آزمایش نمونه مدفوع از نظر عوامل باکتریایی
كشت و شناسایی باكتری‌های روده‌ای و خارج روده‌ای
باكتری‌های فرصت‌طلب روده‌ای اغلب به‌صورت فلور نرمال در روده‌ها وجود دارند، بنابراین می‌توان آن‌ها را از نمونه‌های دستگاه گوارش (نظیر نمونه مدفوع یا سواب ركتال) جدا كرد كه اهمیت زیادی ندارد، البته هنگامی كه ارگانیسم‌های مهاجم روده‌ای خصوصاً سالمونلا، شیگلا و یرسینیا در این نمونه‌ها وجود داشته باشند به‌عنوان عامل بیماری‌زایی محسوب می‌شوند.
جمعآوری و انتقال نمونه مدفوع
نمونه مدفوع در ظروف پلاستیكی دهان‌گشاد جمعآوری می‌گردد و باید حداكثر تا یک ساعت مورد آزمایش قرار گیرد (زیرا میكروارگانیسم‌های پاتوژن به تغییرات pH كه در اثر تجزیه‌ی تركیبات موجود در نمونه توسط فلور میکروبی نرمال حاصل می‌شود و نیز سایر تغییرات حساس می‌باشند).
اگر فاصله بین نمونه‌برداری تا انجام كشت عملا با 2 تا 3 ساعت تأخیر مواجه شود، باید نمونه را بر روی محیط‌های ترانسپورت (Transport) مانند Amies ,Stuart ,Cary & blair و Buffered glycerol-saline كشت نمود.
نکته 1: چنانچه فاصله‌ی محل نمونه‌برداری تا آزمایشگاه زیاد بود، بهتر است از محیط Cary & blair یا بافر فسفات استفاده شود.
نکته 2: برای جداسازی شیگلاها بافر فسفات بهتر از Cary& blair است.
نکته 3: چنانچه بیمار قادر به تهیه نمونه نباشد از روش سواب رکتال که نسبت به برداشت مدفوع به روش معمول ارزش كمتری دارد، استفاده می‌شود. هرچند که در این‌گونه موارد روش دیگر مانند Proctoscopy كه از درون ركتوم و بالاتر برداشت می‌گردد قابل اطمینان‌تر از روش برداشت از سواب رکتال است.
آزمایش مستقیم مدفوع
ابتدا یک لام مستقیم به طریق قطره مرطوب (Wet mount) تهیه می‌گردد و در این موارد از قسمت‌های بلغـــــم‌دار (موكوس) و حاوی خون برداشت گردیده و با سرم فیزیولوژی رقیق می‌گردد و به آن یك قطره متیلنبلو نیز اضافه می‌نمایند و همچنین یک لام جداگانه با استفاده از لوگل رقیق تهیه می‌نمایند. در این‌گونه موارد مشاهده گلبول‌های سفید (W.B.C)، حضور ارگانیسم‌های پاتوژن (به ویژه در مورد شیگلا) را مطرح می‌سازد. از روش‌های میكروسكوپ فلورسنت با آنتی‌بادی نشان‌دار نیز جهت بررسی پاتوژن مدفوعی استفاده می‌شود. اگرچه در مورد مسمومیت سالمونلایی و بعضی از اشریشیاها محدودیت وجود دارد.
نمونه‌ی مدفوع باید ظرف مدت یک ساعت کشت شود. اگر تاخیر بیشتر از 2 ساعت باشد باید از محیط کشت ترانسپورت کری بلر (Cary-Blair) استفاده شود که پاتوژن‌ها از جمله کامپیلوباکتر و ویبریو را محافظت می‌کند. محیط ترانسپورت گلیسرول بافره برای باکتری‌های فوق مناسب نیست. برای گونه‌های شیگلا که حساس هستند بهترین کار این است که مستقیما نمونه‌ای که از بیمار گرفته می‌شود کشت شود و محیط کشت هم قبلا به دمای اتاق رسیده باشد. اگر این امر امکان نداشته باشد محیط ترانسپورت که حاوی حجم مساوی گلیسرول و بافر فسفات 33./. مولار (pH=7) است به محیط کری بلر ترجیح داده می‌شود.
اگر نمونه‌ی مدفوع شل و به شکل مایع باشد تهیه‌ی یک لام مستقیم مرطوب سریع‌ترین روش برای تشخیص تروفوزوئیت‌های متحرکی از قبیل دی آنتامبا فراژیلیس، آنتامبا، ژیاردیا، و سایر پارازیت‌های روده‌ای مثل کیلوماستیکس مسنلی، آنتامبا کلی، تریکوموناس هومینیس، و اندولیماکس نانا است. و همچنین گاهی لارو کرم‌ها توسط تکنسین ماهر ممکن است دیده شود و نیز فرم‌های منعکس‌کننده‌ی نور مربوط به کریپتوسپوریدیوم و یا انواع دیگری از کیست‌ها دیده شوند.
جداسازی پاتوژن‌های روده‌ای
سالمونلا و شیگلا در طی مرحله حاد بیماری (سه روز اول) جدا می‌گردند، ازاین‌رو كشت مدفوع باید در روزهای اولیه بیماری انجام گیرد. برای كشت مدفوع باید از قسمت‌های بلغم‌دار برداشت نموده و بر روی محیط‌های مختلف كشت داده شود. به دلیل این‌که باكتری‌های كومنسال خیلی سریع رشد می‌كنند، ازاین‌رو از محیط‌های كشت اختصاصی استفاده می‌شود تا از رشدشان جلوگیری گردد. حداقل محیط‌های لازم جهت کشت مدفوع مکانگی آگار و ائوزین متیلن بلو (EMB) جهت ایزوله کردن اولیه تمام گونه‌های باسیل‌های گرم منفی روده‌ای، هكتون انتریك آگار (HE) و گزیلوز لایزین دكربوكسیلاز (XLD) برای جداسازی سالمونلاها و شیگلاها، و محیط‌های غنی مانند GN یا سلنیت F است. در مورد سلنیت F باید توجه شود که بعد از 12-8 ساعت روی محیط HE ساب‌کالچر گردد. اگر GN استفاده می‌شود، بایستی بعد از 4 ساعت روی محیط HE ساب کالچر شود. لازم به ذکر است که در بیشتر آزمایشگاه‌های کلینیکی به‌طور روتین در سلنیت F و GN کشت نمی‌دهند.
بعد از این مراحل ابتدایی، پلیت‌ها به مدت 24 تا 48 ساعت در 37 درجه سانتیگراد انكوبه می‌شوند، سپس از كلنی، رنگ‌آمیزی گرم شده و در صورت نیاز، برای جداسازی به‌صورت استریل كشت داده شده و توسط تعدادی از تست‌های بیوشیمیایی تشخیص داده می‌شوند. تست‌های بیوشیمیایی تقریباً همیشه با استفاده از كیت‌های تجارتی موجود برای تشخیص خصوصیاتی نظیر تخمیر كربوهیدرات، تجزیه سیترات، دكربوكسیلاسیون لیزین، اورنیتین و آرژینین، تولید سولفید هیدروژن، تولید ایندول از تریپتوفان، حركت، تجزیه ارتونیتروفنیل b-D گالاكتوپیرانوزید (ONPG)، تولید فنیل‌آلانین دآمیناز و فعالیت ووگس-پروسكوئر (تولید استوئین) انجام می‌شود. امروزه از تکنیک‌های پیشرفته مانند تکنیک MaldiTof جهت شناسایی و تشخیص دقیق انتروباکتریاسه‌ها استفاده می‌کنند.
جداسازی پاتوژن‌های خارج روده‌ای
خون، اگزودای زخم یا سایر نمونه‌هایی كه از محل‌هایی به غیر از دستگاه گوارش جمعآوری می‌شوند ممكن است دارای ارگانیسم‌های فرصت‌طلب روده‌ای باشند كه عامل عفونت‌های انسانی می‌شوند. این نمونه‌ها باید بر روی 2 پلیت آگار یعنی یك محیط بلادآگار و یك محیط مكانگی آگار یا EMB آگار و SS آگار كشت داده شوند. در مرحله بعد با مشاهده باسیل‌های گرم منفی، دارای واكنش کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی با انجام تست‌های بیوشیمیایی تشخیص قطعی داده می‌شود.
نکته 1: امروزه از محیط‌های نووبیوسین بریلیانت گرین گلوکز آگار (NBG) و نووبیوسین بریلیانت گرین گلیسرول لاکتوز آگار (NBGL) جهت جداسازی اولیه سالمونلا در کشت مدفوع استفاده می‌شود.
نکته 2: باكتری‌های لاكـتــوز مثبت، كلنی صورتی رنگ و باكتری‌های لاکتوز منفی، كلنی بی‌رنگ ایجاد می‌كنند.
نکته 3: باید توجه شود که محیط SS در مواردی از رشد شیگلا جلوگیری می‌كند.
نکته 4: میزان مدفوعی كه به محیط كشت افزوده می‌گردد به نسبت یک‌دهم است.
نکته 5: تمام محیط‌ها پس از 24 ساعت بررسی می‌شوند (به‌استثناء بیسموت–سولفیت آگار كه 48 ساعته مورد مطالعه قرار می‌گیرد).
نكته 6: محیط‌های XLD و هکتون انتریک آگار (HE) حاوی تیوسولفات سدیم و سیترات آمونیم فریك هستند و می‌توان روی آن‌ها تولید H2S را بررسی نمود.
نکته 7: CDC توصیه می‌کند که همه آزمایشگاه‌ها باید نمونه‌های مدفوع را از نظر حضور شیگا توکسین تیپ I و II که توسط اشریشیا کلی هموراژیک O157 و سایر سروتیپ‌ها تولید می‌شوند، مورد بررسی قرار دهند.
در مورد برخی از باکتری‌ها پس از بررسی مشخصات كلنی باكتری رشد نموده بر روی محیط کشت‌های ذکرشده و واكنش‌های ایجادشده، تشخیص احتمالی صورت می‌گیرد، مثلاً با مشاهده كلنی‌های سبز درخشان بر روی محیط EMB به E.coli مشكوك شده و یا مشاهده‌ی كلنی‌های درشت، موكوئیدی و قوام‌دار احتمال وجود باكتری كلبسیلا را افزایش می‌دهد. یرسینیا انتروکولیتیکا روی محیط (Cefsulodinirgasan-novobiocin (CIN کلنی bull’s-eyes با مرکز قرمز رنگ و حاشیه شفاف ایجاد می‌کند. داشتن حرکت موج‌وار (سوارمینگ) روی محیط بلاد آگار از ویژگی‌های پروتئوس‌ها است. سراشیا مارسیسنس کلنی‌های با پیگمان قرمز تولید می‌کند.
چنانچه بتوان با تست‌های ذکرشده، باكتری مجهول را تشخیص قطعی داد، تست تعیین حساسیت آن‌ها به آنتی‌بیوتیک‌ها را به‌عمل آورده و جواب آزمایش جهت درمان به پزشك معالج ارسال می‌گردد. در غیر این صورت به‌وسیله تست‌های سرولوژیكی با استفاده از آنتی‌سرم‌های پلی و منوكلونال علیه باكتری بدست‌آمده (در مورد E.coli، شیگلا، سالمونلا…) تشخیص قطعی صورت می‌گیرد. همچنین به‌وسیله آزمایش بر روی حیوانات حساس، بیماری‌زایی آن‌ها مسلم می‌گردد مانند EIEC و شیگلا.
| خصوصیات محیط‌های كشت انتخابی برای انتروباكتریاسه‌ها | |||||||
| محیط کشت | عامل باکتریواستاتیک علیه گرم مثبت‌ها | قند محیط | اندیکاتور محیط | تخمیرکننده‌های سریع لاکتوز | تخمیرکننده‌های آهسته لاکتوز | غیر‌تخمیرکننده‌ها | نوع |
| ائوزین متیلنبلو آگار (EMB) | ائوزین Y و متیلنبلو | لاکتوز و سوکروز* | ائوزین Y | کلنی‌های سبز-سیاه با جلای فلزی | کلنی‌های بنفش در ۲۴ تا ۴۸ ساعت | کلنی‌های شفاف | انتخابی (S)، افتراقی (D) |
| هکتون انتریک آگار (HE) | نمک‌های صفراوی | لاکتوز، سوکروز و سالیسین | برموتیمول بلو | ممانعت نسبی از رشد؛ نارنجی روشن یا کمرنگ | ممانعت نسبی از رشد؛ نارنجی روشن یا کمرنگ | سبز (شیگلا)، سبز-آبی با مرکز سیاه (سالمونلا) | انتخابی (S)، افتراقی (D) |
| مکانگی آگار (MC) | کریستال ویوله و نمک‌های صفراوی | لاکتوز | نوترال رد | کلنی‌های قرمز | کلنی‌های صورتی با هاله کهربایی | شفاف بعد از ۲۴ تا ۴۸ ساعت | انتخابی (S)، افتراقی (D) |
| گزیلوز-لیزین دی‌کربوکسیلاز (XLD) | نمک صفراوی | گزیلوز، لاکتوز و سوکروز | فنل رد | کلنی‌های زرد | کلنی زرد | کلنی‌های قرمز | انتخابی (S)، افتراقی (D) |
| سالمونلا-شیگلا آگار (SS) | نمک صفراوی | لاکتوز | نوترال رد | کلنی‌های قرمز | کلنی‌های قرمز | شفاف (شیگلا)؛ شفاف با مرکز سیاه (سالمونلا) | انتخابی (S) |
| بیسموت سولفیت (BS) |
برلیانت گرین | گلوکز | بیسموت سولفیت |
** | ** | ** | انتخابی (S) |
* در فرمولاسیون لوینز (levine’s) در محیط EMB تنها لاکتوز وجود دارد.
** سالمونلاهای تولیدکننده H2S کلنی‌های سیاه ایجاد می‌کنند. این یک محیط انتخابی برای جنس سالمونلا است.
منابع مورد استفاده:
1- دكتر رضا میرنژاد، مروری تازه بر باسیل های گرم منفی، آنتروباكتریاسه – قسمت اول. ماهنامه اخبار آزمایشگاهی. شماره 180. سال 1398
2- Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. Ellen Jo Baron., Sydney M. Finegold. 8th ed. 1990. The C. V. Mosby Company
