آزمایش‎ها و آزمایشگاه, مقالات

مروری بر باسیل های گرم مثبت اسپوردار (۱): باسیلوس ها

مروری بر باسیلوس ها
5 (100%) 1 vote[s]
کلنی های بتا همولیتیک باسیلوس سرئوس بر روی محیط خوندار
کلنی های بتا همولیتیک باسیلوس سرئوس بر روی محیط خوندار

تهیه و تنظیم: دکتر محمد قهری

باسیل‌های گرم مثبت تولیدكننده اسپور عبارتند از گونه‌های كلستریدیوم و باسیلوس. این باسیل‌ها در همه‌جا پراكنده بوده و ازآنجایی‌که اسپور تولید می‌کنند، می‌توانند سال‌ها در محیط زنده باقی بمانند. گونه‌های باسیلوس هوازی هستند درحالی‌که كلستریدیوم‌ها بی‌هوازی اجباری می باشند.

مطلب مرتبط: مروری بر باسیل‌های گرم مثبت اسپوردار (۲): کلستریدیوم ها

باسیلوس‌ها

در این جنس تعداد زیادی باسیل‌های درشت، گرم مثبت، هوازی یا بی‌هوازی اختیاری، کاتالاز مثبت و متحرک قرار دارند که در طبیعت به فراوانی یافت می‌شوند. باسیلوس‌ها اهمیت زیادی از لحاظ پزشکی و اقتصادی دارند. بسیاری از گونه‌ها استفاده صنعتی دارند و برای تولید آنتی‌بیوتیک (پلی‌میکسین B و باسیتراسین) الكل، ویتامین‌ها، حلال‌ها و آنزیم‌ها استفاده می‌شوند.

باسیلوس آنتراسیس (Bacillus anthracis)

باسیلوس آنتراسیس باسیل گرم مثبت با ۱ میكرومتر قطر و ۴ تا ۱۰ میكرومتر طول است كه انتهای باسیل‌ها چهارگوش بوده و به‌صورت واگن‌های قطار، پشت سر هم قرار می‌گیرند و بدون حركت است (شکل ۱). كپسول آن برخلاف سایر باكتری‌ها از جنس پروتئین (D گلوتامیك) است و به همراه اگزوتوكسین در پاتوژنز باكتری نقش دارد. اسپور این باكتری حدود یك میكرومتر طول دارد و می‌تواند برای مدت‌های طولانی در طبیعت باقی بماند. اسپور در محیط‌های كشت معمولی آزمایشگاه در ۳۷ درجه سانتیگراد به‌راحتی تبدیل به فرم رویشی شده و به‌صورت كلافی درهم‌پیچیده درمی‌آید. اسپور باكتری در دمای ۱۱۵ درجه سانتیگراد در مدت ۱۵ دقیقه غیرفعال می‌شود، ولی قادر است سال‌ها (حتی تا ۲۰ سال) در خاك و فرآورده‌های دامی زنده بماند كه این ویژگی عامل مهمی در انتشار بیماری به‌حساب می‌آید. سیاه‌زخم یكی از جدی‌ترین بیماری‌هایی است كه می‌تواند تعداد زیادی كشته در یك شهر یا منطقه بر جای بگذارد. دوز كشنده تنفسی اسپور حدود یك بیلیونیم گرم است. از سوی دیگر، دانشمندان با دستكاری در ژن این میكروب قادرند گونه‌های مقاوم در برابر واكسن‌ها و درمان‌های موجود را تولید نمایند.

کلنی های باسیلوس آنتراسیس بر روی محیط ژلوز خوندار
کلنی های باسیلوس آنتراسیس بر روی محیط ژلوز خوندار
شکل (1): نمای باسیل‌های چهارگوش پشت سرهم باسیلوس آنتراسیس
شکل (1): نمای باسیل‌های چهارگوش پشت سرهم باسیلوس آنتراسیس

این باکتری در خون، گوشت، پشم، پوست، مو، ادرار و مدفوع حیوانان مبتلا به سیاه‌زخم یافت می‌شود و باعث آلودگی چراگاه‌ها و مزارع می‌گردد و انسان به‌صورت تصادفی از طریق خراش پوستی، تماس با حیوانات آلوده، تنفس و مواد خوراکی آلوده می‌گردد. باسیلوس آنتراسیس موجب بیماری سیاه‌زخم (آنتراكس) می‌شود. این نام از كلمه یونانی anthrakis به معنی زغال گرفته شده كه به خاطر رنگ سیاهی است كه در زخم ناشی از بیماری ایجاد می‌شد. این بیماری عمدتاً بیماری گوسفند، بز، گوساله، اسب و چارپایان است و حیوانات دیگر (مانند موش صحرایی) به این بیماری نسبتاً مقاوم هستند. در انسان تقریباً ۹۵ درصد از موارد سیاه‌زخم را فرم پوستی (پوستول بدخیم) و ۵ درصد موارد را عفونت تنفسی بیماری پشم‌ریسان (Woolsorters’ disease) تشکیل می‌دهد. سیاه‌زخم گوارشی نادر است و در بیشتر موارد از آفریقا و آسیا كه گوشت آلوده را مصرف می‌كنند، گزارش شده است. در حیوانات، سیاه‌زخم گوارشی بیشتر از دو فرم دیگر بیماری است. آنتراكس مغزی (Meningeal anthrax) در حدود ۵ درصد موارد، از ادامه سه فرم دیگر آنتراكس حاصل می‌شود. باكتری توسط خون به مغز رفته و سبب مننژیت هموراژیك می‌گردد.

اقدامات لازم برای پیشگیری از بیماری در مناطق اندمیك عبارتند از:

سوزاندن یا دفن لاشه‌های آلوده در گودال‌های عمیق دارای آهك، ضدعفونی محصولات حیوانی (با اتوكلاو)، استفاده از دستكش و پوشاك محافظت‌كننده در افرادی كه در خطر بالای ابتلا قرار دارند، ایمن‌سازی فعال دام‌ها به كمك واكسن زنده ضعیف شده و واكسینه كردن افرادی كه در خطر شغلی بالایی هستند. این واكسن، از نوع بدون سلولی و حاوی آنتی‌ژن محافظت‌كننده خالص‌شده است.

باسیلوس سرئوس

باسیلوس سرئوس به‌صورت ساپروفیت در خاك، آب و هوا وجود دارد. این باكتری برخلاف باسیلوس آنتراسیس متحرك بوده و همولیزین تولید می‌كند. این باكتری در انسان سبب مسمومیت غذایی می‌شود كه دو شكل مجزا دارد: نوع استفراغ‌دهنده كه ناشی از مصرف برنج پخته‌شده است و نوع اسهالی كه ناشی از مصرف گوشت و سس است. باسیلوس سرئوس در غذا یا روده دو انتروتوكسین تولید می‌كند. شیوه عمل یكی از انتروتوكسین‌های آن مشابه سم وبا است و ایجاد اسهال می‌كند. شیوه عمل انتروتوكسین دیگر شبیه به انتروتوكسین استافیلوكك اورئوس است كه فرم استفراغی را سبب می‌شود. این فرم از انتروتوكسین مقاوم به گرما است. فرم اسهالی مسمومیت غذایی ناشی از باسیلوس سرئوس ۱۸-۱۰ ساعت پس از خوردن برنج پخته و محصولات لبنی در فرد ایجاد می‌شود و مشابه مسمومیت غذایی ناشی از كلستریدیوم پرفرنژنز است.

فرم استفراغی مسمومیت غذایی ناشی از باسیلوس سرئوس ۵-۱ ساعت پس از خوردن غذاهای آلوده به سم یا اسپور در فرد ظاهر شده و علاوه بر استفراغ، تهوع نیز مشاهده می‌شود. برای این بیماری درمان آنتی‌بیوتیكی توصیه نشده و فقط درمان علامتی صورت می‌گیرد. برای پیشگیری روش خاصی وجود ندارد.

باسیلوس سرئوس علاوه‌بر مسمومیت غذایی عامل مهم عفونت‌های چشمی شامل كراتیت شدید، اندوفتالمیت و پان‌افتالمیت است. به‌طور تیپیك ارگانیسم توسط جسم خارجی ناشی از ضربه وارد چشم می‌شود. این باکتری با عفونت‌های موضعی مثل اندوكاردیت، مننژیت، استئومیلیت و پنومونی ارتباط دارد. مصرف داروهای تزریقی یا وجود وسایل پزشكی در بدن، احتمال بروز این عفونت‌ها را بالا می‌برد. باسیلوس سوبتیلیس عامل مسمومیت غذایی است و گاهی سبب عفونت در افراد با ضعف ایمنی می‌شود.

نمای میکروسکپی باسیلوس سرئوس
نمای میکروسکپی باسیلوس سرئوس

تشخیص آزمایشگاهی

نمونه‌های ارسالی به آزمایشگاه: برای تشخیص بیماری سیاه‌زخم، از خون، CSF، چرك آبسه (پوستول)، خلط و مدفوع بیمار نمونه‌برداری می‌نمایند و برای تشخیص مسمومیت غذایی از باقیمانده مواد غذایی، مدفوع بیمار، مواد حاصل از استفراغ یا نمونه‌های دیگر (نمونه‌های چرك و خلط) استفاده می‌شود. در زخم‌های تازه می‌توان مایع را با خراشیدن ضایعه به‌وسیله سوزن تهیه و توسط سوآب برداشت نمود.

برای تشخیص باسیلوس‌ها از روش‌های زیر استفاده می‌شود:

آزمایش مستقیم

از نمونه‌ها دو لام تهیه کرده و بعد از خشک کردن، یک لام را رنگ‌آمیزی گرم و دیگری را که به‌طور ناقص با سه بار عبور سریع از روی شعله فیکس شده است، با رنگ گیمسا رنگ نمایید.

باسیل شاربن (سیاه‌زخم) در رنگ‌آمیزی گرم به‌صورت باسیل‌های بزرگ گرم مثبت، کپسول‌دار و بدون اسپور و مشابه واگن‌های قطار پشت سرهم قرار می‌گیرند. در رنگ‌آمیزی گیمسا به شکل باسیل‌های آبی که به‌وسیله مواد کپسولی (قرمز–ارغوانی) به‌طور نامنظم احاطه شده است، مشاهده می‌گردد.

کشت

نمونه‌ها را می‌توان مستقیماً در محیط‌های آزمایشگاهی در شرایط خاص (با رعایت شرایط ایمنی برای سیاه‌زخم) كشت داد. در مسمومیت غذایی نمونه های مدفوع را می‌توان با استفاده از شوك حرارتی کشت نمود، به این صورت كه ابتدا نمونه را در سرم فیزیولوژی یا آب مقطر رقیق نموده و در حرارت ۶۲/۵ درجه برای ۱۵ دقیقه (۷۰ درجه به مدت ۱۰ دقیقه) قرار می‌دهند تا كلیه باكتری‌های فعال از بین رفته و در این‌صورت فقط اسپورهای باقیمانده را بر روی محیط‌های مختلف كشت می‌دهند. پس از انكوباسیون در ۳۷-۳۵ درجه برای مدت ۲۴-۱۸ ساعت، مشخصات كلنی را بررسی می‌نمایند.

باسیلوس‌ها، از جمله باسیل سیاه‌زخم و باسیلوس سرئوس كلنی‌های بزرگ، پهن، نامنظم با حاشیه چین‌دار به‌اندازه  mmء۵-۴ که در اطراف كلنی رشته‌هایی (filament) كشیده و پیچیده شبیـــــه مـــوی مجعد (Medusa head) ایجاد می‌نمایند. كشت نمونه باكتری در مجاورت Co2 ,HCO3 و محیط‌های غنی، سبب ایجاد كپسول پلی‌پپتیدی (از جنس پلی‌گاما دی‌گلوتامیك اسید) می‌گردد.

تست سرولوژی

امروزه آزمایش‌هایی برای اندازه‌گیری آنتی‌بادی‌های تولیدشده بر ضد توکسین‌های ادم‌دهنده و کشنده در دسترس است، اما کاربرد چندانی ندارد. در استفاده از این تست‌ها می‌بایست افزایش ۴ برابر آنتی‌بادی در عرض ۴ هفته بررسی شود. یک تست مثبت باید یا دارای افزایش ۴ برابر در تیتر و یا به تنهائی دارای تیتر بالاتر از ۱:۳۲ باشد.

افتراق باسیلوس آنتراسیس از سایر باسیلوس‌ها

باسیلوس آنتراسیس بر روی محیط بلاد آگار فاقد همولیز بوده درحالی‌که باسیلوس سرئوس و بقیه باسیلوس‌ها همولیز β ایجاد می‌نمایند. باسیلوس آنتراسیس در كمتر از ۱۴ درجه و بیشتر از ۴۴ درجه رشد نـــمی‌كند و در ۴۴-۴۲ قدرت بیماری‌زایی خود را از دست می‌دهد. چنانچه این باکتری را در محیط لوله حاوی ژلاتین كشت دهند، حالتی شبیه سرو وارونه (قیف) ایجاد می‌كند و در محیط آب پپتونه و آبگوشت، دانه درشت در ته لوله و پرده نازك در سطح تشکیل می‌دهد، درحالی‌که بقیه باسیلوس‌ها لوله را كدر می‌كنند. باسیل سیاه‌زخم قندها را بدون ایجاد گاز تخمیر می کند، نشاسته را هیدرولیز، سرم را منعقد و شیر تورنسل‌دار را منعقد و بی‌رنگ می‌كند. كاتالاز، اكسیداز و VP مثبت بوده و نیترات را به نیتریت تبدیل می‌نماید. باسیلوس آنتراسیس بر روی محیط ائوزین متیلن بلو دارای رشد ضعیف یا فاقد رشد است. تزریق نمونه مشكوك به سیاه‌زخم، به حیوان حساس (خوكچه هندی) سبب مرگ آن حیوان پس از ۴۸-۲۴ ساعت می‌گردد. باسیل سیاه‌زخم به فاژ گاما (γ) حساس بوده، درحالی‌که سایر باسیلوس‌ها مقاوم هستند. باسیلوس سرئوس مانند باسیلوس آنتراسیس لسیتیناز مثبت است. در جدول ۱ وجه تمایز باسیلوس آنتراسیس و باسیلوس سرئوس نشان داده شده است.

جدول (۱): وجه تمایز باسیلوس آنتراسیس و باسیلوس سرئوس

وجه تمایز باسیلوس آنتراسیس و باسیلوس سرئوس

تست رشته مروارید (گردن‌بند) (String test)

چنانچه باسیل سیاه‌زخم به‌صورت غلیظ بر روی محیط مولرهینتون کشت داده شده و یک دیسك ۱۰ واحدی پنی‌سیلین روی آن به مدت ۶-۳ ساعت انكوبه شود، پس از برداشت نمونه از حاشیه ناحیه عدم رشد و تهیه گسترش و رنگ‌آمیزی می‌توان باكتری‌ها را به‌صورت رشته مروارید (گردن‌بند) مشاهده نمود، درحالی‌که بقیه باسیلوس‌ها این خصوصیت را ندارند. تشکیل رشته مروارید بدلیل حساسیت باسیل سیاه‌زخم به پنی‌سیلین است.

تست آسكولی

تست آسکولی آزمایشی حساس برای بررسی علت مرگ حیوان ناشی از باسیل سیاه‌زخم است؛ به این صورت كه قطعه كوچكی از احشاء حیوان مرده در اثر بیماری سیاه‌زخم را در هاون كوبیده، سپس به آن ۵ برابر سرم فیزیولوژی اضافه نموده و آن را می‌جوشانند، پس از سرد شدن، مقدار ml 0/5 از آن را در یك لوله آزمایش ریخته و بر روی آن چند قطره آنتی‌بادی اختصاصی می‌ریزند. چنانچه صفحه كدری در محل برخورد آنتی‌ژن با آنتی‌بادی مشاهده شود (واكنش پرسی‌پیتاسیون) دلیل بر وجود آنتی‌ژن باسیل سیاه‌زخم است.

نکته ۱:

آنتراكس را نمی‌توان در گستره‌های خشك با تكنیك‌های رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس شناسایی نمود. در آزمایشگاه‌های کلینیکی و مرجع از كشت دادن، تلقیح به حیوانات آزمایشگاهی (موش و خوكچه هندی)، فاژتایپینگ، الیزا و روش‌های مولکولی (PCR) در تشخیص آزمایشگاهی باسیلوس آنتراسیس استفاده می‌شود.

نکته ۲:

باسیلوس سرئوس را می‌توان در افراد دچار سوختگی، زخم پس از عمل جراحی، مننژیت، آبسه‌های مغزی، خلط و خون بدست آورد. وجود ۱۰۵ عدد باكتری و اسپور در یك گرم غذا یا مدفوع دلیل بر آلودگی است.

نکته ۳:

چنانچه باسیلوس‌ها در كشت كهنه گرم منفی نشان داده شود، برای تمایز اینها از باسیل‌های گرم منفی واقعی از بررسی حساسیت به دیسک وانكومایسین استفاده می‌شود كه باسیلوس‌ها حساس ولی باسیل‌های گرم منفی‌ها مقاوم‌اند. همچنین اگر كلنی باسیل‌های گرم منفی‌ را در یك قطره سود ۴۰ % حـل نماییم، ایجاد ویسكوزیته نموده و تشكیل رشته می‌دهند، درحالی‌که باسیلوس‌ها ایجاد ویسكوزیته نمی‌نمایند.

رنگ‌آمیزی اسپور

  1. از نمونه گسترش تهیه کرده و لام را فیكس نمایید.
  2. سپس رنگ مالاشیت گرین را روی لام ریخته و ۷-۵ دقیقه حرارت دهید.
  3. رنگ را خالی و لام را با آب شستشو داده و رنگ سافرانین را به مدت یک دقیقه روی آن بریزید.
  4. درنهایت رنگ را خالی کرده و لام را با آب شستشو دهید. پس از خشك نمودن، لام را زیر میکروسکوپ مشاهده نمایید. در لام اسپورها به رنگ سبز و جسم باكتری به رنگ صورتی یا قرمز دیده می‌شود. از رنگ‌آمیزی مولر هم برای مشاهده اسپور استفاده می‌نمایند.

[1] دكتر رضا میرنژاد، مروری تازه بر باسیل های گرم مثبت.  ماهنامه اخبار آزمایشگاهی. شماره ۱۸۰٫ سال ۱۳۹۸

باز نشر هر کدام از مطالب شرکت پل ایده آل پارس تنها با ذکر منبع مجاز است