آزمایش هیدرولیز نشاسته: اصول، روش، نتایج
آزمایش هیدرولیز نشاسته (Starch Hydrolysis Test) یکی از انواع آزمایش‌های بیوشیمیایی کاربردی در آزمایشگاه محسوب می‌شود. این آزمایش جهت تعیین توانایی یک میکروارگانیسم در تجزیه نشاسته به مالتوز مورد استفاده قرار می‌گیرد.
در این مطلب قصد داریم به بررسی آزمایش هیدرولیز نشاسته و نتایج حاصل از آن بپردازیم.
کاربردهای آزمایش هیدرولیز نشاسته
گونه‌های باکتریایی مختلف، دارای جنس‌های مختلفی هستند که می‌توانند آمیلاز مثبت یا آمیلاز منفی باشند. به عنوان مثال باسیلوس، کلستریدیوم، کورینه باکتریوم، فوزوباکتریوم، انتروکوک، سودوموناس و استرپتوکوک دارای هر دو جنس آمیلاز مثبت و آمیلاز منفی هستند. اصلی‌ترین کاربرد آزمایش هیدرولیز نشاسته، تمایز اعضای جنس‌های مختلف یک گونه‌ی باکتریایی است.
اصول آزمایش هیدرولیز نشاسته
مولکول‌های نشاسته برای ورود به سلول باکتری بسیار بزرگ هستند. اما یکسری از باکتری‌ها برای تبديل ماکرومولکول‌ها به مولکول های ساده‌ی قابل جذب، اگزوآنزيم‌ها را ترشح می‌کنند.
از این ویژگی باکتری‌ها می‌توان برای تشخیص و تمایز آن‌ها از سایر میکروارگانیسم‌ها استفاده کرد.
باکتری‌هایی که اگزونزیم‌ها ( α -amylaseو oligo-1,6-glucosidase) ترشح می‌کنند، می‌توانند نشاسته را به زیر واحدهای کوچکتری مانند دکسترین[1]، مالتوز[2] یا گلوکز[3] هیدرولیز کنند. این مولکول‌ها به آسانی به داخل سلول باکتری منتقل می‌شوند تا در متابولیسم مورد استفاده قرار گیرند.
در آزمایش هیدرولیز نشاسته که با نام آزمایش آمیلاز (amylase test) نیز شناخته می‌شود، از محیط کشت استارچ آگار (starch agar) استفاده می‌شود. استارچ آگار یک محیط مغذی افتراقی است. ارگانیسم‌های مورد آزمایش ابتدا روی پلیت حاوی استارچ آگار تلقیح شده و سپس در دمای 30 درجه سانتی‌گراد انکوباسیون می‌شوند. مدت زمان انکوباسیون اغلب 48 ساعت است. سپس محلول ید به پلیت اضافه می‌شود.
چنانچه باکتری قادر به تولید اگزونزیم و هیدرولیز نباشد، آمیلوز موجود در آگار با ید واکنش داده و رنگ آبی را ایجاد می‌کنند. بسته به غلظت ید مصرفی، ممکن است این واکنش رنگ آبی، بنفش یا حتی سیاه ایجاد کند.
اما در صورتی که باکتری قادر به تولید اگزونزیم باشد، هنگام رشد آنزیم‌هایی را در نواحی اطراف خود ترشح می‌کند. نشاسته در اثر این آنزیم‌ها هیدرولیز می‌شود. به این ترتیب نشاسته کمتری برای واکنش با ید وجود خواهد داشت و هیچ رنگی در اطراف باکتری ایجاد نمی‌شود.
روش انجام آزمایش هیدرولیز نشاسته
پیش از انجام آزمایش هیدرولیز نشاسته، لازم است ابتدا تجهیزات و محیط کشت لازم برای این آزمایش را مهیا کنید.
مواد و تجهیزات لازم
مولر هینتون آگار (Mueller Hinton agar) نیز حاوی آمیلوز است. بنابراین جهت انجام آزمایش هیدرولیز نشاسته می‌توان از این آگار نیز استفاده کرد و از خرید محیط های اضافی اجتناب نمود.
- آگار هارت اینفیوژن با 2% نشاسته
- محلول ید که در رنگ آمیزی گرم مورد استفاده قرار می‌گیرد.
- لوپ فلزی
- دستگاه انکوباتور
آماده سازی محیط کشت
ترکیبات محیط کشت استارچ آگار جهت انجام آزمایش هیدرولیز نشاسته در جدول 1 ذکر شده است.
جدول 1. محیط کشت استارچ آگار
| ترکیب | مقدار |
| عصاره گوشت گاو | 3 گرم |
| نشاسته محلول | 10 گرم |
| آگار | 12 گرم |
| آب مقطر | 1 لیتر |
- عصاره گوشت گاو، نشاسته و آگار را با یکدیگر ترکیب کنید. مواد را روی هات پلیت قرار دهید تا به آرامی مخلوط شوند. دقت داشته باشید که مواد نباید به نقطه جوش برسند زیرا جوشیدن بیش از حد ممکن است نشاسته را هیدرولیز کند.
- محیط کشت را در دمای 121 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو کنید.
- pH نهایی محیط در دمای 25 درجه سانتی گراد باید2/0 ± 5/7 باشد.
- حدود 20 الی 30 میلی‌لیتر از محیط کشت ذوب شده را در پتری دیش‌های استریل بریزید. پیش از اینکه از محیط کشت استفاده کنید، اجازه دهید جامد شود.
محیط کشت استارچ آگار به شکل پودر خشک شده و از پیش مخلوط شده نیز به صورت تجاری موجود است. اما برای آماده سازی آن باید دستورالعمل‌های سازنده را دنبال کرد.
کنترل کیفی محیط کشت
قبل از ذخیره سازی و پیش از انجام آزمایش هیدرولیز نشاسته، محیط کشت استارچ آگار را از نظر انجماد، آلودگی، ترک و کم آبی بررسی کنید. قبل از استفاده از هر مقدار جدید نشاسته آگار، QC را انجام دهید. عملکرد آگار را با استفاده از نمونه حاوی ارگانیسم‌های زیر آزمایش کنید.
- bovis – هاله شفاف اطراف کلنی با افزودن ید (نشاسته مثبت)
- Enterococcus faecalis – رنگ آبی با افزودن ید (نشاسته منفی)
روش انجام آزمایش هیدرولیز نشاسته
جهت انجام آزمایش هیدرولیز نشاسته از کشت خالص تازه (16 تا 18 ساعته) به عنوان منبع تلقیح استفاده کنید.
یک کلنی ایزوله را به کمک سواب یا لوپ برداشته و سطح محیط کشت را به صورت رگه‌ای تلقیح کنید. یک پلیت حاوی استارچ آگار را می‌توان به چهار ربع برای چهار تلقیح مختلف تقسیم کرد. مگراینکه گونه‌ی باکتریایی متحرک باشد.
پلیت‌ها را به مدت 24 تا 48 ساعت یا بیشتر (3 تا 5 روز) در دمای 2 ± 35 درجه سانتی گراد در انکوباتور قرار دهید.
پس از انکوباسیون، محلول ید را در پلیت بریزید به طوریکه سطح آگار کاملا پوشانده شود.
نتایج را فوراً ثبت کنید زیرا رنگ آبی یا سیاه تشکیل شده ممکن است به سرعت محو شود و شما با نتایجی کاذب مواجه شوید.
بررسی نتایج آزمایش هیدرولیز نشاسته
تست مثبت (“+”): رنگ بنفش یا سیاه مشخصی در محیط کشت ظاهر می‌شود.
تست منفی (“-“): رنگ مشخص بنفش سیاه در محیط، درست تا لبه کلنی‌های آمیلاز منفی ظاهر می‌شود.
توجه داشته باشید که رنگ قرمز مایل به بنفش به دلیل هیدرولیز جزئی است و در چنین شرایطی آزمایش باید پس از انکوباسیون بیشتر تکرار شود.
جدول 2 نتایج آزمایش هیدرولیز نشاسته برای برخی از باکتری‌ها را نشان می‌دهد.
جدول 2. نتایج آزمایش هیدرولیز نشاسته
| هیدرولیز نشاسته (+ve) | هیدرولیز نشاسته (-ve) |
| Bacillus subtilis | Streptococcus agalactiae |
| Bacillus cereus | Staphylococcus epidermidis |
| Bacillus megaterium | Escherichia coli |
جمع‌بندی
آزمایشات بیوشیمیایی معمولاً برای تمایز گونه‌ها و جنس‌های مختلف یک میکروارگانیسم مورد استفاده قرار می‌گیرند.
آزمایش هیدرولیز نشاسته نیز یکی از این آزمایشات است. این تست بیوشیمیایی به محققین کمک می‌کند تا گونه‌های باکتریایی را شناسایی کنند که قادر هستند نشاسته را هیدرولیز کنند.
آزمایش هیدرولیز نشاسته اغلب برای تمایز گونه‌ها از جنس‌های خاص مانند کلستریدیوم و باسیلوس انجام می‌شود.
در طول هیدرولیز آزمایش نشاسته، ید با نشاسته واکنش داده و منجر به تشکیل رنگ بنفش یا سیاه می‌شود. اگر گونه‌ی باکتریایی قادر به هیدرولیز نشاسته باشد، این رنگ تنها تا لبه های کلنی ها امتداد یافته و در اطراف کلنی یک منطقه شفاف قابل مشاهده خواهد بود.
امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.
واژه نامه
| glucose | [3] | maltose | [2] | Dextrin | [1] |
سلام,مطلب خوبی بود اما در ابتدای مطلب در عبارت starch hydrolysis test))کلمه ی Test به اشتباه بجای کلمه Experiment استفاده شده.