تکنیک اسپرید پلیت در میکروبیولوژی
در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی، برای دست‌یابی به نتایج مناسب و دقیق، لازم است تعداد قابل شمارشی از کلنیهای یک میکروارگانیسم جدا شده و روی پلیت توزیع شوند. به این منظور از تکنیک‌های مختلفی استفاده می‌شود.
تکنیک اسپرید پلیت (Spread Plate Technique)، یکی از روش‌های متداول و پرکاربرد برای جداسازی باکتری است تا شمارش آسان‌تر شود. در این مطلب قصد داریم به بررسی تکنیک اسپرید پلیت در میکروبیولوژی بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.
کاربردهای تکنیک اسپرید پلیت
تکنیک Spread Plate معمولا با تهیه رقت‌های سریالی در آزمایشگاه ارتباط مستقیمی دارد و یک ابزار تحقیقاتی ارزشمند به شمار می‌رود. از کاربردهای مهم این تکنیک در آزمایشگاه می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
- نشان دادن ویژگی‌های یک کشت باکتریایی (مانند رنگ، بافت، اندازه، ارتفاع و غیره).
- جداسازی باکتری به صورت کلنیهای مجزا از نمونه‌ای که حاوی بیش از 1 باکتری است (از کشت مخلوط).
- تعیین حساسیت و یا مقاومت باکتری نسبت به دارو، آنتی بیوتیک یا مواد آزمایشی خاص.
- به دست آوردن رشد کافی باکتری برای آزمایش‌های مختلف بیوشیمیایی و غیره.
- تخمین تعداد باکتری‌های موجود در نمونه.
اصول تکنیک اسپرید پلیت
در روش اسپرید پلیت، از یک نمونه‌ی رقیق شده ( رقت سریالی) حاوی 2 یا چند باکتری یا میکروب (مخلوط کشت) استفاده می‌شود. این نمونه باکتریایی به کمک یک میله شیشه‌ای استریل، به شکل L (Spreader)، روی پلیت حاوی آگار جامد (به صورت یک لایه نازک) پخش می‌شود. لازم به ذکر است که حین قرار دادن نمونه روی آگار، باید پلیت را چرخاند.
در اصل، زمانی که پلیت چرخانده می‌شود، سلول‌های منفرد روی سطح محیط آگار رسوب می‌کنند. به این ترتیب برخی از سلول‌های موجود در نمونه با فاصله کافی از یکدیگر جدا می‌شوند تا به صورت کلنیهای ایزوله، رشد کرده و بررسی آن‌ها راحت‌تر صورت گیرد.
مراحل انجام تکنیک اسپرید پلیت
ابتدا از یک نمونه، یک رقت سریالی تهیه کنید.
- 0.1 میلی‌لیتر از رقت سریالی آماده شده را وسط سطح پلیت حاوی آگار بریزید.
- پخش کننده L شکل را به الکل آغشته کنید و آن را روی شعله چراغ بونزن بگیرید تا استریل شود.
- نمونه را با استفاده از پخش کننده، به طور یکنواخت روی سطح آگار پخش کنید و همزمان پتری‌دیش را با دقت بچرخانید.
- پلیت را در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت انکوباسیون کنید.
- مقدار CFU نمونه را محاسبه کنید. در میکروبیولوژی، CFU یک واحد تشکیل کلنی [1] است که برای تخمین تعداد سلول‌های زنده در یک نمونه به‌کار می‌رود. محاسبه CFU معمولا با استفاده از نرم افزارها صورت می‌گیرد.
- در نهایت، برای تعیین تعداد CFU/mL در نمونه اصلی، آن را در ضریب رقت مناسب ضرب کنید.
استفاده از تکنیک اسپرید پلیت چه مزایا و محدودیت‌هایی دارد؟
تکنیک اسپرید پلیت نیز مانند هر روش دیگری در آزمایشگاه دارای مزایا و محدودیت‌های مخصوص خود است که در این قسمت از مقاله، قصد داریم مروری بر آن‌ها داشته باشیم.
مزایا
یکی از مهم‌ترین مزایای استفاده از اسپرید پلیت برای ایزوله کردن کلنیهای باکتریایی این است که در این روش، هیچ کلنی زیرسطحی (subsurface colonies) در پلیت ظاهر نمی‌شود. بنابراین جداسازی ارگانیسم آسان خواهد بود. کلنیهای زیرسطحی، کلنیهای کوچکی هستند که در آگار رشد می‌کنند. این کلنی‌ها بر خلاف کلنیهای سطحی، ویژگی‌های شناسایی مانند لبه و در برخی موارد رنگدانه را ندارند. به همین دلیل جداسازی آن‌ها به صورت ایزوله برای آزمایشات بیشتر؛ اغلب کمی دشوار است.
همچنین در تکنیک اسپرید پلیت، میکروب‌های حساس به گرما تحت تأثیر قرار نمی‌گیرند و دقت انجام آزمایش بالاتر خواهد بود.
محدودیت‌ها
- با استفاده از تکنیک اسپرید پلیت، ارگانیسم‌های هوازی (Strict aerobes) به خوبی ایزوله شده و رشد می‌کنند اما میکروآئروفیلیک (microaerophilic) آهسته‌تر مشخص می‌شوند.
- دست‌یابی به رقت‌های سریالی ممکن است کمی دشوار باشد.
- در تکنیک اسپرید پلیت حجم‌‌های بیشتر از 0.1 میلی‌لیتر را نمی‌توان روی پلیت حاوی آگار پخش کرد زیرا ممکن است منجر به ادغام کلنی‌ها شود.
شباهت‌ها و تفاوت‌های تکنیک اسپرید پلیت با سایر روش‌های کشت
در آزمایشگاه‌ها، از تکنیک‌های مختلفی برای جداسازی و کشت میکروارگانیسم‌ها استفاده می‌شود. تکنیک‌های اسپرید پلیت (Spread Plate)، پور پلیت (Pour Plate) و استریک پلیت (Streak Plate) از رایج‌ترین روش‌های هستند. در ادامه قصد داریم به بررسی تفاوتها و شباهتهای این سه روش با یکدیگر بپردازیم.
شباهت‌ها و تفاوت‌های اسپرید پلیت و استریک پلیت
۱. شباهت‌ها
- هر دو تکنیک اسپرید پلیت و استریک پلیت، از روش‌های رایج میکروبیولوژی هستند که در باکتری‌شناسی از آن‌ها استفاده می‌شود.
- هر دو روش برای جداسازی باکتریها از کشت مخلوط مورد استفاده قرار می‌گیرند.
- در هر دو روش، می‌توانیم نمونه را قبل از تلقیح، رقیق کنیم.
- هر دو روش به پلیت آگار جامد نیاز دارند.
- در هر دو روش، باکتریها روی سطح محیط رشد می‌کنند.
- در هر دو روش، باکتری‌های هوازی در سطح محیط رشد می‌کنند.
- یک محیط استریل برای انجام هر دو تکنیک ضروری است.
۲. تفاوتها
هدف:
Streak Plate: ایزوله و خالص کردن باکتریها
Spread Plate: شمارش کلنی
ابزار:
- Streak Plate: یک لوپ یا سواب پنبه‌ای
- Spread Plate: پخش‌کننده
مقدار تلقیح:
- Streak Plate: یک لوپ از نمونه
- Spread Plate: یک میلی‌لیتر
روش:
- Streak Plate: کشیدن خطوط زیگزاگی
- Spread Plate: تلقیح به‌طور یکنواخت در سراسر سطح آگار
شباهت‌ها و تفاوت‌های اسپرید پلیت و پور پلیت
۱. شباهت‌ها
- هر دو تکنیک، از روش‌های رایج میکروبیولوژی هستند که در باکتری‌شناسی از آن‌ها استفاده می‌شود.
- هر دو روش برای جداسازی باکتری ها از کشت مخلوط مورد استفاده قرار می گیرند.
- یک محیط استریل برای انجام هر دو تکنیک ضروری است.
- در هر دوی این روش‌ها پلیت حاوی آگار مغذی نیاز است.
۲. تفاوتها
هدف:
Pour Plate: برای شمارش تعداد باکتری های تشکیل دهنده کلنی در یک نمونه
Spread Plate: برای جداسازی کلنی های کلونال خاص
اصول:
- Pour Plate: در این روش محیط سرد مایع استفاده می‌شود.
- Spread Plate: محیط کشت جامد است.
روش انجام:
- Pour Plate: آگار مذاب روی تلقیح در پتری دیش ریخته شده و به‌آرامی چرخانده می‌شود.
- Spread Plate: تلقیح توسط یک پخش کننده روی آگار جامد شده پخش می‌شود.
مقدار تلقیح:
- Pour Plate: یک میلی لیتر
- Spread Plate: یک دهم میلی لیتر
رشد کلنی:
- Pour Plate: داخل و روی محیط
- Spread Plate: فقط روی سطح محیط
جمع‌بندی
همانطور که در این مطلب خواندید، تکنیک اسپرید پلیت یکی از روش‌های رایج در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی، جهت ایزوله کردن و شمارش باکتریها است. در این مطلب سعی کردیم تا شما را با کاربردها و اصول انجام این تکنیک آشنا کنیم. اما ممکن است در ذهن خود با این پرسش مواجه شوید که تکنیک اسپرید پلیت چه تفاوت‌هایی با کشت خطی و یا کشت به روش پورپلیت دارد؟
در انتهای این مطلب سعی کردیم مروری بر تفاوتها و شباهتهای این روش‌های آزمایشگاهی با یکدیگر داشته باشیم. اما شما می‌توانید با مراجعه به سایر مقالات علمی ما، در این باره اطلاعات بیشتری کسب کنید.
امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.
واژه‌نامه
| Colony-forming unit | [1] |
