تست‌های بیوشیمیایی برای شناسایی افتراقی گونه‌های شایع استافیلوکوکی

تهیه و تنظیم: دکتر محمد قهری

تست کوآگولاز

یکی از تست‌های قابل اعتماد در شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس می‌باشد که به دو روش لوله‌ای یا اسلایدی قابل اجرا است. کوآگولاز استافیلوکوکی یک پروتئین با ترکیبات ناشناخته می‌باشد که فعالیت مشابه پروترومبین داشته که فیبرینوژن را به فیبرین تبدیل می‌کند و لخته ایجاد می‌شود. برای انجام تست کواگولاز از پلاسمای خرگوش یا انسان که با EDTA تهیه شده (بصورت  لیوفیلیزه قابل دسترسی می‌باشد) استفاده می‌شود. می‌توان از خون تاریخ گذشته بانک خون و پلاسمای فریز شده تا دو هفته برای انجام آزمایش استفاده کرد. باید توجه داشت که در پلاسمای سیتراته بعضاً واکنش مثبت کاذب توسط برخی باکتری‌ها از جمله استرپتوکوک فکالیس ایجاد می‌شود. بیش از ۹۵٪ از جدایه‌های S. aureus تست اسلایدی کواگولاز مثبت هستند که clumping factor را شناسایی می‌کنند و تقریباً در ۱۰۰٪ جدایه‌ها تست لوله‌ای کوآگولاز مثبت می‌ شود. تست اسلایدی کواگولاز در استافیلوکوکوسلگدنسیس، استافیلوکوکوس شلفری مثبت است. در هر آزمون اسلاید باید یک کنترل از امولسیون کلنی‌های مشکوک در نمک استفاده شود تا اطمینان حاصل گردد که autoagglutination رخ نداده است. اگر اتوآگلوتیناسیون رخ داد، نتایج آزمون اسلاید برای تعیین ماهیت کواگولاز طبیعی در ایزوله‌ها نامناسب است.

برای کنترل کیفی تست باید از سوش‌های استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس (کنترل مثبت) و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (کنترل منفی) استفاده کرد.

برای انجام تست لوله‌ای چندین کلنی از باکتری را در لوله حاوی ۰/۵CC پلاسما که به نسبت ۱/۵ با سرم فیزیولوژی رقیق شده است حل کرده و در ۳۷-۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه نمائید. بعد از ۴-۱ ساعت از نظر ایجاد لخته بررسی نموده و در صورت منفی بودن آن را در حرارت اتاق انکوبه نموده و مجدداً بعد از ۱۸ ساعت آن را بررسی نمائید.

در روش اسلایدی بر روی لام یک یا دو کلنی را در آب مقطر یا سرم فیزیولوژی حل نموده تا سوسپانسیون یکنواختی حاصل شود (در صورتی که سوسپانسیون یکنواختی بدست نیاید از این روش در مورد آن سوش نمی‌توان استفاده کرد). در مرحله بعد یک قطره پلاسما را به کمک لوپ به سوسپانسیون افزوده و بهم بزنید. در طرف دیگر اسلاید یک قطره آب مقطر با سرم فیزیولوژی را که فقط به آن پلاسما اضافه شده به‌عنوان کنترل قرار دهید. بعد از ۱۰-۵ ثانیه ایجاد توده‌های لخته مانند، بیانگر مثبت بودن تست کوآگولاز اسلایدی می‌باشد. روش اسلایدی در بیش از ۹۵% موارد با روش لوله‌ای مطابقت دارد. در صورتی که تست کوآگولاز با روش اسلایدی منفی شد، باید با روش لوله‌ای تکرار گردد.

تست کاتالاز

بر روی لام، کلنی‌های مشکوک را با لوپ پلاتینی یا شیشه‌ای (پیپت پاستور) یا اپلیکاتور چوبی در یک قطره آب اکسیژنه ۳% حل کنید. ایجاد گاز دلیل بر مثبت بودن تست است. این تست در مورد میکروکوکاسه (به‌جز پلانوکوک) مثبت و در مورد استرپتوکوکاسه منفی می‌باشد.

نکات قابل توجه:

۱- تشکیل حباب‌های کوچک ۲۰ تا ۳۰ ثانیه بعد از مخلوط کردن مثبت در نظر گرفته نشود.

۲- حتی‌الامکان برای انجام تست کاتالاز بایستی کلنی‌ها از روی محیط بلادآگار برداشته نشود چرا که سلول‌های خون دارای آنزیم کاتالاز می‌باشند و سبب ایجاد نتایج مثبت کاذب می‌گردند.

تست تخمیر مانیتول

استافیلوکوکوس اورئوس برخلاف استافیلوکوک کوآگولاز منفی قدرت تخمیر مانیتول را دارد. برای اجرای تست، نمونه‌های مشکوک را روی محیط چاپمن یا مانیتول سالت آگار (MSA) که حاوی مانیتول (۱%)، ۷/۵% NaCl معرف فنل رد و پپتون می‌باشد، کشت دهید. بعد از ۲۴-۱۸ ساعت انکوباسیون در شرایط ۳۷ درجه سانتیگراد وجود هاله زرد رنگ اطراف کلنی‌ها نشانه تخمیر مانیتول و تأئید استافیلوکوکوس اورئوس می‌باشد. باید توجه داشت که استافیلوکوکوس اورئوس جداسازی‌شده بایستی با تست کوآگولاز تأئید قطعی شود.

تست DNase

بعضی از استرین‌های استافیلوکوکوس اورئوس‌ در تست کوآگولاز دارای واکنش ضعیف یا منفی هستند، لذا برای شناسایی این سویه‌ها از تست DNase استفاده می‌شود. برای انجام این تست، کلنی استافیلوکوکوس اورئوس را روی محیط DNase که به دلیل داشتن معرف تولوئیدین بلو آبی رنگ می‌باشد، کشت داده و بعد از ۲۴ ساعت انکوباسیون، هاله شفاف اطراف کلنی را بررسی نمایید. اگر هاله اطراف کلنی مشاهده گردید، تست مثبت می‌باشد که به دلیل تجزیه DNA توسط آنزیم DNase استافیکوکوک اورئوس است.

تست حساسیت به باسیتراسین و فورازولیدون

تمام استافیلوکوک‌ها برخلاف میکروکوک‌ها نسبت به باسیتراسین ۴% واحد مقاوم هستند و تمام استافیلوکوک‌ها برخلاف میکروکوک‌ها نسبت به فورازولیدون (FX) صد میکروگرم واحد حساس می‌باشند. برای انجام این تست ابتدا کلنی‌های مشکوک را به یک میلی‌لیتر محیط تریپتیکاز سوی براث منتقل کرده و کدورتی معادل ۰/۵ مک فارلند ایجاد نمایید. با استفاده از سوآب پنبه‌ای از محلول قبلی روی محیط مولر هینتون یا تریپتیکاز سوی آگار یا بلادآگار مانند انجام تست آنتی‌بیوگرام در سه جهت کشت داده شود. یک دیسک TaxoA باسیتراسین ۴% واحد و یک دیسک فورازولیدون (FX) صد میکروگرم را در سطح پلیت قرار دهید. بعد از ۱۸ ساعت انکوباسیون در شرایط ۳۵ درجه سلسیوس، هرگونه وجود هاله را مورد بررسی قرار دهید. استافیلوکوک‌ها در اطراف دیسک باسیتراسین رشد می‌کنند ولی میکروکوک‌ها رشد نمی‌کنند و معمولاً هاله‌ای به قطر بیش از ۱۰ میلی‌لیتر ایجاد می‌نمایند. برعکس میکروکوک‌ها در اطراف دیسک فورازولیدون رشد می‌کنند و یا هاله‌ای عدم رشد کمتر از ۹ میلی‌متر ایجاد می‌نمایند ولی استافیلوکوک‌ها حساس به فورازولیدون می‌باشند و هاله‌ای به قطر بیش از ۱۵ میلی‌متر ایجاد می‌کنند.

آنتی‌بیوگرام

به علت شیوع بالای نژادهای مقاوم، باید تمام نمونه‌های اسافیلوکوکی مشکوک را حتماً از نظر حساسیت آنتی‌بیوتیکی بررسی کرد تا به یافتن درمان انتخابی کمک شود. آنتی‌بیوتیک‌های مورد استفاده جهت آنتی‌بیوگرام:

1. (Penicillin (10 unit/disk: بیش از ۸۰% از استافیلوکوک‌های طلائی به پنی‌سیلین مقاومند.
2.  (Oxacillin (30 μg
3. (Erythromycin (15 μg
4. (Sulfamethoxazole (23.75 μg), Trimethoprim (1.25 μg
5. (Clindamycin(2 μg
6. (Augmentin (30 μg
7. (Fusidic acid (10 μg: در آنتی‌بیوگرام ادرار بجای آن باید از (Novobiocin (5 μg استفاده نمود.

در عفونت‌های موضعی (جلدی، چشمی و غیره) بجای Erythromycin ,Cotrimoxazole از (Neomycin(30 μg) ,Chloramphenicol(30 μg استفاده می‌شود.

استافیلوکوک‌های تولیدکننده بتالاکتاماز ممکن است هاله نسبتاً بزرگی اطراف دیسک پنی‌سیلین یا آمپی‌سیلین ایجاد نمایند، ولی رشد باکتری در مرز تلاقی آنها با هاله عدم رشد به‌صورت کپه‌ای و برجسته می‌باشد، درحالی‌که در سوش‌های حساس این حالت وجود ندارد و مرز رشد به‌صورت لبه نازکی مشاهده می‌شود. باکتری‌هایی که رشد آنها به فرم اول می‌باشد علیرغم وجود هاله عدم رشد باید مقاوم تلقی شوند.

استافیلوکوک‌های مقاوم به متی‌سیلین اغلب در روش معمول آنتی‌بیوگرام حساس تلقی می‌شوند، برای تعیین حساسیت به متی‌سیلین باید از محیط کشت نوترینت آگار به اضافه ۶% NaCl استفاده نمود یا اگر متی‌سیلین در محیط معمول آنتی‌بیوگرام به همراه سایر آنتی‌بیوتیک‌ها بررسی می‌شود، پلیت باید در ۳۴-۳۲ درجه سانتی‌گراد انکوبه گردد. نتیجه حساسیت به متی‌سیلین را می‌توان به گلوکزاسیلین، فلوگلوکزاسیلین، اگزاسیلین و بیشتر سفالوسپورین‌ها تعمیم داد. بیشتر استافیلوکوک‌ها به وانکومایسین، ریفامپین و موپیرویسن حساس می‌باشند.

استافیلوکوکوس کوآگولاز منفی (CoNS)

عفونت‌های ناشی از گونه‌های استافیلوکوکوس کوآگولاز منفی (CoNS) معمولاً در افرادی که پیوند دریچه قلبی، مفاصل و یا شنت دارند مشاهده می‌گردد. تشکیل بیوفیلم و مقاومت به آنتی‌بیوتیک در ایجاد باکتریمی و ادهسین‌های خاص در ایجاد عفونت‌های مفاصل نقش دارند. ارتباط با اجسام خارجی، دریچه مصنوعی به‌ویژه کاشت مفاصل و شنت رخ می‌دهد. CoNSها یکی از عوامل شایع مرتبط با عفونت شنت CSF می‌باشند. این عوامل بندرت سبب عفونت ادراری، پنومونی و نکروز پوستی می‌شوند. استافیلوکوکوس همولیتیکوس برخلاف سایر CoNSها مقاوم به وانکومایسین می‌باشد. S. lugdunensis از نظر مورفولوژیکی شبیه به استافیلوکوکوس اورئوس بوده (همولیز β با قطر کم ایجاد می‌کند) و گاهی اوقات کوآگولاز مثبت می‌باشد. این باکتری سبب آندوکاردیت و استئومیلیت می‌گردد و نسبت به سایر CoNSها تهاجمی‌تر است. در آزمایشگاه برای افتراق آن از سایر CoNSها بایستی تست حساسیت به اگزاسیلین (سفوکسیتین) که برای استافیلوکوکوس اورئوس استفاده می‌شود نه برای سایر CoNSها، انجام شود.

استافیلوکوک اپیدرمیدیس

این باکتری بخشی از فلور طبیعی بدن انسان (اغلب در پوست) می‌باشد و در بیماران بستری، افرادی که قطعات مصنوعی (مانند دریچه قلبی) در بدن خود دارند و در افرادی که دچار نقص ایمنی هستند، ایجاد سپتی‌سمی، اندوکاردیت، عفونت مجاری ادراری، استئومیلیت، عفونت چشمی، عفونت در نوزادان، عفونت جلدی و مننژیت می‌نماید.

به دلیل تشکیل بیوفیلم، مقاومت دارویی در سوش‌های مختلف آن به‌خصوص سوش‌های بیمارستانی بیشتر است. بیشتر سوش‌ها به پنی‌سیلین، آمپی‌سیلین، متی‌سیلین و گلوکزاسیلین مقاوم هستند. حساسیت نسبت به سفالوسپورین‌ها، جنتامایسین، فوزیدیک اسید و به‌ویژه وانکومایسین، ریفامپین و سیپروفلوکساسین زیاد است هرچند که نسبت به وانکوماسین مقاومت مشاهده شده است. سوش‌هایی که نسبت به اگزاسیلین‌ها مقاومت نشان می‌دهند (با همان روشی که برای استافیلوکوکوس اورئوس ذکر شد) می‌بایست در برابر کلیه سفالوسپورین‌ها مقاوم تلقی شوند.

استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس یا استافیلوکوک با کلنی‌های سفید کوآگولاز منفی بوده و بندرت همولیز بتا تولید می‌کند. در شناسایی آن از دیسک‌های پلی‌میکسین B و نووبیوسین استفاده می‌شود که این باکتری مانند استافیلوکوکوس اورئوس به پلی‌میکسن مقاوم و به نووبیوسین حساس می‌باشد.

استافیلوکوک ساپروفیتیکوس

استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس فلور طبیعی موقت پوست و اطراف مجاری ادراری می‌باشد و یکی از عوامل اصلی ایجادکننده عفونت‌های ادراری (سیستیت و پیلونفریت) در خانم‌های جوان با فعالیت جنسی بالا می‌باشد. این باکتری کوآگولاز منفی بوده و همانند استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس همولیز بتا تولید نمی‌کند و برخلاف استافیلوکوکوس اورئوس و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس حساس به پلی‌میکسین B و مقاوم به نووبیوسین می‌باشد، همچنین این باکتری به فلورکینولون‌ها و تری‌متوپریم- سولفومتاکسازول حساس می‌باشد.

تست سریع حساسیت به نووبیوسین

به دو لوله حاوی ۳ میلی‌لیتر Tripticase Soy Broth از سوش مشکوک تلقیح کنید، به‌نحوی که هیچ کدورت محسوسی ایجاد نشود، سپس در یکی از لوله‌ها یک دیسک نووبیوسین (μg5) قرار داده و ده ثانیه بهم بزنید. لوله را به مدت ۵ ساعت (یا تا زمانی که لوله کنترل کدورتی معادل ۰/۵ مک‌فارلند بیابد) انکوبه نمائید. در صورتی که کدورت هر دو لوله یکسان بود، باکتری مورد آزمایش استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس است و اگر در لوله محتوی آنتی‌بیوتیک رشدی مشاهده نشود، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس می‌باشــــــد. لازم به ذکر است که S. lugdenensis هم مقاوم به نووبیوسین می‌باشد.

اختلاف های بین باکتری های گرم مثبت و باکتری های گرم منفی

مروری بر روش‌های بیوشیمیایی برای شناسایی باکتری‌های گرم منفی

مروری بر تست‌های بیوشیمیایی برای تشخیص کوکسی‌های گرم مثبت

تست اکسیداز