تشخیص آزمایشگاهی بروسلوز
از زمان كشف بروسلاها به‌عنوان عامل بیماری تب مالت، پیشرفت‌های چندانی در روش‌های تشخیصی آزمایشگاهی بیماری صورت نگرفته است. هنوز هم روش كشت و روش‌های سرولوژیكی به‌عنوان روش‌های تشخیصی مهم محسوب می‌شوند. تصویر كلینیكی غالباً گمراه‌كننده است و بیماری ممكن است به‌صورت عفونت‌های معده و روده، دستگاه تنفس و پوست و یا دستگاه عصبی بروز كند. تشخیص احتمالی بر اساس مورفولوژی، كشت، صفات سرولوژی و در نظر گرفتن اطلاعات توأم اپیدمیولوژی-بالینی بنا نهاده شده است. بررسی سیتولوژیک خون در یک فرد مبتلا به بروسلوزیس حاد یا تحت‌حاد، نشان‌دهنده لكوپنی ملایم با یك لنفوسیتوز نسبی، گاه همراه با یك آنمی ثانویه و ترومبوسیتوپنی است. سرعت رسوب گلبول های قرمز به استثناء موارد حاد معمولاً در حد طبیعی است.
نمونه‌های ارسالی به آزمایشگاه:
نمونه ارسالی جهت شناسایی بروسلاها در نمونه‌های انسانی خون، مغز استخوان، مایع مفصلی، آسپیره غدد لنفاوی، مایع نخاعی، ادرار و غیره است.
نمونه‌ی مناسب برای تشخیص بروسلوزیس در حیوانات به نوع حیوان، گونه‌ی بروسلا و تظاهرات بالینی بستگی دارد. كشت از نمونه‌های آبسه، نطفه، جفت و مایع واژینال در حیوانات تازه سقط‌شده (قبل از مرگ آنها) بسیار مفید است. نمونه‌های شیر از گاو و گوسفند برای جداسازی ارگانیسم و بررسی‌های ایمونولوژیكی كاربرد دارد. در سگ‌ها، كشت خون به دلیل طولانی بودن دوره‌ی باكتریمی برای جداسازی بروسلا کانیس از اهمیت خاصی برخوردار است. از سرم حیوان‌ها برای آزمون‌های سرولوژیک استفاده می‌شود. در بعضی مواقع لازم است كه پس از مرگ حیوان جداسازی ارگانیسم صورت گیرد، كه در این صورت مناسب‌ترین نمونه‌ها شامل غدد پستانی فوقانی، سرینی داخلی، غدد لنفاوی گلو، پستان گاو و رحم هستند. از خوكچه‌ی هندی برای شناسایی تعداد بسیار كم بروسلا (موجود در بافت حیوانی) استفاده می‌شود. از كشت خون به‌عنوان روش عمومی در تمام حیوانات بهره‌گیری می‌گردد.
در آزمایشگاه‌های بالینی از روش‌های زیر جهت شناسایی این باکتری‌ها استفاده می‌گردد:
رنگ‌آمیزی گرم:
بروسلاها معمولاً به‌صورت کوکوباسیل و باسیل‌های کوتاه گرم منفی کوچک، منفرد و گاهی جفتی یا زنجیره کوتاه مشاهده می‌شوند (شكل 1). باید توجه داشت كه رنگ فوشین یا سافرانین بجای 30 ثانیه باید 3-1 دقیقه بر روی گستره باقی بماند. با روش کوستر، بروسلاها به رنگ قرمز در داخل سلول‌های آبی رنگ دیده می‌شوند. در این روش ابتدا از مخلوط سافرانین (2 قسمت) و پتاس (1 قسمت) که تازه تهیه شده باشد روی لام می‌ریزند و پس از یک دقیقه آن را می‌شویند. پس از شستن، چند ثانیه اسید سولفوریک یک در هزار روی آن ریخته و مجدداً می‌شویند و محلول 1% بلودومتیلن روی آن اضافه می‌نمایند و پس از 30 ثانیه می‌شویند و سپس خشک كرده و مورد بررسی قرار می‌دهند.
کشت:
استاندارد طلایی برای تشخیص بروسلوزیس، كشت خون و نمونه‌های دیگری از قبیل آسپیره‌های مغز استخوان و نمونه‌های بیوپسی است. احتمال جداسازی بروسلا ملی‌تنسیس و سوئیس نسبت به بروسلا آبورتوس در دوره‌ی حاد بیماری بیشتر است. اگر چندین نمونه در مدت 24 ساعت گرفته شود، احتمال جداسازی افزایش می‌یابد. با این وجود، رشد آرام و سخت ارگانیسم و نتایج گمراه‌کننده‌ی سیستم‌های تشخیصی بیوشیمیایی تجاری باعث محدودیت‌هایی در كشت و تشخیص فنوتیپی شده است، همچنین قرارگیری بروسلا در گروه 3 عوامل خطرساز باکتریایی محدودیت جدی برای كاركنان آزمایشگاه ایجاد می‌کند، به‌علاوه، بروسلا به‌راحتی توسط آئروسل منتقل می‌شود و دوز عفونت‌زایی بسیار پایینی دارد.
رشد بروسلاها بر روی محیط‌های معمولی بکندی صورت می‌گیرد و بیشتر گونه‌ها بر روی بلادآگار و شکلات‌آگار و نه روی مكانکی و سایر محیط‌های انتریك رشد می‌کنند، ولی برای رشد مناسب بروسلاها در كشت اولیه، محیط‌های جامد و مایع پیشنهاد می‌گردند كه عبارتند از: محیط آگاردار حاوی عصاره كبد، نوترین‌آگار، بلادآگار، تریپتوز آگار، دكستروز پوتیتو، گلیسرول پوتیتو، محیط سرم دكستروز آگار، محیط گلیسرول‌آگار، محیط بروسلا براث و آگار، محیط اصلاح‌شده فارن، محیط كشت كاستاندا، محیط اصلاح‌شده تایرمارتین به اضافه تركیبات خاص آنتی‌بیوتیكی كه جهت محیط كشت موردنیاز است. افزایش سرم حرارت داده شده اسب یا خرگوش به محیط‌های كشت یادشده بالا سبب سرعت پرورش این باكتری می‌گردد. احتمال جدا كردن بروسلا از خون بیش از 50% نیست چون نیاز تغذیه‌ای این ارگانیسم بالا و تعداد بسیار كم باكتری موجود در خون و زندگی درون سلول از جمله علل این واقعیت است. آزمایش كشت خون بیشتر از سایر نمونه‌ها جواب مثبت می‌دهد، البته لازم به ذكر است جهت كشت خون نكات متعددی باید رعایت گردد تا شانس بیشتری برای دست‌یابی به نتایج بدست آید. بهترین زمان نمونه‌گیری خون هنگامی است كه بیمار در مرحله حاد و تب دار باشد و این نمونه برای كشت مناسب‌تر و این احتمال بخصوص برای بروسلا ملی‌تنسیس و سوئیس بیشتر است. برای افزایش احتمال جداسازی بروسلا بهتر است نمونه‌گیری در 3 نوبت و در فواصل زمانی متفاوت انجام گیرد.
چندین فاکتور در رشد و تشخیص بروسلا در کشت‌های خون مؤثر هستند که باید مورد توجه قرار بگیرند:
1- سطح کم CO2 مهم‌ترین عامل محدودکننده در اکثر محیط‌های کشت است.
2- استفاده از سدیم پلی‌آنتول سولفانات به‌عنوان ضد انعقاد، اثرات زیان‌آوری را بر روی غشای خارجی گونه‌های بروسلا در بسیاری از سیستم‌های کشت خون اعمال می‌کند، به‌طوری‌که باعث نفوذ مواد آب‌دوست به درون باکتری شده و منجر به تأخیر در رشد آن می‌گردد.
لازم به ذكر است هر یك از نمونه‌های بالینی مانند مایعات بدن (ادرار، مایع نخاع، خون) و یا بافت به‌دست‌آمده از جراحی یا نكروسكوپی را می‌توان كشت داد. برای كشت خون نیازی به محیط انتخابی نیست، ولی در صورت آلودگی نمونه‌ها بهتر است از این محیط‌ها استفاده شود. چندین فرمولاسیون برای انتخابی نمودن محیط كشت جهت رشد ضروری است. مفیدترین محیط كشت انتخابی حاوی باسیتراسین، سیكلوهگزامید، نالیدیكسیك اسید، نیستاتین، پلی‌میكسین B و وانكومایسین در یك محیط پایه سرم دكستروز آگار شرح داده شده است. محیط کشت‌های مایع نیز شامل فرمولاسیون مشابه فوق با افزودن آمفوتریسین B و سیكلوسرین هستند كه برای نمونه‌های كشت از شیر آلوده بكار می‌روند. در جدول 1 محیط‌های واجد آنتی‌بیوتیک‌های انتخابی برای جداسازی بروسلاها ارائه شده است.
برای اجتناب از كشت باكتری از محیط مایع به جامد می‌توان از محیط‌های دو فازی كاستاندا استفاده كرد. در كشت اولیه، بروسلا آبورتوس و بروسلا سوئیس دارای رشد ضعیفی هستند و جهت رشد نیاز به 10–5 درصد Co2 دارند، درحالی‌كه سایر گونه‌های بروسلا قادر به رشد در هوای معمولی هستند. كشت خون از یك تا دو هفته پس از انجام كشت در محیط نگهداری می‌شود. برای دادن جواب منفی قطعی كشت بایستی حداقل سه هفته صبر كرد. باید توجه كرد در محیط آبگوشت ممکن است علیرغم رشد کدورت مشاهده نشود، لذا باید حتی در غیاب کدورت به‌طور هفتگی کشت مجدد (ساب‌کالچر) انجام شود. لازم به ذکر است كه محیط دی‌فازیک مثل کاستاندا نیاز به کشت مجدد ندارد.
بروسلا دارای سه نوع كلنی S،R و M است. در محیط كشت آگار مغذی پرگنه‌های نوع S پس از 48 ساعت قطری حدود 5 میلی‌متر دارند و حاشیه آنها صاف و پرگنه‌ها محدب و نیمه‌شفاف و دارای سطحی براق هستند (شكل 2). البته پرگنه‌ها پس از 2 تا 3 روز بعد از كشت اولیه بزرگ‌تر، با تحدب بیشتر و دارای رنگ زرد كم‌رنگ هستند. در زیر نور مستقیم كلنی‌های سویه‌های صاف همان‌طور که در شکل 2 مشاهده می‌گردد، به رنگ عسلی شفاف دیده می‌شوند، ولی در زیر نور منعکس‌شده به‌صورت نیمه شفاف آبی‌ـخاكستری دیده می‌شوند. سویه‌های غیرصاف كلنی‌هایی به‌اندازه سویه‌های صاف ایجاد می‌كنند، ولی از لحاظ رنگ كلنی متغیرند و معمولاً تیره‌تر از سویه‌های صاف با سطحی گرانولار و از رنگ سفید تا زرد و حتی قهوه‌ای دیده می‌شوند. كلنی‌های صاف، نرم‌ترند و به‌راحتی امولسیه می‌شوند، ولی كلنی‌های غیرصاف چسبناک‌تر هستند. بر روی آگار خون‌دار، همولیز واقعی نمی‌دهند، اما معمولاً رنگ قهوه‌ای تا سبز در اطراف كلنی‌ها دیده می‌شود. كلنی‌های موكوئیدی بروسلا، نیمه شفاف، سبز و یا نارنجی روشن و به حالت لایه لعابی هستند. برای افتراق كلنی‌های صاف و خشن می‌توان بر روی پلیت محلول آبی 0/05 درصد كریستال ویوله ریخت، بعد از 15 ثانیه، كلنی‌های صاف به رنگ آبی تا سبز و كلنی‌های خشن قرمز تا صورتی می‌شوند. كلنی‌های صاف، در محلول نمكی سوسپانسیون می‌شوند، ولی كلنی‌های خشن، آگلوتینه می گردند.
کلنی S بیماری‌زا بوده و ممكن است در نتیجه جهش یا موتاسیون به شكل R (غیربیماری‌زا) درآید. موتان‌های خشن بروسلا آبورتوس در انسان، گاو، گوسفند، بز، خوك و خرگوش بی‌آزارند چون در سرم این حیوانات موادی وجود دارند كه در آزمایشگاه مانع رشد اشكال خشن (نوع غیربیماری‌زا R) می‌گردند، ولی بر اشكال صاف (نوع بیماری‌زای S) میكروب بی‌تأثیرند و حیوانات مقاوم R فاقد فاكتورهای نامبرده فوق هستند. در محیط in vitro، اسید آمینه D-آلانین دارای همین خاصیت است. هنگام آماده كردن محیط‌های كشت تازه لازم است كه محیط كشت با باكتری‌های بروسلای استاندارد مورد آزمایش قرار گیرند، چون برخی از یون‌های جگر حاوی موادی هستند كه از رشد بروسلا ممانعت می‌نمایند و به‌علاوه باید مراقب سرم‌هایی كه جهت تهیه محیط‌های كشت بروسلا مورد استفاده قرار می‌گیرند، باشیم تا حاوی پادتن‌های ضد بروسلا نباشند. در محیط‌های كشت مایعی كه جهت رشد بروسلاها مورد استفاده می‌گیرند، كدر شدن محیط كشت به‌آرامی صورت می‌پذیرد و این امر با ته‌نشین شدن رسوبات گرانوله همراه است كه به‌مرور در اثر افزایش طول مدت كشت، محیط كشت حالت چسبنده پیدا می‌كند. برخی از سویه‌های بروسلا تمایل بیشتری به رشد در محیط مایع نسبت به محیط جامد دارند. در این روش تكنسین آزمایشگر با درصد بالایی در معرض آلودگی است. البته خود این مدت زمان طولانی عوارضی مانند جهش در ماده وراثتی DNA و از دست رفتن سوش موردنظر و یا آلودگی را به همراه دارد، ضمناً برای تشخیص قطعی باكتری نیاز به آزمایش‌های بیوشیمیایی، حساسیت به رنگ‌ها و استفاده از آنتی‌سرم‌های اختصاصی ضروری است.
| جدول 1- محیط‌های واجد آنتی‌بیوتیك‌‌‌‌‌های انتخابی برای جداسازی بروسلا | |||||
| Concentration of Selective in basal medium | Selective agent | ||||
| Peptone Soya broth with 5% horse serum | Serum Dextrose agar | blood agarء5% | Serum Dextrose agar | Hartleys Digest agar | |
| 50 | 25 | – | 25 | – | (Bacitracin (units/ml |
| – | – | 5 | – | 5 | (Penicillin (units/ml |
| 50 | 50 | – | – | – | (Vancomycin(µg/ml |
| – | – | 10 | – | – | (Ristocetin (µg/ml |
| 5 | 5 | 10 | 4 | (Polymyxin B(units/ml | |
| 5 | 5 | 10 | – | – | (Nalidicxic acid(µg/ml |
| – | – | 1:4000 | – | – | Cetrimide |
| 100 | 100 | 100 | – | – | (Nystatin (units/ml |
| 4 | – | – | 10 | – | (Amphotericin(µg/ml |
| 100 | 100 | 150 | 100 | 100 | (Cyclohexamide(µg/ml |
| – | – | – | – | 4 | (Gentian violet(µg/ml |
| (a Mair (1955)-b Leech et al (1961)-cRvan (1967)-d Farrll(1969)-e Brodie & intoo (1975 | |||||
نکات مهم:
- منفی بودن کشت‌ها از نظر بروسلا نشانگر عدم ابتلا به بیماری نیست، چرا که بروسلاها فقط در جریان مرحله بیماری و یا در جریان فعالیت دوباره بیماری از کشت‌ها به‌دست می‌آیند.
- این باکتری روی بلادآگار کلنی‌های شبیه استرپتوکوکوس ویریدانس ایجاد می‌کند و در محیط‌های حاوی نمک‌های صفراوی، تلوریت و سلنیت قادر به رشد نیست.
- محیط‌های مایعی که برای کشت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس استفاده می‌شوند، رشد بعضی از سویه‌های بروسلا را فراهم می‌کنند.
روش‌های شناسایی رشد سریع از قبیل Bactec9204ء،BACT/ALERT و Vital bottle سیستم‌های خودكار مدرن كشت خون هستند كه شناسایی ارگانیسم را در كمتر از 7 روز میسر كرده‌اند، اما این سیستم‌ها نیز باید با احتیاط تفسیر شوند، زیرا بعضی از این سیستم‌ها به اشتباه بروسلا را شناسایی كرده‌اند. مطالعات نشان داده است كه كشت مغز استخوان به‌طور چمشگیری نسبت به كشت خون از حساسیت بالاتری برخوردار است.
محیط انتخابی و كشت در حضور رنگ (حساسیت به رنگ‌های مختلف)
بروسلا در برابر رنگ‌زدایی محلول اسیدی و قلیائی مقاومت می‌كند و می‌توان از این مشخصه برای ایجاد روش‌های رنگ‌آمیزی افتراقی برای بررسی حضور این باكتری در بافت‌ها و مواد مورد آزمایش بهره جست. برای اولین بار برای افتراق بین بروسلا آبورتوس، ملی‌تنسیس و سوئیس بر پایه حساسیت نسبت به اثر مهاری برخی رنگ‌های سنتتیك ابداع گردیدند و تا به امروز نیز معتبر هستند. رنگ‌هایی كه در این روش مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از: تیونین، فوشین قلیائی، متیل ویوله و پیرونین كه تماماً به محیط حاوی سرم دكستروز آگار اضافه می‌گردند.
بررسی خصوصیات بیوشیمیایی:
بروسلاها هوازی اجباری هستند و دارای متابولیسم تنفسی بوده و قدرت تخمیری ندارند. کاتالاز مثبت، اکثراً اکسیداز مثبت، اوره‌آز و نیترات مثبت، VP ,MR و اندل منفی بوده و ژلاتین را ذوب نمی‌کنند. در جدول زیر الگوی فعالیت اكسیداتیو گونه‌های بروسلا برای برخی اسیدهای آمینه و کربوهیدرات‌ها نشان داده شده است.
| جدول 2- الگوی فعالیت اكسیداتیو گونه‌های بروسلا برای برخی اسیدهای آمینه و کربوهیدرات‌ها | ||||||
| Species | Amino acids | |||||
| B.Ovis | B.canis | B.neotoma | B.suis | B.abortus | B.melitensis | |
| v | v | v | v | + | + | L.Alanine |
| + | _ | + | v | + | + | L.Asparagine |
| + | + | + | v | + | + | L.Glutamate |
| _ | + | _ | + | _ | _ | L.Arginine |
| _ | + | _ | + | _ | _ | DL.Citrulline |
| _ | + | _ | v | _ | _ | L.Lysine |
| _ | + | _ | + | _ | _ | DL.Ornithine |
| Carbohydrate-test | ||||||
| _ | v | + | v | + | _ | L.Arabinose |
| _ | v | + | v | + | _ | D.Galactose |
| _ | + | v | + | + | _ | D.Ribose |
| _ | _ | _ | _ | v | _ | D.Xylose |
| _ | + | + | + | + | + | D.Glucose |
| _ | v | + | + | + | + | Isoerythritol |
تست اوره‌آز:
بروسلاها به استثناء اویس قادرند اوره را تجزیه نمایند، ولی فعالیت اوره‌آز در انواع مختلف متفاوت است. بروسلا سوئیس به سرعت در مدت 15 تا 30 دقیقه، بروسلا آبورتوس در مدت 120 دقیقه و بروسلا ملی‌تنسیس به‌طور متغیر اوره‌آز مثبت هستند. برای انجام تست، یک لوپ از میکروب را روی محیط اوره‌آگار برده و در صورتی که مثبت باشد تغییر رنگ حاصل می‌شود.
تست تولید H2S:
خاصیت تولید H2S یکی از خصوصیاتی است که برای انواع بروسلاها از یکدیگر مورد استفاده قرار می‌گیرد. بروسلا اویس، ملی‌تنسیس و کانیس H2S تولید نمی‌کنند و بروسلا آبورتوس، نئوتومه و سوئیس H2S در مدت حداقل تا 4 روز تولید می‌نمایند (جدول 3). برای انجام تست باید کاغذ مرکب خشک‌کن را در محلول استات سرب 10% فرو برده و خشک نمود و سپس آن را پس از کشت میکروب در فاصله دیواره لوله و پنبه دهانه محیط قرار داد. درصورتی‌که H2S تولید و متصاعد شود، نوار کاغذ سیاه‌رنگ می‌گردد، در غیر این صورت تغییر رنگ نمی‌دهد. با تعویض کاغذ در هر روز می‌توان متوجه شد تا چند روز H2S تولید می‌شود.
|
خصوصیات بروسلا |
بیوار | نیاز به co2 | تولید H2S | رشد روی محیط‌های حاوی | لیز توسط فاژهای | |||||
| تیونین | فوشین بازی | Td | Wb | Fi | BK2 | R/C | ||||
| بیوارهای آبورتوس | 1 | + | + | _ | + | L | L | L | L | NL |
| 2 | + | + | _ | _ | L | L | L | L | NL | |
| 3 | + | + | + | + | L | L | L | L | NL | |
| 4 | + | + | _ | + | L | L | L | L | NL | |
| 5 | _ | _ | + | + | L | L | L | L | NL | |
| 6 | _ | _ | + | + | L | L | L | L | NL | |
| 7 | _ | + | + | + | L | L | L | L | NL | |
| بیوارهای ملی‌تنسیس | 1 | _ | _ | + | + | NL | NL | NL | L | NL |
| 2 | _ | _ | + | + | NL | NL | NL | L | NL | |
| 3 | _ | _ | + | + | NL | NL | NL | L | NL | |
| بیوار سوئیس |
1 | _ | + | + | _ | NL | L | L | L | NL |
| 2 | _ | _ | + | _ | NL | L | L | L | NL | |
| 3 | _ | _ | + | + | NL | L | L | L | NL | |
| 4 | _ | _ | + | _ | NL | L | L | L | NL | |
| 5 | _ | _ | + | _ | NL | L | L | L | NL | |
| کانیس | _ | _ | + | + | NL | NL | NL | NL | L | |
| نئوتومه | _ | + | – | _ | L | L | L | L | NL | |
| اویس | + | _ | + | _ | NL | NL | NL | NL | L | |
| L: لیز کردن و NL: لیز نکردن فاژ Tb یا تی‌بی‌لیس (Tibilisi) و BK یا فاز برکلی (Berkeley)ء، Wb یا Weybridge – از غلظت رنگ تیونین 50000: 1 یا 100000: 1 و از غلظت فوشین بازی 50000: 1 در محیط‌ها استفاده می‌گردد. |
||||||||||
تست‌های سرولوژی:
به دلیل حساسیت پایین كشت (80-70 درصد) نتایج آن همیشه قطعی نیست، ضمن آنكه اگر بیماری به‌صورت تحت‌حاد یا مزمن باشد و یا اینكه دارو درمانی صورت گرفته باشد، این مقدار حساسیت پایین‌تر خواهد بود. تست‌های سرولوژیكی زمانی كه نتیجه كشت منفی است، مفید هستند. بیش از صد سال پیش آقایان رایت و اسمیت برای اولین بار، آزمون سرولوژیكی آگلوتیناسیون را برای شناسایی آنتی‌بادی‌های ضد بروسلا مورد استفاده قرار دادند. بیشتر بیماران مبتلا به بروسلوزیس حاد در عرض چند روز اول بیماری، آنتی‌بادی IgM را تولید می‌كنند كه به‌سرعت توسط IgG و به مقدار كم IgA، جایگزین می‌شود. تیتر آنتی‌بادی در هفته‌ی سوم یا چهارم بیماری به بیشترین مقدار خود می‌رسد و سپس به‌آرامی كاهش می‌یابد. عموماً در نوع تحت‌حاد و مزمن بیماری، این الگو مشاهده نمی‌شود و پاسخ سرولوژیكی همراه با تولید مداوم IgG و بعضاً IgA است. در مورد حیوانات، واکسیناسیون با سویه‌های صاف (RB51 بروسلا آبورتوس برای واكسیناسیون گاوها و Rev.1 بروسلا ملی‌تنسیس برای واكسیناسیون بزها و گوسفندها) موجب برانگیخته شدن آنتی‌بادی‌هایی می‌شود که به‌شکل پایدار در حیوان باقی مانده و تشخیص بروسلا به روش سرولوژی را دچار اختلال می‌كند. در سرم‌های مثبت، کلاس‌ها و زیر‌کلاس‌های مختلفی از آنتی‌بادی‌ها (ایزوتایپ) می‌توانند وجود داشته باشند. تفاوت آزمون‌های مختلف سرولوژی، در توانایی آنها در تشخیص ایزوتایپ‌های مختلف آنتی‌بادی‌ها است. بر حسب مرحله بیماری، آزمون خاصی را باید انجام داد.
سازمان بهداشت جهانی برای تشخیص این بیماری، پنج آزمایش سرولوژیكی استاندارد زیر را توصیه نموده است:
الف) آزمایش رز بنگال (RBT ;Rose Bengal Test)
ب) آزمایش سروآگلوتیناسیون یا رایت (SAT ;Serum Agglutination Test or Wright)
ج) آزمایش 2-مركاپتواتانول-رایت (2ME-Wright Test)
د) آزمایش ثبوت مكمل (CFT ;Complement Fixation Test)
ه) آزمایش آنتی‌گلبولین یا كومبس-رایت (Antiglobulin or Coombs-Wright)
آزمون رز بنگال یا تست كارد آزمون سریعی است كه برای غربالگری استفاده می‌شود، اما نتایج آن همیشه باید به‌وسیله‌ی تست‌های دیگری مانند SAT و یا كشت خون تأیید شود. در این آزمایش از یك محلول غلیظ از سلول‌های صاف بروسلا به‌عنوان آنتی‌ژن استفاده می‌شود كه با رز بنگال رنگ شده و در یك بافر اسیدی به صورت محلول در‌آمده است. مشكل اصلی این آزمون حساسیت و استانداردسازی آنتی‌ژن‌های مورد استفاده در آن است. به دلیل واكنش متقاطع با بعضی از ارگانیسم‌ها، نتایج مثبت كاذب غیرقابل اجتناب است.
SAT آزمونی مفید برای تشخیص بروسلوزیس انسانی است، مخصوصاً اگر با آنتی‌ژن‌های استانداردشده انجام گیرد. آنتی‌ژن‌های مورد استفاده، سلول‌های كامل بروسلا آبورتوس شسته‌شده در سالین هستند كه به دلیل كیفیت مختلف در بسته‌ها نیاز به استانداردسازی با تیترهای مشخص آنتی‌بادی دارند، اما تاکنون مشكل تعریف یك تیتر آنتی‌بادی دال بر عفونت فعال، حل‌نشده باقی مانده است. به طور كلی هر فرد پاسخ ایمنی ویژه‌ای در مواجهه با عفونت تولید می‌كند كه امكان پیش‌بینی تولید آنتی‌بادی در افراد مختلف (كه چرا بعضی از بیماران تیتر بالاتری نسبت به بعضی دیگر در طول بیماری دارند) را بسیار مشكل می‌كند. در مناطقی كه بروسلوزیس حیوانی شایع است، تیترهای ارزشمند آنتی‌بادی باید بالاتر از سایر مناطق لحاظ شود. در این شرایط ارزش آزمون SAT به‌شدت محدود می‌شود. این آزمون توانایی شناسایی آنتی‌بادی‌های غیرآگلوتینه‌كننده را ندارد و امكان نتایج منفی كاذب وجود دارد.
آزمون 2ME پس از مثبت شدن آزمون رایت (SAT) انجام می‌شود تا كلاس آنتی‌بادی تشخیص داده شود. در این آزمون، ملكول‌های IgM سرم از بین می‌رود، ولی IgG و IgA به مواد احیاكننده (در غلظتی كه استفاده می‌شود)، مقاوم هستند. مهم‌ترین كاربرد این آزمون، تشخیص افتراقی بین بروسلوزیس فعال از غیر‌فعال و بررسی تأثیر آنتی‌بیوتیك در درمان بیماری است. این آزمون حساسیت پایینی دارد.
استفاده متداول از آزمون CF به دلیل پیچیدگی تكنیكی آن و همچنین موضوع استانداردسازی آن، جز در آزمایشگاه‌های مجهز توصیه نمی‌شود. عموماً این آزمون در روزها و هفته‌های اول بیماری منفی می‌شود. واكنش‌های ضد‌كمپلمان، تغییر‌پذیری معرف‌ها، سرم همولیزشده و سلیقه‌ای بودن تفسیر آزمون در تیترهای پایین، از محدودیت‌های دیگر این روش است.
آزمون كومبس-رایت برای تشخیص آنتی‌بادی‌های غیرآگلوتینه‌كننده و یا مسدود‌كننده خصوصاً در مرحله‌ی رجعت بروسلوزیس و یا مرحله‌ی مزمن بیماری استفاده می‌شود. در مرحله‌ی مزمن و رجعت بیماری، آنتی‌بادی‌های ضد بروسلا كه قدرت آگلوتیناسیون ندارند، در سرم یافت می‌شوند. تست کومبس غیرمستقیم در موارد پیچیده بیماری بسیار حساس و اختصاصی است.
آنالیز داده‌ها نشان داده است كه روش ELISA می‌تواند جایگزین مناسبی برای آزمون‌های ذکرشده، باشد. بسیاری از محققین معتقدند كه ELISA حساس‌ترین روش سرولوژیكی در تشخیص آنتی‌بادی‌های ضد بروسلا است. با این وجود، شناسایی آنتی‌بادی به دلیل اینکه بعضاً انسان و حیوان آلوده سطح پایینی از آنتی‌بادی را تولید می‌كنند و نیز احتمال واكنش متقاطع آنتی‌بادی، همیشه رضایت‌بخش نیست. سنجش بر مبنای Dipstick كه برای اندازه‌گیری IgM در مرحله‌ی حاد بیماری استفاده می‌شود، با وجود سادگی آزمون؛ همچنان مشكل واكنش متقاطع با سایر ارگانیسم‌ها را دارد.
[BPAT[1 و [2]FPA از دیگر آزمایش‌هایی هستند كه اختصاصیت بالاتری دارند. تفسیر تیترهای پایدار در مقادیر كم یا متوسط (تیترهای 160-20) مشكل است. در بیمارانی كه به مدت طولانی در معرض ارگانیسم هستند نمی‌توان تنها به آزمایش آگلوتیناسیون اكتفا كرد. در چنین افرادی با تیترهای پایین، باید آزمون‌های ELISA و یا وسترن بلات نیز انجام گیرد. عدم وجود آنتی‌بادی‌ها، بروسلوزیس را رد نمی‌كند، موارد زیادی از بیماران با كشت خون مثبت وجود دارد كه آزمایش آنتی‌بادی‌های آنها منفی گزارش شده است. بسیاری نیز به دلیل پدیده پروزون انجام بیش از یك آزمایش سرولوژیك را پیشنهاد می‌كنند. علاوه‌بر كاستی‌های ذکرشده در روش‌های مختلف سرولوژیك و نیاز به انجام توأم چندین آزمون بر روی یك نمونه، اختصاصیت پایین، بزرگ‌ترین ایراد تشخیص بروسلوزیس بر مبنای سرولوژی است. تمام آزمون‌های مرسوم سرولوژی بر اساس شناسایی آنتی‌بادی علیه LPS سوش‌های صاف (S-LPS) پایه‌گذاری شده است كه این آنتی‌بادی‌ها در پاسخ به بعضی باكتری‌های دیگر نیز تولید می‌شوند. از این میان می‌توان به فرانسیسلا تولارنسیس، سروگروه اشریشیا کلی O157:H7، گروه N از سروتیپ‌های کافمن-وایت سالمونلا، سودوموناس، ویبریو کلرا و یرسینیا انتروکولیتیکا اشاره كرد.
نکته مهم: چنانچه تیترهای آگلوتیناسیون بروسلا بشتر از 1:160 باشد نتیجه تست مثبت است، با این حال تیترهای پائین‌تری با تست‌های SAT گزارش می‌شوند. توصیه شده است که دو تست از تست‌های بالا برای تشخیص استفاده گردند تا از اشتباه تشخیصی جلوگیری شود.
تست پوستی بورنه:
هنگامی که عصاره پروتئین بروسلا به‌صورت داخل جلدی تزریق شود، قرمزی، ادم و سفتی طی 24 ساعت در برخی از افراد آلوده ایجاد می‌گردد. هرچند كه آزمون پوستی غیرقابل‌اعتماد است و بندرت مورد استفاده قرار می‌گیرد، ولی این تست در مطالعات اپیدمیولوژیك استفاده شده و منفی شدن آن موجب حذف بروسلوزیس از تعداد كثیری از حملات مختلف می‌گردد. به‌کار بردن آزمون پوستی ممکن است باعث افزایش تیترآگلوتینین‌ها شود.
- بیماری‌زایی تجربی در حیوان: خوكچه هندی در برابر تمام سوش‌های بروسلا حساس است. هیچ‌یک از این تست‌ها قادر نیستند حیوانات حامل بیماری را از حیواناتی كه جدیداً آلوده شده‌اند، تفكیک نمایند.
- حساسیت به باكتریوفاژها: فاژهای مختلف نسبت به سویه‌های باکتریایی یک گونه ویژگی نشان می‌دهند، از این خاصیت جهت فاژتایپینگ و برای تعیین جنس و گونه بروسلا استفاده می‌شود. این فاژها را به 5 گروه مجزا تقسیم می‌كنند كه در (جدول 3) نشان داده شده‌اند.
- روش‌های مولكولی: در آزمایشگاه‌های پیشرفته از تکنیــک مولکولی PCR،PCR-RFLP ،Multiplex PCR ،Real time-PCR و غیره برای تشخیص مستقیم بروسلاها در نمونه استفاده می‌گردد.
اولین گزارش تشخیص بروسلا بر پایه PCR در سال 1990 توسط آقای Fekete منتشر شد. در این روش قسمتی از ژنوم باكتری به‌طور اختصاصی تكثیر داده شد. اختصاصیت، حساسیت بالا و امكان انجام سریع‌تر آن باعث فراگیر شدن آن در عرصه تشخیص مولكولی شده است. تشخیص بروسلا به‌وسیله PCR حساس‌تر از كشت است و خطر ابتلای كاركنان آزمایشگاه نیز در آن كمتر است و حتی قادر به تشخیص میزان كم باكتری در نمونه‌ها است و مرحله بیماری و دارودرمانی اختلالی در روند آزمایش ایجاد نمی‌كند و نسبت به روش‌های سرولوژی از اختصاصیت بالاتری برخوردار است.
با همه‌ی مزیت‌هایی كه PCR بر كشت و روش‌های سرولوژیكی دارد، مشکلات آن قابل اغماض نیست. PCR یك روش وابسته به طول قطعه تكثیر یافته است، به‌طوری‌که هرقدر طول قطعه بیشتر باشد، باند بهتری خواهیم داشت. در PCR نتایج بر اساس الکتروفورز محصولات واکنش در ژل آگارز تعیین می‌شود كه مستلزم به‌کارگیری و تماس مداوم با مواد سمی مثل اتیدیوم بروماید است و اینکه نتیجه‌ای که بر اساس الکتروفورز روی ژل آگارز به‌دست می‌آید از نظر مولکولی قطعی نیست و برای اثبات قطعیت آن باید هیبریداسیون با پروب اختصاصی به روش ساترن بلات و یا تعیین توالی محصول واکنش PCR انجام گیرد. در عین حال كه انجام این مراحل وقت‌گیر است، بهره‌گیری از آن در آزمایشگاه‌های تشخیصی نیز امکان‌پذیر نیست. PCR-ELISA با حذف استفاده از اتیدیوم بروماید و استفاده از پروب‌های بیوتینیله شده، گام جدیدی در راستای بهبود این روش برداشته است. در مقایسه با PCR معمولی، استفاده از پروب اختصاصی برای ردیابی محصول واکنش PCR منجر به حساس‌تر و اختصاصی‌تر شدن واكنش می‌شود.
بخش‌های مختلفی از ژنوم بروسلا برای شناسایی این ارگانیسم در تکنیک‌های مولکولی مورد استفاده قرار گرفته است. پس از به‌کارگیری ژن كدكننده‌ی پروتئین غشای خارجی 43 كیلودالتونی توسط آقای Fekete (كه تاكنون توالی پرایمر‌های آن منتشر نشده است)، اولین ژن هدفی كه به‌طور گسترده مورد استفاده قرار گرفت rRNA 16S بود. این توالی ژنی در Ochrobactrum anthropic نیز به دلیل قرابت ژنتیكی نزدیك آن با بروسلا، مشاهده می‌شود. PCR منطبق بر ناحیه‌ی جداكننده‌ی داخل ژنی 16S-23S rDNA به دلیل تنوعش در میان باکتری‌ها، بیشتر اختصاصی جنس هستند تا ژن 16S و در مواردی امكان سنجش گونه‌ی باكتری نیز امكان‌پذیر است. در سال 1992، bcsp31 (اولین ژن كلون‌شده‌ی بروسلا) به‌عنوان ژن جدیدی برای تشخیص جنس بروسلا مطرح شد و با دارا بودن حساسیت و اختصاصیت بالا مورد تأیید بسیاری از محققین قرار گرفت. همولوژی 85 درصدی بین ژن‌های omp2a و omp2b باعث شد با یك جفت پرایمر دو الگو در یك باكتری بروسلا داشته باشیم. دیگر ژن متداول مورد استفاده در تشخیص بر اساس PCR عنصر ژنتیكی IS711 است. در هر ژنوم باكتری بروسلا، 35-5 كپی از IS711 پراكنده است. ژن per كه آنزیم perosamine synthetase را كد می‌كند، از دیگر ژن‌های حفاظت‌شده در جنس بروسلا است كه از آن در PCR استفاده شده است. ژن gap كدكننده‌ی آنزیم گلیسرآلدئید 3-فسفات در سال 2010 توسط آقای Kim در تشخیص بروسلوزیس مورد استفاده و ارزیابی قرار گرفت.
آقای Breaker و همکارانش یک مجموعه هشت‌تایی VNTR را شناسایی کردند که در سنجشی بنام [3]HOOF-Prints استفاده می‌شوند. این‌ها نواحی ژنتیکی هدفی هستند که تنوع درون‌گونه‌ای بسیار بالایی را نشان می‌دهند و می‌توانند به‌طور وسیع جهت آنالیزهای اپیدمیولوژیکی بروسلوزیس استفاده شوند، هرچند که تعیین هویت ابتدایی باکتری باید با استفاده از PCR و تست‌های باکتریولوژیکی انجام گیرد.
Bruce-ladder روشی مبتنی بر PCR است که توانائی افتراق تمام گونه‌های بروسلا از جمله سویه‌های واکسن بروسلا آبورتوس RB51، بروسلا آبورتوس B19 و بروسلا ملی‌تنسیس Rev-1 را دارد. ایـــن روش یک Multiplex PCR با هشت جفت پرایمر است که می‌تواند در یک مرحله انجام گیرد.
تشخیص افتراقی: بروسلاها را باید از باسیل غیرتخمیری مثل بوردتلا، موراکسلا، کینگلا و اسینتوباکترها افتراق داد.
کلید تشخیصی بروسلاها: کوکوباسیل گرم منفی، کاتالاز و اکسیداز مثبت، غیرهمولیتیک، لاکتوز، گلوکز منفی، هوازی اجباری و اوره‌آز مثبت. ایجاد آگلوتیناسیون با آنتی‌سرم ضد بروسلا تشخیص را تأیید می‌نماید.
واژه‌نامه:
| Hypervariable Octameric Oligonucleotide Finger-Prints | [3] | Fluorescence polarisation assay | [2] | Buffered antigen plate agglutination test | [1] |
دکتر رضا میرنژاد، تازه هائی از بروسلاها. ماهنامه اخبار آزمایشگاهی. سال 1399. شماره 190
