تشخیص آزمایشگاهی مايكوباكتريوم ها (3): روش‌های غیر از میکروسکپی و کشت

تهیه و تنظیم: دكتر محمد قهری

یادآوری: جزئیات روش ها و تکنیک های آزمایشگاهی در “تشخیص آزمایشگاهی مايکوباکتريوم ها- بخش نخست” ذکر شده است.

جداسازی و شناسایی مايکوباکتريوم‌ها به‌وسیله روش‌های مولکولی، سرولوژی و شناسایی آنتی‌ژن:

4 کاربرد مهم برای استفاده تکنیک‌های مولکولی جهت شناسایی مايکوباکتريوم‌ها در آزمایشگاه‌های کلینیکی وجود دارد:

1- تأیید کشت با استفاده از نشانگرهای DNA

2- شناسایی مایکوباکتری‌ها از طریق سکانس کردن DNA

3- جداسازی مستقیم مايکوباکتريوم توبركلوزيس از خلط و سایر نمونه‌های کلینیکی

4- تایپینگ گونه‌های مایکوباکتری‌ها

امروزه روش PCR، در تشخیص سریع و مستقیم مايکوباکتريوم توبرکلوزیس در نمونه‌های بالینی کمک بسیاری می‌کند. حساسیت کلی آن 55 تا 90% و میزان ویژگی آن حدود 99% است. بیشترین میزان حساسیت هنگامی است که این آزمون برای نمونه‌هایی بکار رود که گستره‌های حاصل از آن‌ها حاوی باسیل‌های اسید– فست بوده‌اند. استفاده از آزمون PCR برای این امر تأیید شده است. در شکل 1  توصیه CDC جهت نحوه گزارش‌دهی تست‌های مولکولی ارائه شده است.

سریع‌ترین روش شناسایی سل ریوی استفاده از تست تکثیر اسید نوکلئیک^[1] برای ردیابی مستقیم مايکوباکتريوم توبرکلوزیس در نمونه‌های بالینی است. امروزه 3 نوع تست NAAT برای بررسی نمونه‌های تنفسی در جهان در دسترس است:

• تست مستقیم مايکوباکتريوم توبرکلوزیس تکثیرشده^[2]
• تست امپلیکور مايکوباکتريوم توبرکلوزیس^[3]
• تست Xpert MTB/RIF assay که از سال 2012 در امریکا در دسترس قرار گرفت.

سیستم BDProbtectء(BD Biosciences) تنها در ایالات متحده در دسترس است.

روش‌های XPERT و AMPLICOR توسط سازمان غذا و دارو تنها برای آزمایش نمونه‌های تنفسی که از نظر اسمیر باسیل اسیدفست مثبت هستند تأیید شده‌اند.

تست Geneprobe برای آزمایش نمونه‌های تنفسی اسمیر مثبت و اسمیر منفی مورد تأیید قرا گرفته است.

با مطالعات انجام‌گرفته، حدس بر این است که تست‌های تکثیر اسید نوکلئیک ممکن است در بیماران با اسمیر باسیل اسیدفست منفی که ریسک بالایی برای ابتلا به سل را دارند (مانند افراد آلوده به HIV، افراد زندانی در اماکن تأدیبی) مفید باشد که اجازه تشخیص خیلی سریع و شروع زودتر درمان را می‌دهد. معمولاً حساسیت تست‌های تکثیر اسید نوکلئیک برای نمونه‌های غیرتنفسی کمی پائین‌تر است، اما ممکن است برای تشخیص بعضی از موارد خارج ریوی به‌خصوص زمانی که اسمیر باسیل اسیدفست مثبت است، مفید واقع شود.

روش +Xpert MTB/RIF assay به جهت شناسایی ریفامپین دارای مزیت بیشتری است، ولی از نظر فنی و تکنیکی نسبت به سایر تست‌های تکثیر اسید نوکلئیک خواهان کمتری دارد. این روش دو جزء دارد:

1- یک کاتریج پلاستیکی حاوی بافرهای مایع پردازش نمونه و PCR و معرف‌های لئوفیلیزه Real Time PCR

2- دستگاه GeneXpert که پردازش نمونه و Real Time PCR را در یک مرحله بدون دخالت دست انجام می‌دهد.

این روش به‌طور همزمان مايکوباکتريوم توبرکلوزیس و مقاومت به ریفامپین را به‌وسیله تکثیر قطعه bpء-81 از ژن ropB مايکوباکتريوم توبرکلوزیس و متعاقباً اتصال پروب برای ردیابی جهش‌های مرتبط با مقاومت به ریفامپین شناسایی می‌کند. انواع نمونه‌های تأییدشده برای این منظور نمونه خلط تیمارنشده و رسوب خلط تغلیظ‌شده هستند. کل زمان کار با دست به ازای هر نمونه کمتر از 5 دقیقه است و نتایج در کمتر از 2 ساعت در دسترس قرار می‌گیرد. حساسیت این روش نسبت به کشت برای شناسایی مايکوباکتريوم توبرکلوزیس در نمونه‌های خلط برای موارد اسمیر مثبت بین 98 تا 100 درصد و برای اسمیرمنفی 69 تا 72 درصد است، اختصاصیت تکنیک 100 درصد است.

پروب‌های DNA کمی‌لومینانس که اجازه شناسایی تعداد کمی از گونه‌ها یا کمپلکسی از گونه‌های مايکوباکتريوم را در عرض 1 تا 2 ساعت بعد از رشد بر روی محیط‌های جامد و مایع کافی می‌دهند، موجود است. پروب‌های تجاری اختصاصی مايکوباکتریوم توبرکلوزیس، مايکوباکتريوم اویوم، مايکوباکتريوم انتراسلولار، مايکوباکتريوم گوردونه و مايکوباکتريوم کانزانسی در دسترس است. تکنیک به حداقل تجهیزات مانند لومینومتر، سونیکاتور و بلوک حرارتی نیاز دارد. معایب این روش این است که در تشخیص بعضی از ایزوله‌های مايکوباکتريوم اویوم به‌خصوص زمانی که آزمایش رشد از روی یک محیط مایع باشد ناتوان است. نتایج مثبت کاذب با پروب مايکوباکتريوم آویوم زمانی است که نمونه‌های هم‌حجم aliquots از کشت مایع انجام می‌شود و به‌ندرت نتایج مثبت کاذب با پروب مايکوباکتريوم توبرکلوزیس رخ می‌دهد.

یک تکنیک نسبتاً تازه معرفی‌شده تحت عنوان Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry است که شناسایی سریع رشد بر روی محیط جامد را فراهم می‌کند. این روش که توسط FDA تأیید نشده است، نیاز به دستگاه گرانی دارد، اما هزینه‌های معرف‌های آن برای شناسایی خیلی پائین است، علاوه‌بر این، این دستگاه می‌تواند برای شناسایی باکتری‌ها و قارچ‌ها در کنار مايکوباکتريوم‌ها مورد استفاده قرار گیرد و از نظر تکنیکی برای استفاده آسان است. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا اجازه شناسایی کلنی‌های مايکوباکتريوم‌ها بر روی محیط جامد یا رشد در محیط مایع را در طی 4-2 ساعت می‌دهد. این تکنیک در خدمات بهداشت عمومی و بعضی آزمایشگاه‌های مرجع برای سال‌های زیادی استفاده شده است، اما اخیراً به دلیل در دسترس بودن سایر تکنیک‌های خیلی دقیق و کمتر وقت‌گیر مثل هیبریداسیون معکوس (Line-probe)، محبوبیت خود را از دست داده است. آزمایش Line-probe با استفاده از کلنی‌های یک محیط جامد یا مایع از کشت مایع مثبت به‌خوبی انجام می‌شود، اگرچه آزمایش مستقیم نمونه‌های اسمیر باسیل اسیدفست مثبت امکان‌پذیر است. در آزمایش line-probe سکانس هدف در ابتدا توسط پرایمرهای بیوتینه شده با انجام PCR تکثیر می‌شوند، سپس محصول تکثیرشده بر روی یک نوار نیتروسلولز که چندین پروب بر روی آن فیکس شده‌اند، به‌کار گرفته می‌شود. خط‌ها در محل هیبریداسیون محصول–پروب شکل می‌گیرند و الگوی ایجادشده با یک کلید مقایسه شده و اجازه تفسیر نتایج و شناسایی ایزوله را می‌دهد. دقیق‌ترین روش شناسایی، تعیین توالی است که اغلب نواحی متغیر ژن ریبوزومی 16SrRNA استفاده می‌شود. روش‌های تایپینگ مولکولی مثل اسپولیگوتایپینگ برای شناسایی اعضای مايکوباکتريوم توبرکلوزیس در سطح گونه مفید هستند. این تکنیک‌ها که به لحاظ تکنیکی پیچیده هستند و نیاز به تجهیزات گران‌قیمت دارند، اغلب در زمینه تحقیقات و آزمایشگاه‌های مرجع بزرگ انجام می‌شوند.

بررسی ایمنی با استفاده از آنزیم را می‌توان برای تشخیص آنتی‌ژن‌های مایکوباکتریایی بکار برد، اما حساسیت و میزان ویژگی آن کمتر از سایر روش‌ها است. همین مشکل در استفاده از روش EIA برای تشخیص آنتی‌بادی‌های ضدآنتی‌ژن‌های مايکوباکتريوم توبرکلوزیس نیز وجود دارد. هیچ‌کدام از این ‌روش‌ها برای استفاده‌های تشخیصی عادی کافی نیستند.

• آزمایش تولید پیگمان:

اگر باکتری کندرشد باشد و پیگمان تولید نکند و یا پیگمان تولیدشده مشکوک به تأثیر از نور باشد، باید این آزمایش انجام شود:

کشت شیب‌دار جوان را که حدود 6-5 روز بیشتر از ظهور کلنی‌های آن نگذشته باشد به نحوی با کاغذ آلومینیومی بپوشانید که نیمی از کلنی‌ها پوشیده و نیمه دیگر معلوم باشد، سپس آن را به مدت یک ساعت در معرض نور یک لامپ 60-30 وات از فاصله 25 سانتی‌متری قرار دهید. در این هنگام باید درب لوله شل باشد تا تبادل هوا انجام شود. بعد از آن لوله‌ها را به انکوباتور تاریک منتقل کرده روز بعد کلنی‌های نوردیده را با کلنی‌های نورندیده مقایسه نمایید.

• واکنش‌های بیوشیمیایی:

در بین واکنش‌های بیوشیمیایی که برای شناسایی و تعیین هویت مايکوباکتريوم‌ها به‌خصوص مايکوباکتريوم توبرکلوزیس بکار می‌رود، می‌توان به تست نوترال رد، تست نیاسین، تست کاتالاز، تشکیل طناب بعد از رشد روی محیط کشت در زیر لام، حساسیت به T₂H (تیوفن)، تولید اوره‌آز، تست آریل سولفاتاز و رشد روی مکانکی اشاره کرد. در جدول زیر برخی ویژگی‌های مختلف گونه‌های مايکوباکتريوم نشان داده ‌شده است. مايکوباکتريوم توبرکلوزیس از مايکوباکتريوم بویس با اضافه کردن ماده اسید تیوفن (μg/mlء10) به محیط لوین اشتاین جانسون قابل تفکیک است. باسیل سل مقاوم و باسیل گاوی حساس است. مايکوباکتريوم‌های آتیپیک نیز مقاوم هستند.

• نشانگرهای مولکولی:

نشانگرهای مولکولی روشی سریع، حساس و اختصاصی برای تعیین هویت مايکوباکتريوم‌ها را فراهم می‌آورند. نشانگرها می‌توانند برای مايکوباکتريوم‌های رشدیافته در محیط‌های جامد یا آبگوشتی به‌کار روند. نشانگرهای DNA اختصاصی برای توالی rRNA ارگانیسم تحت آزمایش، در روش هیبریداسیون در هر سلول مایکوباکتریایی مورد استفاده قرار می‌گیرند. در هر سلول مایکوباکتریایی نزدیک به 10000 کپی از rRNA وجود دارد که یک سیستم تکثیر طبیعی را ایجاد کرده‌اند و در تشخیص کمک‌کننده هستند. هیبریدهای 2 رشته‌ای از نشانگرهای تک‌رشته‌ای هیبریدنشده جدا می‌شوند. نشانگرهای DNA به مواد شیمیایی متصل هستند که در هیبریدهای فعال‌شده، به کمک درخشش شیمیایی خود شناسایی می‌شوند.

از نشانگر (پروب) برای شناسایی مجموعة مايکوباکتريوم توبرکلوزیس (شامل M.africanum ، M.bovis و M.tuberculosis) مجموعة M.avium (شامل M.intracellulare  و M. avium و مايکوباکتريوم‌های بسیار شبیه به آن)، M. gordonae و M. kansasii استفاده می‌شود. استفاده از این نشانگرها، زمان تشخیص مايکوباکتريوم‌های مهم از نظر بالینی را از چندین هفته به یک روز تقلیل می‌دهد.

روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد زیاد (HPLC) برای شناسایی مايکوباکتريوم‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد که بر اساس مقدار اسیدمیکولیک (که از گونه‌ای به گونه دیگر متغیر است) استوار است. روش HPLC برای شناسایی مايکوباکتريوم‌ها در آزمایشگاه‌های مرجع در دسترس است.

آنتی‌بیوگرام:

به علت شیوع بالای ظهور نژادهای چند مقاومتی، باید تمام نمونه‌های مایکوباکتریم توبرکلوزیس مشکوک را حتماً از نظر حساسیت آنتی‌بیوتیکی بررسی کرد تا به یافتن درمان انتخابی کمک شود. برای ایزوله اولیه مايکوباکتريوم توبرکلوزیس از هر بیمار باید نسبت به‌تمامی داروهای خط اول تست شود. درصورتی‌که پس از گذشت 3 ماه از درمان مناسب همچنان کشت نمونه‌ها مثبت بوده یا زودتر از این زمان اگر شواهد بالینی از شکست درمان موجود باشد، تست حساسیت باید تکرار شود. تست ممکن است بر روی کلنی‌های ایزوله‌شده یا یک کشت مایع مثبت (تست غیرمستقیم) و یا بر روی نمونه‌های خلطی که اسمیر باسیل اسیدفست هستند (تست مستقیم) انجام شود. در جدول 2 داروهای توصیه‌شده برای آزمایش حساسیت دارویی مايکوباکتريوم‌ها ارائه شده است. زمانی که یک ایزوله به‌تنهایی به ریفامپین یا هرکدام از 2 داروی خط اول به‌طور همزمان مقاوم باشد، حساسیت به خط دوم داروها بایستی چک شود. ایزوله‌هایی که تنها به غلطت‌های بحرانی از ایزونیازید مقاوم باشند نیز باید نسبت به داروهای خط دوم تعیین حساسیت شوند، اگر رژیم‌درمانی برنامه‌ریزی‌شده شامل یک فلوروکینولون باشد. از تکنیک “محیط آبگوشتی رادیومتریک استاندارد شده” (BACTEC 460، BACTEC 12B) می‌توان برای سنجش حساسیت نسبت به داروهای خط مقدم درمان استفاده کرد. تکنیک متداول، پیچیده و دشوارتر متکی به agar dilution، معمولاً در آزمایشگاه‌های مرجع به‌کار می‌رود. به‌وسیلة این روش داروهای خط اول و دوم درمان را می‌توان آزمایش کرد. در جدول 3 غلظت‌های دارویی مورد استفاده جهت سنجش حساسیت با محیط کشت‌های متفاوت نشان داده ‌شده است.

با توجه به اهمیت شناسایی سریع سل مقاوم به دارو برای آزمایش کشت‌های مایع یا جامد یا نمونه‌های اسمیر مثبت به‌منظور ردیابی جهش‌های مرتبط با مقاومت مورد استفاده قرار گیرند، روش‌های مولکولی توسعه یافته است. استفاده از روش‌های مولکولی برای شناسایی مستقیم مقاومت دارویی در نمونه‌های اسمیر مثبت ممکن است در بیمارانی که سابقه درمان قبلی سل را دارند، آن‌هایی که از کشور با میزان بالای مقاومت دارویی هستند و وارد کشورمان شده‌اند و یا کسانی که نتوانند پاسخ مناسبی به درمان استاندارد داشته باشند، در نظر گرفته شود. روش‌های مولکولی مبتنی بر پروب حضور یا عدم جهش‌ها را ردیابی می‌کنند. روش‌های بر پایه تعیین توالی (مثل روش تعیین توالی سانجر و پیروسکانسینگ) توالی‌هایی از هر دو ایزوله وحشی و سویه موتانت را فراهم می‌کنند. نواحی ژنتیکی رایجی که آزمایش می‌شوند شامل نواحی مشخص مقاومت دارویی از ژن‌های embB، gyrA، پروموتورهای inhA و eis، نواحیی از KatG و rrs با جهش‌های شناخته‌شده و orf کامل ژن‌های tlyA و pncA هستند. باید به این نکته توجه داشت که بدلیل اینکه مقاومت دارویی می‌تواند توسط جهش‌های دیگری غیر از آن‌هایی که با این روش‌ها شناسایی می‌شوند، ایجاد شود. بنابراین عدم شناسایی یک جهش الزاماً به معنی حساسیت فنوتیپی نیست. همچنین به دلیل اینکه حضور جهش‌ها همیشه با مقاومت دارویی مرتبط نیستند، بنابراین شناسایی یک جهش توسط یک روش بر پایه پروب ممکن است در همه موارد مساوی با مقاومت فنوتیپی نباشد، علاوه‌بر این، از آنجایی که تمامی مکانیسم‌های مقاومت شناخته‌شده نیستند، ناتوانی در شناسایی یک جهش به‌روشنی وجود مقاومت را رد نمی‌کند، ازاین‌رو اگرچه روش‌های مولکولی اطلاعات مفیدی را به‌سرعت در اختیار ما قرار می‌دهند، اما به‌عنوان روش کمکی نه جایگزینی برای تست حساسیت دارویی فنوتیپی هستند.

تعیین حساسیت برای مايکوباکتريوم‌های غیرسلی بایستی بر روی ایزوله‌های با اهمیت بالینی انجام شود. با این حال برای بعضی گونه‌ها ارتباط کمی میان نتایج تست حساسیت برای بعضی داروها و پاسخ بالینی به درمان یافت شده است. این حالت به‌خصوص در مورد کمپلکس مايکوباکتريوم اویوم و نتایج برای اتامبوتول و ریفاماپیسین مناسب است. روش توصیه‌شده توسط CLSI جهت تست حساسیت مايکوباکتريوم‌های غیرسلی کندرشد و سریع‌الرشد، روش میکروبراث دایلوشن است.

واژه‌نامه: