تکنیک رنگ آمیزی آلبرت

رنگ‌های خاص (Special Stains) برای شناسایی گونه‌های باکتری، تمایز مورفولوژیکی آن‌ها و حتی مشخص کردن ویژگی‌های بسیار خاص یک باکتری ایجاد شده‌ و در طول زمان دستخوش تغییرات زیادی شده‌اند. رایج‌ترین رنگ‌های خاصی که برای بررسی گونه‌های باکتریایی مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از رنگ آمیزی گرم، رنگ آمیزی اسید فاست و رنگ آمیزی اندوسپور.

رنگ آمیزی آلبرت (Albert stain) نیز از این دسته رنگ‌های خاص است که هدف از به‌کارگیری آن شناسایی باکتری‌هایی است که دارای ساختارهای خاصی به نام گرانول‌های متاکروماتیک (metachromatic granules) هستند.

 اجسام یا گرانول‌های متعددی در سیتوپلاسم باکتری وجود دارد. گرانول‌های متاکروماتیک نیز از این دسته اجسام هستند که به عنوان ظروف ذخیره عمل می‌کنند. گرانول‌های متاکروماتیک حاوی فسفات پلیمریزه شده است و ذخیره سازی فسفات معدنی را بر عهده دارند. گرانول‌های متاکروماتیک با نام دانه‌های باب ارنست یا ولوتین (Volutin) نیز شناخته می‌شوند.

هنگامی که این گرانول‌ها تنها با رنگ متیلن بلو رنگ‌آمیزی می‌شوند، برخلاف تصور، به رنگ قرمز در می‌آیند، نه رنگ آبی. به همین دلیل ممکن است این گرانول‌ها با سایر اجزای باکتری اشتباه گرفته شوند. از همین‌رو در نمونه‌های مشکوک به باکتری‌هایی که دارای گرانول‌های متاکروماتیک هستند،  از تکنیک رنگ‌آمیزی آلبرت استفاده می‌شود که در ادامه‌ی این مطلب قصد داریم به بررسی آن بپردازیم.

اهمیت تکنیک رنگ‌آمیزی آلبرت

همانطور که در قسمت مقدمه گفته شد، رنگ‌آمیزی آلبرت تکنیکی است که  به‌طور مشخص برای رنگ‌آمیزی گرانول‌های متاکروماتیکی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

این تکنیک در شناسایی کورینه باکتریوم دیفتری (Corynebacterium diphtheriae) اهمیت بسزایی دارد و به عنوان یک تکنیک افتراقی، به تشخیص کورینه باکتریوم دیفتری از سایر دیفتروئیدهای غیر بیماری زا که فاقد گرانول‌های متاکروماتیک هستند کمک می‌کند.

کورینه باکتری‌ها، باسیل‌های گرم مثبت، غیر متحرک و غیر تشکیل دهنده اسپور هستند که حاوی گرانول‌های متاکروماتیک (Volutin) می‌باشند.

شایع‌ترین کورینه باکتریوم، کورینه باکتریوم دیفتری است که باعث ایجاد بیماری دیفتری می‌شود. دیفتِری، یک بیماری حاد باکتریایی است که دستگاه تنفسی، ناوفارنکس، گلو و حتی پوست را درگیر می‌کند.

این بیماری باعث ایجاد غشایی کاذب در حلق و حنجره شده و عوارضی مانند گلودرد، تب، سرفه و گرفتگی صدا را به دنبال دارد.

این بیماری در صورت وخامت و عدم شناسایی و درمان، سبب ناراحتی‌های قلبی، کلیوی و فلج دست و پا می‌شود. به همین دلیل است که تشخص به موقع آن در نجات جان بیماران، به ویژه کودکان از اهمیت بالایی برخوردار است.

جهت شناسایی این باکتری در نمونه‌های بالینی، ابتدا نمونه در محیط کشت‌های انتخابی مانند لوفلر آگار ^[1]، تلوریت مولر – میلر آگار ^[2] یا تلوریت تینسدال آگار ^[3] کشت داده شده و سپس رنگ‌آمیزی می‌شود.

اصول تکنیک رنگ‌آمیزی آلبرت

رنگ آلبرت اساساً از دو رنگ تولویدین آبی و مالاشیت گرین (مالاکیت گرین) تشکیل شده است که هر دو رنگ‌های بازی بوده و میل ترکیبی بالایی با اجزای اسیدی بافت مانند سیتوپلاسم دارند. pH رنگ آلبرت با استفاده از اسید استیک،  تا حد 2.8 تنظیم می‌شود، زیرا pH گرانول ولوتین بسیار اسیدی است.

در تکنیک رنگ‌آمیزی آلبرت، تولویدین بلو گرانول‌های متاکروماتیکی (اسیدی ترین قسمت سلول) را رنگ می‌کند. مالاکیت گرین باعث می‌شود سیتوپلاسم به رنگ سبز آبی در بیاید. با افزودن ید، گرانول‌ها به رنگ آبی ظاهر می شوند.

مواد و محلول‌های لازم برای رنگ‌آمیزی آلبرت

به طور کلی، در رنگ‌آمیزی آلبرت از دو محلول رنگ‌آمیزی استفاده می‌شود. محلول اول، آلبرت 1 و محلول دوم به عنوان آلبرت 2 شناخته می‌شود. ترکیبات این دو محلول در ادامه ذکر شده است. توجه داشته باشید که برای استفاده از محلول‌های رنگ آمیزی آلبرت، هر یک از دو محلول باید به طور موثر با درصد اجزای مناسب آماده شوند تا پس از رنگ آمیزی، گرانول‌ها با رنگ مناسب نشان داده شوند.

محلول رنگ‌آمیزی آلبرت 1 به عنوان محلول رنگ‌آمیزی عمل می‌کند در حالی که محلول آلبرت 2 به عنوان ماده خشک کننده عمل می‌کند، یعنی یک عنصر یونی است که باعث می‌شود رنگ میکروارگانیسم بچسبد.

محلول آلبرت 1

• تولوئیدین آبی (toluidine blue)
• مالاشیت گرین (مالاکیت کرین) (malachite green)
• اسید استیک یخچالی (glacial acetic acid)
• الکل (alcohol)

نحوه آماده‌سازی 100 میلی لیتر از محلول آلبرت 1

• 1 میلی‌لیتر از اسید استیک یخچالی را به 100 میلی لیتر آب مقطر اضافه کنید.
• 2 میلی لیتر اتانول 95 درصد را به محلول اضافه کنید.
• سپس 15 گرم تولویدین بلو را در محلول حل کنید.
• در نهایت، 2 گرم مالاکیت گرین را در محلول حل کنید.

محلول آلبرت 2

• ید (Iodine )
• یدید پتاسیم در آب مقطر (Potassium iodide in water)

نحوه آماده‌سازی 100 میلی لیتر از محلول آلبرت2

• 2 گرم ید را در 50 میلی لیتر آب مقطر حل کنید.
• 250 میلی لیتر آب مقطر به محلول اضافه کنید.
• 3 گرم یدید پتاسیم را در محلول موجود حل کنید.

مراحل‌رنگ‌آمیزی آلبرت

۱. با استفاده از لوپ استریل، مقداری از نمونه‌ی کشت شده را بردارید. توجه داشته باشید که تمامی مراحل رنگ‌آمیزی باید به صورت آسپتیک صورت گیرد، به طوریکه احتمال بروز آلودگی تا حد امکان کاهش یابد.

۲. در مرکز یک لام شیشه ای تمیز و استریل، یک اسمیر ایجاد کنید.

۳. لام شیشه ای را روی سینی رنگ‌آمیزی قرار دهید.

۴. محلول رنگ آمیزی آلبرت 1 را به اسمیر اضافه کنید و بگذارید 3-5 دقیقه بماند.

۵. لام را با آب شیر که به آرامی جریان دارد بشویید.

۶. در مرحله بعدی، محلول رنگ آمیزی آلبرت 2 را روی لام بریزید و اجازه دهید 1 دقیقه بماند.

۷. لام را با آب شیر که به آرامی جریان دارد بشویید.

۸. اجازه دهید لام در دمای اتاق خشک شود.

۹. روغن ایمرسیون را روی لام ریخته و آن را زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی 1000x بررسی کنید.

بررسی نتایج

پس از رنگ آمیزی لام، در صورتی که نمونه به کورینه باکتریوم دیفتری آلوده باشد، باکتری‌های میله‌ای سبز رنگی در زیر میکروسکوپ مشاهده می‌شود. این باکتری‌ها معمولا شبیه به حرف انگلیسی “L و V” بوده و حاوی گرانول‌های متاکروماتیک آبی مایل به سیاه هستند. بقیه سلول‌های میکروبی سبز رنگ هستند.

رنگ‌آمیزی نمونه حاوی کورینه باکتریوم دیفتری با استفاده از رنگ آلبرت

جمع‌بندی

بیماری دیفتری در مرگ ‌و میر افراد زیادی، به ویژه کودکان، نقش دارد، شناسایی به موقع عامل این بیماری در حوزه تشخیصی از اهمیت بالایی برخوردار است.

همانطور که در این مطلب خواندید، رنگ‌آمیزی آلبرت یکی از تکنیک‌های افتراقی آزمایشگاهی برای تمایز گونه‌های بیماری‌زای کورینه باکتریوم دیفتری از سایر دیفتروئیدهای غیر بیماری‌زا  است که فاقد گرانول‌های متاکروماتیک هستند.

در این مطلب سعی کردیم اطلاعاتی در رابطه با تکنیک رنگ آمیزی آلبرت و کاربرد آن در شناسایی کورینه باکتریوم دیفتری ارائه کنیم.

آیا شما نیز در آزمایشگاه خود از این تکنیک استفاده کرده‌اید؟

خوشحال می‌شویم تجربیات خود را با ما به اشتراک بگذارید.

واژه نامه: