تکنیک‌های آزمایشگاهی

امروزه آزمایشگاه‌ها از روش‌های مختلفی برای آنالیز نمونه‌ها استفاده می‌کنند. این روش‌های آزمایشگاهی مبتنی بر اصول علمی و تایید شده‌ی زیست‌شناسی، شیمی و فیزیک هستند. به کمک این روش‌ها می‌توان آزمایشاتی ساده مانند بررسی کلسترول خون را انجام داد و یا به بررسی موضوعات پیچیده‌ای مانند تجزیه و تحلیل DNA و یا چگونگی رشد و عفونت‌زایی میکروارگانیسم‌ها پرداخت. بدیهی است که برخی از روش‌ها بسیار پیچیده‌تر از روش‌های دیگر هستند و ممکن است برای به کارگیری آن‌ها به تخصص‌های مختلفی نیاز باشد.

علاوه‌بر این ممکن است برای انجام یک آزمایش، چندین روش وجود داشته باشد و هر آزمایشگاه با توجه به امکانات خود، نمونه‌ را مورد بررسی قرار دهد. در نتیجه، یک آزمایش ممکن است در آزمایشگاه‌های مختلف به طور متفاوتی انجام شود. درک روشِ به کار رفته در یک آزمایش، زمینه گسترده‌تری را برای درک نتایج آزمون فراهم می‌کند.

به همین دلیل در این مقاله قصد داریم چند مورد از رایج‌ترین تکنیک‌های آزمایشگاهی که در بررسی نمونه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد را بیان کنیم.

لازم به ذکر است که هدف از نگارش این مقاله ارائه لیستی جامع در رابطه با تکنیک‌های آزمایشگاهی نیست. در واقع در این مقاله سعی کرده‌ایم تا اصول علمی مورد استفاده و مراحلی که برای دست‌یابی به نتایج آزمایشات در یک آزمایشگاه صورت می‌گیرد را مرور کنیم. در این مقاله به 4 نوع از تکنیک‌های آزمایشگاهی برای بررسی نمونه‌ها اشاره شده است که هر یک ممکن است مثال‌هایی را نیز در بر بگیرند.

پس اگر قصد دارید با تکنیک‌های رایج آزمایشگاهی آشنا شوید، در ادامه‌ی مطلب با ما همراه باشید.

1- مروری بر ایمنواسی‌ها (Immunoassays)

سیستم ایمنی هر فرد پروتئین‌هایی به نام ایمنوگلوبین تولید می‌کند که وظیفه شناسایی عوامل خارجی، اتصال به آن‌ها و از بین بردن این میکروارگانیسم‌های بیگانه را بر عهده دارند.

ایمنواسی‌ها مجموعه آزمایشاتی را در بر می‌گیرند که جهت بررسی اتصالات بین ایمونوگلوبولین (آنتی بادی) و ماده‌ی بیگانه (آنتی ژن) مورد استفاده قرار می‌گیرند. به زبان ساده‌تر، از ایمونواسی‌ها برای بررسی وجود آنتی بادی یا آنتی ژن خاص در خون و یا سایر مایعات بدن استفاده می‌شود.

1-1- تکنیک مورد استفاده در ایمنواسی‌ها چیست؟

ایمنواسی‌ها هم برای بررسی وجود آنتی‌بادی و هم برای بررسی وجود آنتی‌ژن در بدن مورد استفاده قرار می‌گیرند.

الف- بررسی آنتی‌بادی موجود در نمونه:

وقتی از ایمنواسی‌ها برای بررسی وجود آنتی بادی در نمونه خون یا سایر مایعات بدن استفاده می‌شود، آنتی ژن‌های خاص به عنوان بخشی از سیستم تشخیصی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

اگر آنتی بادی مورد آزمایش در نمونه وجود داشته باشد، با آنتی ژن موجود در سیستم آزمایش واکنش نشان داده یا به آن متصل می‌شود. در نتیجه پاسخ تست مثبت خواهد بود.

اما در صورت عدم بروز واکنش، نتیجه‌ی آزمایش منفی است.

برخی از آزمایشات ایمنواسی‌ها برای بررسی وجود آنتی بادی در بدن عبارتند از:

• بررسی فاکتور روماتوئید^[1]: در این آزمایش وجود آنتی بادی‌های خود ایمنی که ممکن است در بیماران مبتلا به آرتریت روماتوئید مشاهده شود، بررسی می‌گردد.
• ابتلا به ویروس نیل غربی^[2]: بررسی آنتی بادی‌هایی که بدن فرد در برابر ویروس نیل غربی ایجاد کرده است.
• آنتی بادی‌های ساخته شده در پاسخ به واکسیناسیون (مانند آزمایش آنتی بادی هپاتیت B): برای اطمینان از موفقیت‌آمیز بودن واکسن

ب- بررسی آنتی‌ژن موجود در نمونه:

از طرف دیگر، هنگامی که از ایمنواسی‌ها برای بررسی وجود آنتی ژن در نمونه خون یا سایر مایعات بدن استفاده می‌شود، آنتی بادی‌ها یکی از اجزای آزمایش را تشکیل می‌دهند و واکنش آنتی‌ژن موجود در نمونه‌ با آنتی بادی که در سیستم آزمایش استفاده شده است، مورد بررسی قرار خواهد گرفت.

2-1- مثال‌هایی از ایمنواسی‌ها

1-2-1- سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (^[3]ELISA)

تکنیک الایزا نوعی ایمنواسی محسوب می‌شود و برای بررسی آنتی‌ژن و یا آنتی بادی در بدن مورد استفاده قرار می‌گیرد.

همانطور که گفته شد در صورت ورود آنتی‌ژن یا عوامل بیگانه به بدن، آنتی بادی‌ها به آنتی ژن‌ها متصل می‌شوند. به این ترتیب کمپلکس‌های آنتی ژن-آنتی بادی ایجاد می‌شود. تکنیک الایزا با استفاده از این کمپلکس‌ها، به  بررسی وجود آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در بدن می‌پردازد.

خلاصه‌ای از پروسه تست الایزا

1- برای انجام تست الایزا، یک آنتی ژن شناخته شده به یک سطح جامد متصل می‌شود (معمولا درون چاهک‌های پلیت الایزا ریخته می‌شود).

2- سپس محلول حاوی نمونه‌ی بیمار به آنتی‌ژن اضافه خواهد شد. در صورتی که نمونه بیمار حاوی آنتی بادی باشد، این آنتی بادی‌ها به آنتی ژن متصل می‌شوند. (تشکیل کمپلکس‌های آنتی ژن-آنتی بادی)

3- سپس برای شناسایی کمپلکس‌های آنتی ژن-آنتی بادی، یک آنتی بادی ثانویه به چاهک اضافه خواهد شد. این آنتی بادی ثانویه به یک آنزیم متصل شده است. این آنتی بادی‌ ثانویه به آنتی بادی موجود در نمونه انسان می‌چسبد.

4- سپس پلیت در انکوباتور قرار گرفته و پس از آن شسته خواهد شد. شستن پلیت به این دلیل انجام می شود تا آنتی بادی‌های ثانویه اضافی (متصل نشده)  شسته شوند تا در نتایج اختلالی ایجاد نگردد.

5- در مرحله بعد، یک سوبسترا (Substrate) به این محیط اضافه می‌شود. سوبسترا ماده‌ای است که تحت تاثیر آنزیم تغییر می‌کند. با افزودن این ماده به محیط، آنزیم با آن واکنش داده و یک محصول رنگی تولید می‌شود.

6- در نهایت به کمک یک آنالایز، شدت و تراکم رنگ بررسی شده و میزان آنتی بادی موجود در نمونه مورد ارزیابی قرار خواهد گرفت.

2-2-1- تکنیک وسترن بلات (Western Blot)

تکنیک وسترن بلات یکی از ایمنواسی‌هایی است که جهت تشخیص پروتئین‌ها در بدن مورد استفاده قرار می‌گیرد. وسترن بلات امکان شناسایی و جداسازی یک پروتئین خاص را از میان تعداد زیادی پروتئین موجود در بدن فراهم می‌کند.

مراحل تکنیک وسترن بلات در ادامه ذکر شده‌اند (مطابق شکل 7).

1- الکتروفورز: ابتدا پروتئین‌ها با استفاده از ژل الکتروفورز جدا می‌شوند. جریان الکتریکی باعث می‌شود پروتئین‌های موجود در نمونه از نظر اندازه و شکل از هم جدا شده و باندهایی را تشکیل دهند.

2- انتقال: پروتئین‌ها به یک غشاء بلاتینگ منتقل می‌شوند. این غشاء می‌تواند از جنس نیتروسلولز^[4] یا پلی‌وینیلیدین فلورید (^[5]PVDF) باشد.

3- مسدود کردن با بافر: این کار باعث می‌شود آنتی بادی که در مراحل بعدی اضافه می‌شود به خودِ غشاء متصل نشود.

4- افزودن آنتی بادی اولیه و انکوباسیون: در این مرحله آنتی بادی اولیه به پروتئین هدف متصل می‌شود.

5- شستشو: آنتی بادی اولیه اضافی که به پروتئین متصل نشده است، شسته می‌شود.

6- افزودن آنتی‌بادی ثانویه و انکوباسیون: یک آنتی بادی ثانویه اضافه می‌شود. این آنتی بادی ثانویه به آنتی بادی اولیه متصل خواهد شد. آنتی بادی ثانویه به یک آنزیم یا ماده دیگر متصل است که امکان تشخیص پروتئین مورد نظر را که به صورت باند، فراهم می‌کند.

7- شستشو: آنتی بادی ثانویه اضافی که به آنتی بادی اولیه متصل نشده است، شسته می‌شود.

8- شناسایی پروتئین: با افزودن سوبسترای مناسب، پروتئین‌ها قابل شناسایی خواهند بود.

2- مروری بر تکنیک‌های مولکولی

پس از آشنایی با ایمنواسی‌ها و 2 مورد از رایج‌ترین انواع این آزمایشات، به سراغ تکنیک‌های مولکولی می‌رویم.

تکنیک‌های مولکولی روش‌های رایج مورد استفاده در زیست شناسی مولکولی، بیوشیمی، ژنتیک و بیوفیزیک هستند و به طور کلی به تجزیه و تحلیل DNA ،RNA، پروتئین و لیپیدها می‌پردازند که در ادامه به بررسی چند مورد از این آزمایشات خواهیم پرداخت.

1-2- مثال‌هایی ازتکنیک‌های مولکولی

1-1-2- هیبریداسیون فلورسانس درجا (^[6]FISH)

هیبریداسیون فلورسانس درجا یکی از تکنیک‌های آزمایشات مولکولی است که در آن از پروب‌های فلوئورسنت برای بررسی ژن‌ها و یا توالی DNAی موجود روی کروموزو‌ها استفاده می‌شود.

کروموزوم‌ها از DNA تشکیل شده‌اند. DNA از 2 رشته متصل به هم (به شکل مارپیچ) تشکیل شده است که هر نیمه‌ی مارپیچ مکمل دیگری است. هر رشته‌ DNA حاوی 4 باز به نام‌های آدنين، گوانين، سيتوزين و تيمين است. با تکرار توالی این 4 باز آلی هزاران ژن تولید می‌شود. این ژن‌ها تولید پروتئین را در بدن هدایت کرده و خصوصیات فیزیکی ما را تعیین می‌کنند. با استفاده از تکنیک هیبریداسیون فلورسانس درجا می‌توان به بررسی کروموزوم‌ها پرداخت.

تکنیک FISH چگونه انجام می‌شود؟

1- در تکنیک FISH ابتدا نمونه‌ای از بیمار که حاوی DNA هستند بر روی لام فیکس می‌شوند. این نمونه می‌تواند خون، مغز استخوان، مایع آمنیوتیک یا سلول‌های سرطانی باشد.

2- سپس لازم است تا رشته‌های DNAی موجود در نمونه از هم جدا یا در اصطلاح دناتوره^[7] شوند. برای این منظور لام‌ها حرارت می‌بینند.

3- سپس پروب‌های فلوئورسنت به نمونه اضافه می‌شوند. پروب‌های فلورسنت بخش‌هایی از DNA  تک‌رشته‌ای هستند که مکمل رشته‌های DNA مورد نظر آزمونگر می‌باشند.

این پروب‌ها که با رنگ فلورسنت نشانه‌گذاری شده‌اند، به رشته‌ی خاص DNA متصل می‌شوند.

4- سپس پروب‌های اضافی، شسته شده و لام زیر میکروسکوپ بررسی می‌شود. با بررسی لام زیر میکروسکوپ می‌توان مشاهده کرد که پروب‌ها به صورت سیگنال‌های فلورسنت هستند و از آنجایی که این پروب‌ها به توالی خاصی متصل هستند، می‌توان محل یک ژن خاص بر روی کروموزوم را تشخیص داد.

از تکنیک FISH می‌توان برای تشخیص اختلالات کروموزومی مانند تکثیر، حذف و یا جابه‌جایی استفاده کرد. این تکنیک در تشخیص اختلالاتی مانند سندروم داون، سرطان سینه و سرطان خون کاربرد دارد.

2-1-2- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (^[8]PCR)

 PCR یکی دیگر از تکنیک‌های آزمایشات مولکولی است که برای تهیه تعداد بسیار زیادی کپی از بخش‌های کوتاه DNAی موجود در مقدار کمی نمونه مورد استفاده قرار می‌گیرد.

این فرآیند “تقویت^[9]” DNA نامیده می‌شود و شناسایی و اندازه‌گیری ژن‌های خاصی که محققین به دنبال آن هستند را امکان‌پذیر می‌کند.

تکنیک PCR چگونه انجام می‌شود؟

تکنیک PCR به کمک ابزاری به نام ترموسایکلر در چند مرحله یا چرخه انجام می‌شود. ترموسایکلر ابزاری است که در فواصل زمانی مشخص و بسته به مراحل آزمایش، دمای نمونه را افزایش و کاهش می‌دهد.

1- اولین مرحله یا چرخه PCR با دناتوراسیون آغاز می‌شود. به این صورت که با افزایش دمای نمونه حاوی DNA مورد نظر، رشته‌های DNA از هم جدا می‌شوند.

2- پس از جدا شدن رشته‌ها، نمونه کمی خنک شده پرایمرها به نمونه اضافه می‌شوند. در این مرحله پرایمرها به تک رشته‌های DNA متصل می‌شوند. پرایمرها توالي کوتاهی از باز هستند. این مواد به طور اختصاصی براي شناسایی و اتصال به بخشي از DNA  طراحی شده‌اند که قرار است تقویت شود. پرایمرها در دو نوع  معکوس (reverse) و مستقیم (forward) ساخته می‌شوند. به این ترتیب می‌توانند به هر دو سر یک رشته از DNA متصل شوند.

3- پس از اتصال پرایمر به هر رشته‌ی DNA، یک آنزیم به نام تک پلیمراز^[10] توالی DNA را در هر سر رشته کپی می‌کند. به این ترتیب یک DNA جدید دو رشته‌ای تشکیل می‌شود که دارای یک رشته‌ی اصلی و یک رشته‌ی جدید است. به این ترتیب یک چرخه انجام شده است.

4- با اعمال مجدد گرما، رشته‌های هر یک از دو DNA جدا می‌شوند و چهار تک رشته ایجاد می‌شود. با کاهش دما و افزودن پرایمر و آنزیم تک پلیمراز، چهار DNA دو رشته‌ای تولید خواهد شد. طی 30 الی 40 چرخه، می‌توان یک میلیارد نسخه از یک بخش کوچک DNA اصلی تولید کرد.

کاربرد تکنیک PCR چیست؟

از این روش می‌توان برای شناسایی ژن‌هایی استفاده کرد که با سرطان یا اختلالات ژنتیکی مرتبط هستند. همچنین تکنیک PCR برای تشخیص توالی ژنتیکی باکتری یا ویروس‌هایی که باعث ایجاد عفونت می‌شوند نیز کاربرد دارد. به طور مثال برای انجام آزمایشات تشخیص بیماری لایم، سیاه سرفه، HPV، سوزاک و کلامیدیا از تکنیک PCR استفاده می‌شود.

4-1-2- Real Time PCR چیست؟

Real time PCR تکنیکی مشابه با تکنیک PCR است با این تفاوت که داده‌ها همزمان با تقویت DNA بررسی خواهند شد. در حقیقت در این تکنیک پروسه تقویت DNA لحظه به لحظه مانیتور می‌شود. یکی دیگر از مزایای این تکنیک این است که به کمک آن می‌توان مقدار DNA موجود در یک نمونه را اندازه‌گیری کرد.

2-1-1- RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) چیست؟

گاهی اوقات در آزمایشات PCR نمونه‌ای که باید تکثیر شود از جنس RNA است. RNA یک مولکول اسید نوکلئیک تک رشته‌ای است. برای تقویت RNA لازم است تا یک مکمل DNA از روی رشته‌ی mRNAی بالغ ساخته شود. این کار با استفاده از آنزیمی به نام Reverse Transcriptase (RT) و یک پرایمر انجام می‌شود. پرایمر به RNA تک رشته متصل می‌شود. سپس آنزیم RT رشته RNA را کپی می‌کند و یک DNA تک رشته‌ای از روی آن می‌سازد. سپس این تک رشته کپی شده و یک مولکول DNA دو رشته‌ای ساخته می‌شود. سپس مولکول 2 رشته‌ای DNA با استفاده از تکنیک PCR که در قسمت‌های قبلی توضیح داده شد، تقویت خواهد شد.

آزمایش بار ویروسی HIVء^[11] و تشخیص هپاتیت Cء^[12] از آزمایشاتی هستند که از این طریق انجام می‌شوند.

3- فلوسایتومتری^[13]

فلوسایتومتری یکی دیگر از انواع تکنیک‌های آزمایشگاهی است که برای شناسایی و شمارش سلول‌های خاصی در نمونه مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش ممکن است برای ارزیابی سلول‌های خون، مغز استخوان، تومورها و یا مایعات بدن مانند مایع مغزی نخاعی (CSF) مورد استفاده قرار گیرد.

3-1- مراحل انجام فلوسایتومتری

1- ابتدا لازم است یک سوسپانسیون از نمونه آماده شود.

2- پیش از شروع آزمایش و بسته به سلول‌های مورد تجزیه و تحلیل، نمونه را رنگ آمیزی می‌کنند. رنگ‌ها (فلوروکروم‌ها^[14]) به آنتی بادی‌های مونوکلونال متصل می‌شوند که به سلول‌های خاص یا اجزای اصلی سلول‌ها متصل می‌شوند. آنتی بادی‌های مونوکلونال هم به سلول‌های خاص یا اجزای اصلی سلول‌ها متصل می‌شوند.

3- در مرحله بعد سوسپانسیون نمونه درون دستگاهی به نام فلوسایتومتر^[15] قرار می‌گیرد. درون دستگاه فلوسایتومتر، هر یک از سلول‌های موجود در نمونه به صورت جداگانه مورد بررسی قرار می‌گیرند. این کار توسط لیزر و با سرعت بالایی انجام می‌شود (صدها تا هزار سلول در ثانیه).

4- در نهایت به کمک سیستم داخلی دستگاه و آشکارسازهایی که درون آن به کار رفته، نتایج بررسی نمونه به صورت یک نمودار بر صفحه مانتور کامپیوتر ظاهر می‌شود.

چندین دهه است که تکنیک فلوسایتومتری برای بررسی ویژگی‌های منحصر به فرد هر سلول از جمله شکل، سایز و پیچیدگی‌های داخلی سلول در دسترس قرار دارد. در ذیل برخی از آزمایشاتی که در آن‌ها از این تکنیک استفاده می‌شود، ذکر شده‌اند:

• شمارش رتیکولوسیت‌ها
• شمارش CD4
• تست HLA typing
• بررسی اسپرم
• ایمونوفنوتیپ
• آزمایشات عملکرد پلاکت
• آسپیراسیون و بیوپسی مغز استخوان
• بیوپسی غدد لنفاوی

4- توالی‌یابی DNA

همانطور که می‌دانید DNA کد ژنتیکی منحصر به فردی است که در اکثر سلول‌های انسان و همچنین موجوداتی مانند باکتری‌ها، ویروس‌ها، انگل‌ها و گیاهان وجود دارد. ساختار DNA به صورت مارپیچ متشکل از دو رشته است که در کنار هم قرار می‌گیرند. این رشته‌ها حاوی 4 باز به نام آدنین (A)، سیتوزین (C)، گوانین (G) و تیمین (T) هستند. نحوه اتصال این بازها به هم بر اساس ساختار آن‌ها است به طوری که آدنین همیشه با تیمین جفت می‌شود و گوانین نیز همیشه با سیتوزین جفت می‌شود تا یک رشته کامل تشکیل گردد. تفاوت در توالی این 3 میلیارد جفت باز در ژنوم انسان منجر به ایجاد ترکیب ژنتیکی منحصر به فرد در هر شخص می‌شود.

تعیین توالی DNA یک روش آزمایشگاهی است که برای تعیین ترتیب بازها در DNA استفاده می‌شود. این تکنیک در تشخیص و درمان بیماری‌ها کاربرد دارد و به پزشکان امکان بررسی این موضوع را می‌دهد که آیا ژن یا ناحیه‌ای که بر روی ژن تاثیر می‌گذارد، دچار جهش شده است یا خیر.

تکنیک توالی‌یابی DNA طی سال‌ها پیشرفت زیادی کرده است. اما این تکنیک به طور کلی شامل شکستن رشته‌های طولانی DNA به قطعات کوچک و استفاده از یکی از چندین نوع آزمایش برای تعیین ترتیب بازهای نوکلئوتیدی تشکیل دهنده این قطعات می‌شود.

جمع‌بندی

همانطور که در قسمت مقدمه نیز اشاره شد، تکنیک‌های مختلفی برای بررسی نمونه‌های آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می‌گیرد. بسته به نوع نمونه و هدف آزمایش ممکن است برای انجام یک تست بتوان از چندین تکنیک استفاده کرد.

به همین دلیل است که آشنایی با روش‌های آزمایشگاهی و درک روشِ به کار رفته در یک آزمایش می‌تواند تاثیر بسزایی در درک نتایج آزمون داشته باشد.

در این مقاله سعی کردیم تا چند مورد از پرکاربردترین تکنیک‌های آزمایشگاهی را به زبانی ساده توضیح دهیم. امیدواریم این مقاله مورد توجه شما قرار گرفته باشد.

اگر تجربه‌ی کار در آزمایشگاه با استفاده از هر یک از تکنیک‌های گفته شده را دارید، خوشحال می‌شویم نظرات و تجربیات خود را در این مورد با ما به اشتراک بگذارید.

واژه‌نامه: