزوکسی کولات‌سدیم اضافه کرده و پس از ۳ ساعت انکوبه در ۳۵ درجه سانتی‌گراد کدورت مایع موردنظر بررسی می‌شود.

 تست اپتوچین:

این تست در تشخیص استرپتوکوک پنومونیه استفاده می‌شود.

محیط بلادآگار با کلونی موردنظر کشت داده می‌شود. یک دیسک اپتوچین (اتیل هیدروکوپروئین هیدروکلراید) در وسط پلیت قرار داده و پلیت را در جار شمع در دمای ۳۵ الی ۳۷ درجه به مدت ۲۴ ساعت انکوبه می‌کنیم. اگر رشد باکتری در اطراف دیسک مهار شود باکتری به اپتوچین حساس بوده و احتمالاً استرپتوکوک پنومونیه است.

استافیلوکوک‌ها:

استافیلوکوک‌ها (استافیلو به معنای خوشه انگور) شامل کوکسی‌های گرم مثبت ۱٫۵-۰٫۵ میکرومتری هستند که معمولاً به‌صورت گروه‌های نامنظمی یافت می‌شوند که بین آن‌ها کوکسی‌های دوتایی یا چهارتایی نیز وجود دارد. اعضای این گروه بی‌هوازی اختیاری، غیرمتحرک و غیراسپورزا هستند. استافیلوکوک‌ها روی پوست، درون دهان، مجرای فوقانی تنفسی به‌صورت کومنسال وجود دارند و می‌توانند در بدن ایجاد بیماری کنند.

سه گونه مهم از استافیلوکوک‌ها که در آزمایشگاه بالینی پراهمیت هستند:

  1. استافیلوکوکوس اورئوس (طلایی)
  2. استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (پوست خارجی)
  3. استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس (ساپروفیتیکوس از واژه ساپروفیتیک (عاملی که روی بافت مرده رشد می‌کند) گرفته شده است که ساپروس به معنای فاسد و فایتون به معنای گیاه است).
  4. در آزمایشگاه بالینی از تست مانیتول سالت آگار و Dnase و تست‌های دیگر جهت تمایز گونه‌های بیماری‌زای استافیلوکوک‌ها ‌استفاده می‌شود. aureus  به‌عنوان ﯾﮏ ﻋﺎﻣﻞ ﻣﻬﻢ بیماری‌زا در انسان ﺷﻨﺎﺧﺘﻪ ﻣﯽﺷﻮد که مهم‌ترین عامل مسمومیت‌های غذایی و همچنین عامل استئومیلیت، پنومونی‌های باکتریایی و بیماری‌های دیگر است. همه‌ی سویه‌های بیماری‌زای S.aureus کوآگولاز مثبت هستند درحالی‌که گونه‌های دیگر ا‌ستافیلوکوکی، کوآگولاز منفی می‌باشند؛ در واقع کوآگولاز با محصور کردن باکتری‌های تولیدکننده آن و ایجاد لخته، باکتری‌ها را در مقابل آنتی‌بادی و فاگوسیتوز شدن توسط فاگوسیت‌کننده‌ها حفظ می‌کند و بیماری‌زایی آن‌ها را افزایش می‌دهد. همه انسان‌ها روی پوستشان استافیلوکوک‌های کوآگولاز منفی دارند. کلونیزاسیون موقت استافیلوکوک اورئوس در مناطق چین‌دار مرطوب پوست امری رایج است؛ همچنین کلونیزاسیون استافیلوکوک اورئوس در نواحی بند ناف پوست و پرینه نوزادان امری رایج است. از آنجایی که استافیلوکوک‌ها روی پوست و در نازوفارنکس یافت می‌شوند، انتشار باکتری رایج بوده و عامل بروز عفونت‌های اکتسابی بیمارستانی می‌باشند.

استافیلوکوک طلایی (S. aureus)

کلنی‌های صاف و بزرگ از مشخصات این باکتری می‌باشد. در صورت رشد استافیلوکوک اورئوس روی محیط بلاد آگار، گلبول‌های قرمز به‌دلیل تولید آلفاتوکسین متلاشی می‌شوند و همولیز β ایجاد می‌کنند.

باکتری S.aureus

شکل ۲٫ نمایی از باکتری S.aureus

رنگ زرد اطراف کلنی‌های S.aureus به دلیل تخمیر قند مانیتول می‌باشد ولی در استافیلوکوک اپیدرمیدیس به دلیل عدم توانایی تخمیر قند مانیتول، اطراف کلنی‌ها رنگ زرد ایجاد نمی‌شود. این تست در استافیلوکوک ساپروفیتیکوس متغیر است.

برای تشخیص استافیلوکوک اورئوس از سایر استافیلوکوک‌ها می‌توان از تست کوآگولاز استفاده کرد.

  • اگر تست کوآگولاز مثبت شد باکتری استافیلوکوک اورئوس می‌باشد.
  • اگر تست کوآگولاز منفی شد باکتری استافیلوکوک اپیدرمیدیس و یا استافیلوکوک ساپروفیتیکوس می‌باشد.

برای تشخیص قطعی استافیلوکوک اورئوس از روش‌های زیر استفاده می‌شود:

  • کشت روی محیط مانیتول سالت آگار
  • تست Dnase
  • تست حساسیت به باسیتراسین ۴% واحدی و فورازولیدون ۱۰۰ میکروگرم

S.epidermidis:

باکتری S.epidermidis

شکل ۳٫ نمایی از باکتری S.epidermidis

یک گونه‌ی غیربیماری‌زا از جنس استافیلوکوک‌ها می‌باشد که فلور طبیعی پوست انسان بوده و به نووبیوسین حساس است. کلنی‌های مات، سفید، مدور و بزرگ بدون همولیز از مشخصات این باکتری می‌باشد.

S.saprophyticus:

باکتری S.saprophyticus

شکل ۴٫ نمایی از باکتری S.saprophyticus

این باکتری مولد عفونت مجاری ادراری، مخصوصاً در زنان است که به نووبیوسین مقاوم است.

استرپتوکوک‌ها:

استرپتوکوک‌ها کوکسی‌های گرم مثبتی هستند که مانند زنجیر به دنبال هم قرار می‌گیرند. کاتالاز منفی‌اند و در شرایط بی‌هوازی بهتر رشد می‌کنند و واکنش‌های همولیتیکی بهتری را نشان می‌دهند. برخی روی محیط بلاد آگار باعث لیزشدن گلبول‌های قرمز می‌شوند. بسیاری از استرپتوکوک‌ها پاتوژن‌های مهم انسان هستند که به دلیل وجود سه الگوی مختلف هم‌پوشان، متأسفانه طبقه‌بندی گونه‌ها در این جنس، دشوار است.

طبقه‌بندی استرپتوکوک‌ها معمولاً بر اساس تولید همولیزین روی محیط بلاد آگار است.

  • Β همولیتیک: همولیزین محلول تولید می‌کنند و معمولاً منطقه‌ای شفاف و مشخص اطراف کلنی ایجاد می‌کنند مانند استرپتوکوک پیوژنز
  • Α همولیتیک: همولیزین محلول تولید نمی‌کنند و منطقه‌ای نیمه‌شفاف و سبزرنگ اطراف کلنی‌ها ایجاد می‌کنند مانند استرپتوکوک ویریدانس
  • گاما همولیتیک (بدون همولیز): تغییر قابل مشاهده‌ای را طی رشد روی محیط بلاد آگار ایجاد نمی‌کنند.

البته استرپتوکوک‌ها بر اساس خاصیت آنتی‌ژن هم مورد بررسی قرار گرفته‌اند که بر اساس این طبقه‌بندی که لانسفيلد نامیده می‌شود، استرپتوکوک‌ها به گروه‌های … C ,B ,A تقسیم می‌شوند. وظیفه عمده‌ی یک باکتریولوژیست این است که مشخص کند استرپتوکوک بتا همولیتیک رشد کرده در محیط کشت، استرپتوکوک پیوژنز گروه A است یا جزء گروه دیگری از استرپتوکوک‌هاست، زیرا استرپتوکوک پیوژنز گروه A خاصیت پاتوژنی بیشتری نسبت به سایر گروه‌های استرپتوکوکی دارد.

نمونه‌های مورد آزمایش می‌توانند نمونه گلو، بینی، سواب‌هایی از واژن در موارد تب زایمانی، چرک (عفونت چرکی) یا خون (عفونت خون) باشند.

تشخیص باکتری:

ابتدا پلیت موردنظر را از نوع همولیز ایجادشده بررسی می‌کنند. در موارد ایجاد آلفاهمولیز، به دو گروه ویریدانس و پنوموکک مشکوک و در صورت ایجاد β همولیز، به گروه A و B مشکوک می‌شویم. البته این روش زیاد نیز دقیق نیست، چون بعضی از باکتری‌های β همولیتیک مثل آگالاکتیه، همولیز β واضح نشان نمی‌دهند، بنابراین می‌توان از تست حساسیت به SXT (سولفامتوکسازول و تری‌متوپریم) استفاده کرد که در این تست، گروه A و B به SXT مقاوم بوده ولی سایر گروه‌ها حساس‌اند.

گروه A (پیوژنز):
  • کاتالاز منفی
  • حساس به باسیتراسین
  • توانایی هیدرولیز PYR
گروه B (آگالاکتیه):

معمولاً به‌صورت سپتی‌سمی و مننژیت در نوزادان تظاهر می‌یابد که منبع عفونت بیش‌تر مادر نوزاد می‌باشد. همانطور که قبلاً گفته شد، گروه B همولیز واضحی همانند گروه A، نشان نمی‌دهند و گاهی اوقات نیز همولیز آلفا ایجاد می‌کنند و در برخی موارد گاما همولیتیک هستند.

برای تشخیص قطعی استرپتوکوک‌های گروه B می‌توان از روش‌های زیر استفاده کرد:

  • تست CAMP
  • تست هیدرولیز هیپورات سدیم

تست CAPM:

برای شناسایی احتمالی گروه B صورت می‌گیرد. تست CAMP مخفف نام افرادی است که این تست را برای نخستین بار ابداع کردند که شامل Christie-Atkins-Munch-Petersen می‌باشد.

تست CAMP

شکل ۵٫ نمایی از تست CAMP

واکنش CAMP

اساس واکنش نشان دادن خصوصیات سینرژیستیک بین رها شدن ماده خارج سلولی در حین رشد از استرپتوکوک گروه B و واکنش آن با بتاتوکسین استافیلوکوک اورئوس است که سبب افزایش همولیز در استافیلوکوک اورئوس می‌شود. این واکنش در بعضی از انواع کورینه باکتریوم وجود دارد و به شکل دیگری در لیستریا منوسیتوژنز و ویبریو کلره التور دیده می‌شود. برای انجام آن به استافیلوکوک ATCC 25923 نیاز است.

این آزمایش به سه روش انجام می‌شود:

  1. استفاده از سوش‌های aureus تولیدکننده بتا همولیزین
  2. دیسک‌های حاوی بتا همولیزین
  3. بتا همولیزین استخراج‌شده از استافیلوکوک اورئوس

همولیز بتا، در محلی که دو سویه استاف اورئوس و استرپتوکوک گروه B به هم نزدیک می‌شوند، تشدید می‌شود و شبیه به نوک پیکان دیده می‌شود و در این صورت تست CAMP مثبت می‌شود.

روش سوم به این صورت است که اگر یک قطره از بتا همولیزین استخراج‌شده از استافیلوکوک اورئوس، روی محیط کشت استرپتوکوکی ریخته شود، بعد از ۲۰ دقیقه انکوبه کردن در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد، شدت همولیز به‌خوبی قابل مشاهده می‌گردد.

هیدرولیز سریع هیپورات سدیم:

این باکتری می‌تواند هیپورات سدیم را هیدرولیز کرده و اسید بنزوئیک و گلیسین تولید کند. گلیسین توسط عامل اکسیدکننده‌ای به نام نین‌هیدرین، دی‌آمینه شده، احیا می‌شود و تولید رنگ بنفش می‌کند.

استرپتوکوک ویریدانس (strep.viridans):

اکثر باکتری‌های این گروه همولیز ناقص روی پلیت بلاد آگارایجاد می‌کنند (آلفا همولیتیک). فلور طبیعی دهان و حلق هستند و به علت ارتباط آن‌ها با عفونت دندان وآندوکاردیت باکتریایی حاد، اهمیت کلینیکی ویژه‌ای دارند. این باکتری‌ها در خون، زخم‌های بسته و آبسه‌ها نیز یافت می‌شوند.

روش تشخیص:

  • نسبت به اپتوچین مقاوم هستند. این ویژگی، این باکتری‌ها را از استرپتوکوک پنومونیه متمایز می‌سازد.
  • عدم حلالیت در صفرا
  • عدم رشد در محلول NaCl شش و نیم درصد (۶/۵ درصد)

انتروکوک و استرپتوکوک گروه D نیز ممکن است با این گروه اشتباه گرفته شوند. عدم رشد در NaCl شش و نیم درصد (۶/۵ درصد) می‌تواند آن‌ها را از انتروکوک متمایز سازد.

استرپتوکوک گروه D:

این گروه از باکتری‌ها می‌توانند آندوکاردیت، عفونت دستگاه ادراری، آبسه‌ها و عفونت‌های زخم را ایجاد کنند. این گروه ویژگی‌های خاصی دارند که در زیر به بخشی از آن‌ها اشاره می‌شود:

  • تست بایل اسکولین آن‌ها مثبت است.
  • نسبت به پنی‌سیلین حساس هستند درحالی‌که انتروکوک‌ها مقاوم‌اند.
  • در محیط حاوی NaCl شش و نیم درصد رشد نمی‌کنند.
  • تست PYR آن‌ها منفی است ولی این تست در انتروکوک‌ها مثبت می‌باشد.

در بعضی از گونه‌ها برای تمایز این گروه از استرپتوکوک ویریدانس نمی‌توان تنها بر اساس خصوصیات بیوشیمیایی تصمیم گرفت و باید سروتایپینگ صورت بگیرد.

استرپتوکوک فکالیس یا انتروکوک (strep.faecalis):

این باکتری معمولاً به‌صورت غیرهمولیتیک روی محیط بلاد آگار دیده می‌شود و عامل عفونت‌های مجاری ادراری و آندوکاردیت به‌ویژه در سالمندان می‌باشد. در زیر به بخشی از ویژگی‌های این گروه اشاره شده است:

  • فاقد حرکت و بدون کپسول می‌باشند.
  • روی محیط مکانکی به‌صورت کلنی‌های کوچک صورتی رنگ دیده می‌شوند.
  • حرارت ۶۰ درجه سانتی‌گراد را به مدت ۳۰ دقیقه تحمل می‌کنند. (این ویژگی آن‌ها را از سایر استرپتوکوک‌ها متمایز می‌کند)
  • قند مانیتول را تخمیر کرده و گاز تولید می‌کنند.
  • تست بایل اسکولین آن‌ها مثبت می‌باشد.
  • تست PYR آن‌ها مثبت است.
  • قادر به رشد در محیط حاوی NaCl شش و نیم درصد هستند.

نکته مهم در رابطه با این گروه آن است که ممکن است تست کاتالاز آنها مثبت خیلی ضعیف شود.

انواع باکتری های گرم مثبت

شکل ۶٫ چارت برخی از باکتری‌های گرم مثبت

استرپتوکوک پنومونیه یا پنوموکوک (pneumococcus):

به‌صورت دیپلوکوک‌های گرم مثبت، شعله‌ای شکل یا بیضی شکل دیده می‌شوند که انتهای مسطح آن‌ها در مقابل هم قرار می‌گیرد.

این باکتری‌ها در آزمایشگاه بعد از کشت‌های متناوب بدون کپسول می‌شوند، درحالی‌که در نمونه‌ی اولیه مریض دارای کپسول می‌باشند، بنابراین برای نگهداری آن‌ها در آزمایشگاه باید آن‌ها را به یک حیوان خاص مثل موش تلقیح کرد. به برخی از ویژگی‌های این باکتری در زیر اشاره شده است.

  • دارای همولیز ناقص است، بنابراین اطراف کلنی‌ها رنگ سبز ایجاد می‌شود که در محیط شکلات آگار بهتر دیده می‌شود.
  • نسبت به اپتوچین حساس است.
  • قادر به تخمیر اینولین می‌باشد.
  • تست حلالیت در صفرا در آن‌ها مثبت می‌باشد.
  • یکی از تست‌هایی که امروزه کمتر برای شناسایی این گروه مورد استفاده قرار می‌گیرد، تست کوالانگ است. (تست تورم کپسولی)

از این واکنش می‌توان برای شناسایی مستقیم ارگانیسم در نمونه خلط، مایع CSF و سایر نمونه‌ها استفاده کرد. در این تست سرم پنوموکوک و متیلن‌بلو را با نمونه بالینی یا کشت باکتری ترکیب می‌کنند و سپس نمونه را با عدسی ۱۰۰ مورد بررسی قرار می‌دهند. زمانی که باکتری موردنظر با آنتی‌بادی واکنش دهد و کپسول آن متورم شود نتیجه تست مثبت می‌شود.

*منابع:  (همراه با تصرف و تلخیص)

۱- فائزه اسدي، رحيمه رضازاده. میکروب شناسی تشخیصی. ماهنامه اخبار آزمایشگاهی . مرداد ۱۳۹۷. شماره ۱۷۱. صفحه: ۱۲۱-۱۱۸ و ۱۳۳.

۲- نوشین کیاست. آنالیز میکروبی و آنتی‌بیوگرام میکرواورگانیسم‌های جداشده از تلفن همراه کارکنان مراکز درمانی شهرستان ارومیه. ماهنامه اخبار آزمایشگاهی. مرداد ۱۳۹۷. شماره ۱۷۱. صفحه: ۹۷-۷۳

واژه‌نامه:

novobiocin (NB) disc [۳] Bacitracin Test [۲] Optochin Test [۱]

باز نشر هر کدام از مطالب شرکت پل ایده آل پارس تنها با ذکر منبع مجاز است