تکنیک رنگ آمیزی کنگو رد

آمیلوئید (Amyloid) به رسوبات غیر طبیعیِ خارج سلولی و پروتئینی موجود در اندام‌ها و بافت‌ها اشاره دارد. آمیلوئید در طیف وسیعی از بیماری‌ها دیده می‌شود. این بیماری‌ها عبارتند از آلزایمر، آنسفالوپاتی‌های اسفنجی شکل و دیابت نوع II که همگی اختلالاتی پیشرونده با عوارض و مرگ‌و‌میر بالا هستند. به همین دلیل جای تعجب نیست که تحقیقات در مورد خواص فیزیکوشیمیایی آمیلوئیدها از اهمیت بالایی برخوردار باشد. در آزمایشگاه‌های پاتولوژی، جهت شناسایی و تشخیص آمیلوئیدها از تکنیک رنگ‌آمیزی کنگو رد (CONGO RED) استفاده می‌شود.

ما این مطلب قصد داریم به مرور این تکنیک پرداخته و نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی کنگو رد را بیان کنیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

مروری اجمالی بر رنگ کنگو رد

کنگو رد، برای اولین بار در سال 1883 توسط  یک شیمی دان به نام پل بوتینگر (Paul Bottinger)، کشف شد. کنگو رد (سرخ کنگو) به‌عنوان جوهر بیولوژیکی و شناساگر اسید-باز نیز کاربرد دارد که در محلول‌های بازی، سرخ و در محلول‌های اسیدی، آبی رنگ است.

کنگو رد در اثر پیوند بنزیدین‌دی‌آزو-بیس (bis-diazotized benzidine) با دو مولکول اسید ناپتیونیک (napthionic acid) سنتز می‌شود.

طی این واکنش رنگ آبی حاصل می‌شود. پس از آن طی افزودن کلرید سدیم،رنگ به دست آمده به نمک دی سدیمِ قرمز رنگ تبدیل می‌گردد. (شکل 1).

مواد و محلول‌های مورد استفاده

محلول تثبیت‌کننده: بافر فرمالین خنثی 10%

نمونه مورد استفاده: بخش‌های پارافین‌گری شده در ابعاد 6  میکرون.

۱.  هماتوکسیلین آهن Weigert اصلاح شده

• آماده‌سازی استوک محلول A :

هماتوکسیلین—————— ۱ گرم

الکل ۹۵٪  ——————۱۰۰ میلی‌لیتر

• آماده‌سازی استوک محلول B :

کلرید فریک محلول در آب( ۲۹%)——————- ۴ میلی‌لیتر

آب مقطر ——————————-  ۹۵ میلی‌لیتر

اسید هیدروکلریک غلیظ ———————— ۱ میلی‌لـیتر

قسمت‌های مساوی محلول استوک A و B را مخلوط کنید. این محلول برای ۳ ماه پایدار است و استفاده از آن بعد از گذشت ۴ ماه از زمان آماده‌سازی توصیه نمی‌شود.

۲. محلول سدیم کلرید – الکل

• سدیم کلرید ———————————————- ۲/۵ گرم
• آب مقطر ———————————————— 50 میلی لیتر
• الکل مطلق ———————————————– 50 میلی لیتر

کلرید سدیم را در آب مقطر حل کنید و سپس الکل مطلق را به آن اضافه کنید. این محلول برای چندین ماه پایدار است.

۳. پتاسیم هیدروکسید 1%

• پتاسیم هیدروکسید —————————————– ۱/۰ گرم
• آب مقطر ———————————————— ۱۰۰/۰ میلی لیتر

۴. محلول کنگو رد

• محلول سدیم کلرید الکل ————————————– 50 میلی لیتر
• قرمز کنگو (I. 22120) ————————————– ۰/۱ گرم
• پتاسیم هیدروکسید 1% —————————————-۰/۵ گرم

کنگو رد را در محلول کلرید سدیم-الکل حل کنید، سپس پتاسیم هیدروکسید را به آن اضافه کنید.

محلول نهایی را به کمک کاغذ صافی فیلتر کنید. این محلول حدود یک ماه پایدار است.

مراحل رنگ‌آمیزی کنگو رد

• نمونه بافت را پارافین‌زدایی کرده و با استفاده از آب مقطر مراحل هیدراسیون را انجام دهید.
• لام را به مدت 10 ثانیه در هماتوکسیلین آهن Weigert اصلاح شده قرار دهید.

• سپس لام را چند ثانیه زیر شیر آب نگه دارید. لام را دو مرتبه درون جار رنگ آمیزی حاوی آب مقطر فرو ببرید.
• لام را به مدت 5 ثانیه در محلول الکل اسید قرار دهید و به مدت 1 دقیقه زیر شیر آب بشویید.
• سپس آن را دو مرتبه درون جار رنگ آمیزی حاوی آب مقطر فرو ببرید.

• در مرحله بعدی، لام را به مدت 5 ثانیه در الکل 95 درصد قرار دهید.
• سپس آن را به مدت 20 دقیقه در محلول کنگو رد قرار دهید.
• در نهایت مراحل دهیدراسیون را به کمک الکل 95 درصد و الکل مطلق انجام دهید.
• مراحل شفاف سازی به کمک زایلین را انجام داده، لامل را روی لام قرار داده و نمونه را زیر میکروسکوپ بررسی کنید.

نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی کنگو رد

• آمیلوئید ——————————————— صورتی یا قرمز
• هسته ———————————————– مشکی
• گلبول‌های قرمز ————————————— نارنجی کم‌رنگ
• گرانول ائوزینوفیل ————————————– نارنجی مایل به قرمز

توضیحات

برخی موارد در روش رنگ آمیزی کنگو رد از alum hematoxylin به‌عنوان ضد رنگ (counterstain) استفاده می‌شود. این امر منجر به ایجاد یک پس زمینه ضعیف، نامطلوب و صورتی می‌شود. با استفاده از هماتوکسیلین آهن وایگرت اصلاح شده، به جای alum hematoxylin، هیچ رنگ پس زمینه‌ای ایجاد نمی‌شود.

رنگ کنگو رد در الکل 50 درصد بیشتر از الکل 80 درصد حل می‌شود. محلول غلیظ‌تر، رنگ آمیزی بهتری برای آمیلوئید ایجاد می‌کند و پایداری بسیار بیشتری دارد.

جمع‌بندی

همانطور که در این مطلب خواندید، آمیلوئیدها رسوبات غیر طبیعی هستند که در برخی بیماری‌ها مانند آلزایمر در بافت‌های بدن تجمع می‌یابند. به همین دلیل شناسایی این رسوبات از اهمیت زیادی در تشخیص بیماری‌ فرد برخوردار است. تکنیک رنگ آمیزی کنگو رد روشی برای شناسایی آمیلوئیدها است که در این مطلب به آن پرداخته شد.

شما در آزمایشگاه خود از کدام تکنیک‌های رنگ‌آمیزی استفاده می‌کنید؟

خوشحال می‌شویم نظرات و تجربیات خود را در این باره با ما به اشتراک بگذارید.