تکنیک رنگ آمیزی آلدهید فوشین برای سلو‌ل‌های بتا پانکراس

تکنیک رنگ آمیزی آلدهید فوشین^[1] یک روش استاندارد برای بررسی گرانول‌های ترشحی سلول‌های بتا پانکراس است.

سلول‌های بتا پانکراس (Pancreatic beta cells) وظیفه‌ی هموستاز گلوکز بدن را بر عهده دارند. هموستاز گلوکز به معنای حفظ تعادل انسولین و گلوکاگون است و اهمیت زیادی برای حفظ بقای انسان دارد.

اختلال عملکرد سلول‌های بتا یک عامل خطر اصلی در ابتلا به دیابت است. بنابراین، درک شبکه‌های تنظیمی سلول بتا برای روشن کردن منشاء بیماری اهمیت زیادی دارد. در این مطلب قصد داریم به بررسی تکنیک رنگ آمیزی آلدهید فوشین بپردازیم.

مروری بر سلول‌های بتا پانکراس و اهمیت آن‌ها

سلول‌های بتای پانکراس سلول‌های غدد درون ریز هستند که انسولین را سنتز، ذخیره و آزاد می‌کنند. این سلول‌ها دارای قطر متوسط ​​10 میکرومتر هستند.

 نقش کلیدی سلول‌های بتا این است که انسولین را به روشی کاملاً تنظیم شده ترشح کنند. به این ترتیب غلظت گلوکز در گردش خون در محدوده فیزیولوژیکی مناسب حفظ خواهد شد.  در صورتی که این سلول‌‌ها نتوانند به درستی کار کنند، بدن ممکن است قادر به تولید انسولین کافی برای کنترل قند خون نباشد.از همین رو، بررسی سلول‌های بتای پانکراس اهمیت زیادی در بررسی بیماری‌هایی مانند دیابت دارد.

یکی از روش‌های آزمایشگاهی که به این منظور استفاده می‌شود، تکنیک رنگ ‌آمیزی آلدهید فوشین است.

اهمیت تکنیک رنگ آمیزی آلدهید فوشین

مطالعه یا درمان دیابت همواره کار دشواری بوده است. زیرا معمولاً تا زمانی که از سلول‌های بتا پانکراس به طور قابل توجهی از بین نروند، نمی‌توان علائمی مشاهده کرد. به همین دلیل است که آزمایش‍‌های روتین، بررسی‌های آزمایشگاهی و استفاده از تکنیک‌های رنگ‌آمیزی امری مهم در تعیین علت بیماری و تشخیص به موقع آن است.

در گذشته، انواع سلول‌های پانکراس عمدتاً بر اساس واکنش‌های رنگی آن‌ها با رنگ‌های بافت شناسی شناسایی می‌شدند. در آن زمان، هویت و ساختار هورمون‌ها‌ به طور کامل قابل شناسایی نبود. در حالیکه‌ انواع سلول‌های جزایر پانکراس می‌توانند به کمک پروتکل‌های رنگ‌آمیزی از یکدیگر متمایز شوند. با گذشت زمان، روش‌های هماتوکسیلین و فلوکسین، آلدئید فوشین و روش‌های اشباع نقره جایگزین شدند و امروزه به طور عمومی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

رنگ‌آمیزی سلول‌ها برای مطالعات پاتوفیزیولوژیکی و آزمایش‌های فیزیولوژیکی و درک نقش‌های فیزیولوژیکی سلول‌ها در تنظیم گلوکز و دیابت اساسی است.

مواد و محلول‌ها

تثبیت کننده: بافر  فرمالین خنثی10%.

نمونه‌ی مورد نیاز: بافت پارافین‌گیری شده که به قطر 5 میکرومتر برش داده شده است.

۱. محلول ید لوگول (Lugol’s Iodine Solution)

• پتاسیم یدید ———————————— 4 گرم
• ید ———————————————— 2 گرم
• آب مقطر —————————————- 100 میلی‌لیتر

۲. محلول تیوسولفات سدیم 2 درصد (Sodium Thiosulfate Solution)

• تیوسولفات سدیم —————————— 2 گرم
• آب مقطر —————————————- 100 میلی‌لیتر

۳. آلدهید فوشین (Aldehyde Fuchsin)

• پاراروزانیلین(I. 42500)^[2]،  ———————- 0.5 گرم
• الکل 70% —————————————- 96 میلی‌لیتر
• اسید کلریدریک غلیظ —————————– 1 میلی‌لیتر
• پارالدهید یا استالدهید —————————-3 میلی‌لیتر

۴. محلول فست گرین 0/2 درصد (Fast Green Solution)- استوک

• فست گرین(FCF, C.I. 42053) ——————- 0.2 گرم
• آب مقطر ——————————————- 100 میلی‌لیتر
• اسید استیک گلاسیال—————————–0.2 میلی‌لیتر

نحوه آماده سازی محلول: 10 میلی‌لیتر از استوکی که به روش بالا آماده کرده‌اید را در 35 میلی‌لیتر آب مقطر حل کنید.

مراحل رنگ آمیزی آلدهید فوشین برای سلو‌ل‌های بتا پانکراس

توصیه می‌شود از کنترل اسلاید (لام کنترلی) استفاده کنید. لام کنترلی به معنای تهیه ماده‌ای است که برای ایجاد یک واکنش خاص شناخته شده است. این ماده روی یک لام شیشه‌ای فیکس می‌شود و در فرآیند کنترل کیفیت استفاده می‌گردد.

مراحل رنگ ‌آمیزی آلدهید فوشین برای سلو‌ل‌های بتا پانکراس را به صورت زیر انجام دهید:

• ابتدا بافت را پارافین زدایی و هیدراته کنید.
• لام را به مدت 5 دقیقه در محلول ید لوگول قرار دهید.
• سپس در دو نوبت آب مقطر بشویید. به این معنی که دو مرتبه لام را درون جار حاوی آب مقطر فرو ببرید.
• لام را به مدت 1 دقیقه در سدیم تیوسولفات 2 درصد قرار دهید. سپس آن را ابتدا زیر شیر آب گرفته و پس از آن در دو نوبت آب مقطر بشویید.
• لام را به مدت 30 ثانیه در الکل 70 درصد قرار دهید.
• سپس لام باید به مدت30 تا 60 دقیقه در آلدهید فوشین قرار گیرد. در صورت قدیمی بودن محلول، ممکن است زمان رنگ آمیزی طولانی‌تری لازم باشد.
• پس از گذشت این زمان، لام را در آب مقطر بشویید.
• محلول لام را به مدت 1 دقیقه درون محلول فست گرین قرار دهید. سپس در 3 نوبت آب مقطر بشویید
• مراحل دهیدراسیون را به کمک درصدهای مختلف الکل انجام دهید.

شفاف سازی به کمک زایلین را انجام داده و لام را به کمک رزین مصنوعی فیکس کنید. به این ترتیب می‌توانید بافت رنگ‌‌آمیزی شده توسط تکنیک رنگ ‌آمیزی آلدهید فوشین را زیر میکروسکوپ بررسی کنید.

نتایج رنگ آمیزی آلدهید فوشین

• سلول‌های بتا ————————————— بنفش
• بافت الاستیک ————————————– بنفش
• زمینه ———————————————— سبز

توضیحات

زمان رنگ آمیزی آلدهید فوشین بسته به سن محلول به طور قابل توجهی متفاوت است. حین استفاده از محلول تازه، 5 الی10 دقیقه رنگ‌آمیزی کافی است. اما برای رنگ آمیزی با محلول‌هایی که بیش از یک ماه قدمت دارند، 60 دقیقه یا بیشتر زمان نیاز است.

همچنین توجه داشته باشید که نگهداری محلول در دمای اتاق بهتر از نگهداری آن در یخچال است.

جمع‌بندی

یکی از روش‌های مهم برای بررسی علل بروز بیماری دیابت یا سایر بیماری‌های مرتبط با همولیز گلوکز، بررسی سلول‌های بتا پانکراس است. این کار به کمک تکنیک رنگ آمیزی آلدهید فوشین در آزمایشگاه‌ها صورت می‌گیرد. در این روش سعی کردیم به بررسی این روش رنگ آمیزی بپردازیم.

آیا تا به حال در آزمایشگاه خود از این روش استفاده کرده‌اید؟

واژه نامه: