آزمایش‎ها و آزمایشگاه, مقالات

روش‌های بیوشیمیایی شناسایی انتروباکتریاسه ها (۱)

روش های شناسایی آنتروباکتریاسه ها

ترجمه و تنظیم: دکتر محمد قهری

5 (100%) 1 vote[s]

مقدمه:

انتروباکتریاسه ها (Enterobacteriaceae) شایع‌ترین گروه باسیل‌های گرم منفی هستند که در آزمایشگاه‌های کلینیکی از نمونه‌های بالینی جدا می‌شوند. این باکتری‌ها گروه بزرگ و ناهمگونی هستند كه محل زندگی طبیعی آن‌ها روده انسان و حیوانات است و قدرت بیماری‌زایی در انسان، حیوانات و گیاهان را دارند و به آسانی بر روی محیط‌های كشت مختلف از جمله ژلوز خوندار و ژلوز شكلاتی رشد می‌كنند و بر روی محیط‌های كشت انتخابی بسته به توانایی‌های متابولیك خود و یا تركیبات موجود در محیط كشت كلنی‌های مشخص و متمایزی ایجاد می‌كنند. این خانواده از جنس‌های زیادی از جمله

Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Escherichia, Ewingella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pragia, Pantoea, Photorhabdus, Proteus, Providencia, Rahnella, Salmonella, Serratia, Shigella, Tatumella, Trabulsiella, Xenorhabdus, Yersinia, and Yokenella

تشکیل شده‌اند که مهم‌ترین آن‌ها اشریشیا، شیگلا، سالمونلا، انتروباكتر، كلبسیلا، سراشیا، پروتئوس، اروینیا، سیتروباكتر، پروویدنشیا، مورگانلا و یرسینیا است که طبق طبقه‌بندی CDC در تیره‌های مختلف قرار می‌گیرند (جدول ۱). بعضی از آن‌ها فرصت‌طلب هستند و بعضی مانند سالمونلا و شیگلا و یرسینیا پستیس همیشه برای انسان بیماری‌زا می باشند (جدول ۲). این ارگانیسم‌ها بخش اصلی باكتری‌های بی‌هوازی اختیاری موجود در روده بزرگ را تشکیل می‌دهند. اگرچه در مقایسه با بی‌هوازی‌های اختیاری مانند باكتروئیدس‌ها نسبت كمی را تشكیل می‌دهند، ولی آن‌ها در میان شایع‌ترین باکتری‌های ایجاد‌کننده بیماری در کنار استافیلوکوک‌ها و استرپتوکوک‌ها قرار دارند. این باكتری‌ها باسیل‌های گرم منفی بدون اسپور با اندازه‌ای حدود ۰/۲ تا ۰/۵ میکرومتر پهنا و ۲ تا ۴ میکرومتر درازا هستند. اكثر آن‌ها متحرك و دارای تاژک‌های پری‌تریش (به‌جز tatumella كه تاژک قطبی دارد)، كاتالاز مثبت (به‌جز xenorhabdus و تیپ ۱ شیگلا دیسانتری كه منفی است) و اكسیداز منفی‌اند (به‌جز پلزیوموناس که اکسیداز مثبت بوده و جدیداً جزو انتروباکتریاسه ها طبقه‌بندی می‌گردند). پیلی در اكثر آن‌ها وجود دارد و دارای متابولیسم تنفسی و تخمیری هستند. هالوفیلیك نیستند، اكثر آن‌ها گلوكز را تخمیر نموده و اسید و گاز بوجود می‌آورند (به‌جز اروینیا، یرسینیا و شیگلا) و نیترات را به نیتریت تبدیل می‌نمایند (به‌جز اروینیا و بعضی یرسینیاها). درصد مولكول G+C در DNA آن‌ها بین ۳۸ تا ۶۰ درصد است و به‌استثناء اروینیا همگی دارای آنتی‌ژن مشترك انتروباکتریاسه هستند. انتروباکتریاسه ها روی محیط‌های کشت معمولی آزمایشگاه رشد می‌کنند و قدرت تولید اسید از گلوکز را دارند. شکل تیپیک این باکتری‌ها در رشد بر روی محیط‌های جامد آزمایشگاهی دیده می‌شود، اما شکل این باکتری‌ها در نمونه‌های کلینیکی بسیار متنوع است. در کلبسیلا کپسول‌ها بزرگ و منظم هستند، در حالیکه در انتروباکتر کوچک‌تر بوده و در سایر انواع بندرت دیده می‌شود.

حضور این باکتری‌ها در خارج از محیط روده مثلاً در زخم، گوش، مایع نخاع و غیره بیماری‌زا تلقی می شوند، اما همانطور كه گفته شد پاتوژن‌های روده‌ای این خانواده به سالمونلا، شیگلا، یرسینیا و بعضی از سوش‌های اشریشیا محدود می‌شوند، لذا در آزمایش مدفوع می‌بایست صرفاً به دنبال پاتوژن‌های مذکور گشت و آن‌ها را تعیین هویت نمود.

در عفونت‌های خارج روده‌ای هم تعیین هویت باکتری‌های این خانواده از نظر بالینی (از نظر بررسی اپیدمیولوژیکی و نیز روش درمان بر اساس الگوی مقاومت هر باکتری تا زمانی که آنتی‌بیوگرام آن مشخص گردد) تا حدی می‌تواند اهمیت داشته باشد. گرچه معمولاً آنتی‌بیوگرام زودتر از تعیین هویت مشخص می‌گردد، ولی باید متذکر شد که الگوی حساسیت دارویی در گونه‌های مختلف نسبی بوده و با گسترش روزافزون مقاومت دارویی قابل اعتماد نیست، علاوه‌بر این الگوهای مذکور در کشور ما مورد مطالعه و بررسی جدی قرار نگرفته و  تطابق آن  با کشورهای غربی معلوم نیست. نکته‌ی قابل توجه این است که باکتری‌های این خانواده از تمام عفونت‌های کلینیکی به‌جز عفونت‌های مقاربتی جدا می‌شوند. این باکتری‌ها بیماری‌هایی مانند گاستروانتریت، حصبه، اسهال خونی، سندرم اورمی همولیتیک، سپتی‌سمی، باکتریمی، اندوکاردیت و غیره را سبب می‌شوند. در عفونت ادراری مهم‌ترین انتروباکتریاسه ها گونه‌های اشریشا کلی، پروتئوس میرابیلیس، کلبسیلا پنومونیه و کلبسیلا اکسی‌توکا هستند. مهم‌ترین عامل پنومونی، کلبسیلا پنومونیه بوده و باکتریمی بیشتر توسط اشریشیا کلی، کلبسیلا پنومونیه، گونه‌های انتروباکتر و پروتئوس میرابیلیس رخ می‌دهد. عفونت‌های کسب‌شده از بیمارستان اغلب توسط سیتروباکتر، انتروباکتر و سراشیا منتقل می‌گردد. کالیماتوباکتریوم گرانولوماتیس و کلبسیلا گرانولوماتیس دو گونه از خانواده انتروباکتریاسه هستند که از طریق جنسی انتقال می‌یابند.

جدول ۱: تیره‌ها و جنس‌های خانواده انتروباکتریاسه
طایفه I: اشریشیه
اشریشیا
شیگلا
طایفه II: ادواردسیلائه
ادواردسیلا
طایفه III: سالمونلائه
سالمونلا
طایفه IV: سیتروباكتریائه
سیتروباكتر
طایفه V: كلبسیلائه
انتروباكتر
هافنیا
كلبسیلا
پانتوآ
سراشیا
طایفه VI: پروتئه
مورگانلا
پروتئوس
پروویدنشیا
طایفه VII: یرسینیئه
یرسینیا
طایفه VIII: ایروینیه
ایروینیا
الگوی طبقه‌بندی که در سال ۱۹۸۵ توسط CDC ارائه شده اشریشیا و شیگلا را در یک جنس اشریشیا-شیگلا قرار داده است.
جنس و گونه‌های خانواده‌ی آنتروباکتریاسه که در انسان قدرت کلونیزاسیون دارند و در ارتباط با بیماری هستند

سیستم API برای تشخیص انتروباکتریاسه ها در آزمایشگاه

سیستم API یک روش استاندارد و اصولی در مقیاس کوچک برای شناسایی انتروباکتریاسه ها (تا حد بیوتیپ) و سایر باکتری‌های گرم منفی است. این سیستم شامل لوله‌های کوچکی هستند که به‌صورت حفره درون نوارهای API تعبیه شده‌اند و حاوی سوبستراهای دهیدراته هستند. به این سوبستراها، سوسپانسیون باکتری اضافه شده و وقتی انکوباسیون انجام می‌گیرد، باکتری با محتوی لوله واکنش نشان داده و متابولیت‌های تولیدی توسط باکتری‌ها تحت تأثیر معرف‌ها قرار می‌گیرند و تغییر رنگ مشاهده می‌شود. این تغییرات بعد از ۲۴ تا ۴۸ ساعت انکوباسیون در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قابل ارزیابی هستند. در نگهداری نوارها بایستی دقت کرد و آن‌ها را در دمای ۲ تا ۸ درجه و در تاریکی نگهداری نمود. در صورت مراقبت کافی می‌توان نوارها را حداقل تا ۱۰ ماه استفاده کرد. این سیستم‌ها به آسانی ۲۳ تست بیوشیمیایی را در یک مرحله انجام می‌دهند.

استفاده از محیط های کشت افتراقی برای شناسایی انتروباکتریاسه ها

برای شناسایی افتراقی انتروباکتریاسه ها از محیط‌های متنوع کشت افتراقی استفاده می‌شود. اولین اقدام کشت کلنی‌های جداسازی شده در محیط‌هایی از قبیل کلیگلر آیرون آگار و یا محیط TSI است.

  كشت روی محیط كلیگلرآیرون آگار (KIA) و یا TSI   

هر دو محیط فوق حاوی پـــپتون، كلرورسدیم، لاكتوز، گلوكز، یك منبع گوگرد (‌تیوسولفات سدیم‌)، معرف آهن‌دار (‌فریك آمونیم سیترات)‌، معرف فنل‌رد و آگار هستند. در آن‌ها میزان لاكتوز ده برابر گلوكز است. برای کشت با آنس استریل، از كلنی باكتری‌های مجهول برداشت نموده و ابتدا در قسمت عمق و سپس در سطح شیب‌دار محیط به‌صورت خطوط زیگــــــــــزاك كشت داده می‌شود. در این محیط‌ها، تخمیر كربوهیدرات‌های گلوكز، لاكتوز، تولید گاز (H2 ,Co2) و سولفید هیدروژن (H2S) بررسی می‌شوند. باكتری‌هایی كه گلوكز را استفاده می‌نمایند، اسید تولید كرده و رنگ محیط را از قرمز به زرد تبدیل می‌كنند. چون طی استفاده از گلوكز، اسید ایجادشده در عمق لوله بیشتر از اسید تولید شده در سطح است و بعضی ارگانیسم‌ها از دكربوكسیلاسیون اكسیداتیو، پپتون‌های سطح محیط، تركیبات قلیایی ایجاد می‌نمایند، مقادیر كم اسید ایجادشده در سطح را خنثی نموده، ولی چون قادر به خنثی نمودن مقادیر زیاد اسید در عمق لوله نیستند، در نتیجه بعد از انكوباسیون ۲۴ ساعته، رنگ قرمز در سطح و رنگ زرد در ته لوله نمایانگر تخمیر گلوكز و عدم تخمیر لاكتوز است. باكتری‌هایی كه علاوه‌بر گلوكز، لاكتوز را نیز مورد استفاده قرار دهند، مقادیر زیادی از اسید در سطح ایجاد می‌كنند كه به‌وسیله محصولات قلیایی حاصل از پپتون‌ها خنثی نمی‌گردد، در نتیجه سطح و ته لوله هر دو به رنگ زرد باقـــــــی می‌ماند. تولید گاز (H2, CO2) به‌صورت شكاف یا حباب و تولید H2S به‌صورت رسوب سیاه‌رنگ در ته لوله مشخص می‌گردد (شکل ۱). لازم به یادآوری است که محیط TSI علاوه‌بر دو قند گلوكز و لاكتوز حاوی قند سوكروز است، ازاین‌رو در مورد باکتری‌هایی كه قادر به تخمیر لاكتوز و سوكروز نیستند واكنش مانند محیط KIA نشان می‌دهند، در صورتی كه باكتری‌هایی لاكتوز منفی ولی سوكروز مثبت باشند نتیجه به‌صورت كاذب، لاكتوز مثبت نشان می‌دهند. در جدول شماره ۳ تفسیر مختلف از محیط KIA نشان داده شده است و در جدول شماره ۴ واکنش‌های ایجادشده روی محیط‌های TSI و LIA جهت غربالگری انتروباکتریاسه های بیماری‌زا در آزمایشگاه بالینی نشان داده شده است.

نکته: برای جلوگیری از مشاهده لاکتوز مثبت کاذب، بهتر است بجای استفاده از محیط TSI از محیط KIA استفاده گردد (به‌خصوص در مورد باکتری‌های سوکروز مثبت مانند ویبریو و یرسینیا)

جدول ۳: تفسیر محیط KIA
تخمیر گلوكز و لاكتوز
glucose and lactose fermented
اسید در عمق، اسید در سطح
Acid slant / Acid butt
زرد، زرد
Yellow / Yellow
تخمیر گلوكز
glucose fermented
اسید در عمق، قلیا در سطح
Alkaline slant / Acid butt
زرد، قرمز
Red / Yellow
عدم تخمیر گلوكز و لاكتوز
Glucose and lactose not fermented
قلیا در عمق، قلیا در سطح
Alkaline slant / Alkaline butt
قرمز، قرمز
Red / Red
واکنش چند نوع باکتری بر روی محیط KIA
شکل1: واکنش چند نوع باکتری بر روی محیط KIA
واکنش‌های TSI و LIA مورد استفاده جهت غربالگری انتروباکتریاسه‌های بیماری‌زا در آزمایشگاه بالینی

منابع مورد استفاده:

۱- دكتر رضا میرنژاد، مروری تازه بر باسیل های گرم منفی، آنتروباکتریاسه – قسمت اول.  ماهنامه اخبار آزمایشگاهی. شماره ۱۸۰- سال ۱۳۹۸

۲- Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. Ellen Jo Baron., Sydney M. Finegold. 8th ed.  ۱۹۹۰

باز نشر هر کدام از مطالب شرکت پل ایده آل پارس تنها با ذکر منبع مجاز است