چگونه از آلودگی کشت‌ سلول جلوگیری کنیم؟

آلودگی را می‌توان کابوسی برای محققین در هر آزمایشگاهی، به ویژه آزمایشگاه‌های کشت سلول محسوب کرد.

سلول‌‌ها در داخل بدن توسط یک سیستم ایمنی تکامل یافته و پیچیده محافظت می‌شوند. اما زمانی که این سلول‌ها از بافت بدن جدا شده و در آزمایشگاه‌ها مورد بررسی قرار می‌گیرند، احتمال آلوده شدن آن‌ها توسط میکروارگانیسم‌های مختلف به شدت افزایش می‌یابد.

به عنوان مثال، سلول‌ها ممکن است توسط مایکوپلاسما^[1] و یا قارچ آلوده شوند. از آنجایی که تشخیص برخی از این آلودگی‌ها بسیار دشوار است، عوامل آلوده‌کننده می‌توانند تاثیر قابل توجهی بر نتایج داشته باشند، بدون اینکه کاربر متوجه شود. حتی در صورتی که آلودگی ایجاد شده قابل تشخیص باشد نیز، کاربر ناچار به توقف آزمایش خواهد بود که اتلاف وقت، انرژی و سرمایه را به دنبال دارد.

با وجود اینکه امروزه برای کاهش بروز آلودگی کشت سلول، این حوزه به سمت اتوماسیون و ماشینی‌شدن پیش می‌رود، اما هنوز هم بسیاری از تکنیک‌های کشت سلول به صورت دستی انجام می‌شود که احتمال آلوده شدن کشت را، به ویژه برای افراد مبتدی، افزایش می‌دهد.

با توجه به اینکه آلودگی کشت سلول، ممکن است باعث تشخیص اشتباه شود و پیامدهای منفی زیادی را به دنبال داشته باشد، لازم است تا با استفاده از تکنیک‌های آسپتیک^[2]، از کشت‌های سلولی در آزمایشگاه محافظت کرد. ما در این مقاله تصمیم داریم تا به ذکر نکاتی بپردازیم که می‌‎توانند در کاهش خطر آلوده شدن کشت سلول تاثیر گذار باشند. پس در ادامه با ما همراه باشید.

انواع آلودگی های کشت سلولی

اولین قدم برای کاهش خطر ایجاد آلودگی کشت‌ سلول، شناخت انواع آلودگی‌هاست. به همین دلیل در ابتدای این مقاله تصمیم داریم تا شما را با این آلودگی‌ها آشنا کنیم.

به طور کلی، منابع آلودگی کشت‌های سلولی، به 2 گروه تقسیم می‌شوند. این تقسیم‌بندی بر این اساس صورت گرفته است که این عوامل تا چه حد قابل تشخیص هستند.

دسته اول که شامل اغلب باکتری‌ها و قارچ‌ها است، به راحتی قابل تشخیص هستند.

اما عواملی مانند مایکوپلاسما، ویروس‌ها و آلودگی‌های متقاطعی که توسط سایر سلول‌ها ایجاد می‌شوند، در دسته‌ی دوم جای گرفته و تشخیص آن‌ها به مراتب دشوارتر از گروه اول است. بنابراین ارگانیسم‌های دسته دوم را می‌توان یک مشکل جدی‌تر برای محققین محسوب کرد. در ادامه به تفکیک این عوامل را مرور خواهیم کرد.

1- باکتری‌ها

باکتری‌ها ارگانیسم‌هایی هستند که به وفور در محیط یافت می‌شوند و می‌توانند به سرعت وارد محیط کشت شده و آن را آلوده کنند. اندازه کوچک و سرعت رشد سریع این ارگانیسم‌ها، آن‌ها را به یکی از اصلی‌ترین علل آلودگی محیط کشت تبدیل کرده است.

• تشخیص ماکروسکوپی باکتری‌ها

شناسایی باکتری‌ها، درصورت عدم وجود آنتی‌بیوتیک در محیط کشت، طی چند روز پس از بروز آلودگی به راحتی امکان‌پذیر است. تاثیر سوء باکتری بر محیط کشت به راحتی با چشم غیر مسلح و یا با استفاده از میکروسکوپ نوری امکان‌پذیر است. این تاثیر از طریق تغییر pH، کدر شدن کشت و مرگ سلول‌ها قابل تشخیص است.

• تشخیص میکروسکوپی باکتری‌ها

باکتری‌ها ارگانیسم‌های کوچکی هستند که در زیر میکروسکوپ به صورت ساختارهای میله مانند، کره یا مارپیچ ظاهر می‌شوند و ممکن است به صورت تک سلول، جفت، زنجیره‌ای یا خوشه‌ای دیده شوند. وجود باکتری در محیط کشت را می‌توان با استفاده از روش فاز کنتراست (phase contrast) و بزرگنمایی 100x-400x بررسی کرد. روش فاز کنتراست، به ویژه هنگامی که سطح آلودگی باکتریایی کم باشد، تشخیص را راحت‌تر می‌کند.

• توجه داشته باشید که باکتری‌ها حرکت می‌کنند

برخی از باکتری‌ها حرکت فعال دارند. این موضوع ممکن است باعث شود تا کاربر باکتری را به عنوان بقایای سلول (cell debris) در نظر گیرد. اما باید توجه داشت که بقایای سلول در سطح محیط کشت می‌لغزند و تنها در همان محدوده‌ای که قرار دارند کمی جابه‌جا می‌شوند. اما باکتری‌هایی که حرکت فعال دارند، به تدریج کاملا از موقعیت مکانی که در آن بودند، دور می‌شوند.

2- قارچ و کپک

قارچ‌ها (Fungi) و کپک‌ها (mold) می‌توانند به صورت کلنی‌های کوچک خاکستری، سفید یا سبز بر روی محیط کشت ظاهر شوند.

• تشخیص ماکروسکوپی قارچ و کپک

قارچ‌ها نیز اغلب باعث کدر و تیره شدن محیط کشت و همچنین ایجاد میسلیوم (mycelium) و توده‌های قارچی (furry clumps) بر روی محیط کشت می‌شوند. گاهی اوقات آلودگی قارچی باعث افزایش pH محیط می‌شود و در نتیجه محیط حاوی فنولِ قرمز به رنگ صورتی تغییر می‌کند.

• تشخیص میکروسکوپی قارچ

در آلودگی‌های قارچی، ابتدا هاگ‌ها به درون ظرف حاوی محیط کشت نفوذ می‌کنند و سپس شروع به رشد کرده و هیف‌ها (hyphae) را تشکیل می‌دهند. به طور کلی تشخیص میکروسکوپی قارچ‌هایی که در ته ظرف کشت قرار دارند، راحت‌تر از قارچ‌هایی است که در سطح محیط شناور هستند.

3- مخمرها

مخمرها (Yeasts) میکروارگانیسم‌های تک سلولی هستند که اندازه آن‌ها تا حدود 40 میکرومتر متغیر است و یکی دیگر از عوامل آلودگی کشت سلولی محسوب می‌شوند.

• تشخیص ماکروسکوپی مخمرها

محیط‌های کشت آلوده به مخمرها اغلب حالت ابری (Cloudy) داشته و کدر می‌شوند. اما تشخیص این نوع آلودگی کشت سلول در مراحل اولیه و تا زمانی که میزان آلودگی گسترش نیافته، دشوار است.

• تشخیص میکروسکوپی مخمرها

مخمرها را نیز می‌توان با استفاده از روش فاز کنتراست (phase contrast) و بزرگنمایی 100x-400x بررسی کرد. این ارگانیسم‌ها به صورت ذرات روشن و شبیه به تخم مرغ هستند و ممکن است به صورت تک سلول، زنجیره‌ای یا شاخه‌ای مشاهده شوند.

4- مایکوپلاسما

همانطور که گفته شد، مایکوپلاسما از عواملی است که تشخیص آن دشوار است و به همین دلیل یکی از جدی‌ترین منابع آلودگی محیط‌های کشت محسوب می‌شود.

اما چرا تشخیص مایکوپلاسما تا این حد دشوار است؟

در پاسخ به این سوال باید ابتدا مروری بر ساختار و ویژگی‌های مایکوپلاسما داشته باشیم.

اگرچه مایکوپلاسما از نظر فنی یک باکتری است، اما دارای ویژگی‌های خاصی است که آن را منحصر به فرد می‌کند. مایکوپلاسماها نسبت به سایر باکتری‌ها بسیار کوچک‌تر هستند (0/15 تا 0/3 میکرومتر). بنابراین می‌توانند بدون ایجاد علائم قابل مشاهده، تا حد زیادی رشد کنند. همچنین این ارگانیسم‌ها فاقد دیواره سلولی هستند و از آنجایی که اغلب آنتی بیوتیک‌ها دیواره سلول‌های باکتریایی را هدف قرار می‌دهد، مایکوپلاسما نسبت به آن‌ها مقاوم است.

وجود مایکوپلاسما در کشت‌های سلولی بسیار مضر است زیرا بر متابولیسم و مورفولوژی سلول‌های میزبان تأثیر می‌گذارد، باعث انحراف و آسیب کروموزومی می‌شود و می‌تواند پاسخ سیتوپاتیک را تحریک کند. به این ترتیب داده‌های به دست آمده از کشت سلول قابل اطمینان نخواهند بود.

• تشخیص ماکروسکوپی مایکوپلاسما

تشخیص آلودگی مایکوپلاسما از طریق مشاهدات ماکروسکوپی امکان‌پذیر نیست.

• تشخیص میکروسکوپی مایکوپلاسما

همانطور که گفته شد، قطر مایکوپلاسما فقط در حدود 0/3-0/1 میکرومتر است، بنابراین تشخیص آن از طریق میکروسکوپ نوری اغلب امکان‌پذیر نیست. جدول 1 مروری بر روش‌های شناسایی مایکوپلاسما و مزایا و معایب هر یک دارد.

لازم به ذکر است که انتخاب هریک از این روش‌های، به عواملی وابسته است. به طور مثال:

• چه تجهیزاتی در دسترس دارید. (ترموسایکلر، میکروسکوپ فلورسانس و …)
• چه تعداد نمونه باید همزمان آزمایش شوند.
• چقدر سریع به نتایج نیاز دارید.

5- ویروس

تشخیص ویروس‌ها در محیط کشت نیز مانند مایکوپلاسما آسان نیست. داروهای ضد ویروسی می‌توانند تا حد زیای برای کشت سلول سمی و مضر باشند. این موضوع یکی دیگر از مسائلی که ویروس‌ها را به عوامل آلودگی کشت سلول تبدیل می‌کند. نگرانی عمده برای آلودگی ویروسی، پتانسیل آ‌ن‌ها برای آلوده کردن کارکنان آزمایشگاه است. به همین دلیل تشخیص این نوع آلودگی برای افرادی که در آزمایشگاه‌های کشت سلول فعالیت دارند، اهمیت زیادی خواهد داشت.

6- آلودگی متقاطع

یکی دیگر از انواع آلودگی کشت‌ سلولی، آلودگی متقاطع است. به این معنی که یک رده سلولی^[4] به وسیله یک رده سلولی دیگر آلوده می‌شود.

این مشکل زمانی بروز می‌کند که نوعی سلول خارجی با شرایط محیط کشت سازگار شود. به این ترتیب این سلول خارجی رشد کرده و جایگزین سلول اصلی می‌گردد. واضح است که این نوع آلودگی‌ به وضوح در کیفیت تحقیقات اختلال ایجاد کرده و منجر به نتایج و داده‌های نادرست خواهد شد.

• تشخیص ماکروسکوپی آلودگی متقاطع

آلودگی متقاطع را نمی‌توان به صورت ماکروسکوپی تشخیص داد. اما چنانچه سرعت رشد رده سلولی شما با اندازه‌گیری‌ها و یا مشاهدات قبلی متفاوت است، توصیه می‌شود تا کشت را از لحاظ آلودگی به کمک روش‌های میکروسکوپی بررسی کنید.

• تشخیص میکروسکوپی آلودگی متقاطع:

تشخیص آلودگی متقاطع حتی با کمک میکروسکوپ نیز ممکن است دشوار باشد. اما گاهی اوقات تغییر شکل سلول می‌تواند نشانه‌ای از این نوع آلودگی محسوب شود.

چگونه از آلوده شدن محیط کشت سلول جلوگیری کنیم؟

تا به اینجای مطلب، در رابطه با انواع عواملی که می‌توانند باعث آلودگی کشت سلول شوند صحبت کردیم. در ادامه‌ی این مطلب قصد داریم تا نکات اساسی برای جلوگیری از آلوده شدن محیط کشت را بیان کنیم.

1- دستکش و روپوش آزمایشگاهی بپوشید و از هود استفاده کنید

واضح است که برای کاهش خطر آلوده شدن محیط کشت، باید آن را به دور از هرگونه محیط غیر استریل قرار داد. این محیط غیراستریل می‌تواند آزمایشگاه و حتی خود کاربر باشد. استفاده از دستکش، روپوش آزمایشگاهی و کار کردن زیر هود بیولوژیکی می‌تواند مانعی بین کشت سلول و محیط غیراستریل محسوب شود.

• از روپوش آزمایشگاهی خود فقط در داخل آزمایشگاه کشت سلول استفاده کنید و آن‌ها را مرتباً تمیز کنید.
• اطمینان حاصل کنید که هودی که زیر آن کار می‌کنید به صورت دوره‌ای سرویس می‌شود تا عملکرد درست آن تضمین گردد.
• توجه داشته باشید که انواع مختلفی از هودها وجود دارند که هرکدام برای سطوح مختلفی از آلودگی مناسب هستند.

2- به درستی از هود استفاده کنید

تنها داشتن هود برای کاهش خطر آلوده شدن کشت سلولی کافی نیست. بلکه کاربر باید طرز استفاده‌ی صحیح از این تجهیز را نیز بداند.

• ابتدا اطمینان حاصل کنید که راه ورود جریان هوا به هود را مسدود نکرده‌اید. به طور مثال مواد را روی ورودی‌های هوا قرار ندهید.
• همچنین مطمئن شوید که به طور کامل زیر هود کار می‌کنید و خیلی به لبه‎‌ی هود نزدیک نیستید.
• پیش از استفاده و پس از اتمام کار، هود را با استفاده از اتانول 70٪ یا 70٪ IMS پاک کنید.
• چنانچه ظروف مخصوص دفع پسماند زیر هود قرار دارند، آن‌ها را مرتبا خالی و تمیز کرده و درصورت امکان دور بیندازید. زیرا اگر پسماندها به مدت طولانی زیر هود باقی بمانند، می‎توانند خطر بروز آلودگی را افزایش دهند.
• همچنین اغلب هودها دارای اشعه UV هستند. به یاد داشته باشید که در پایان روز و پس از انجام آزمایشات خود، آن را روشن کنید تا هود استریل شود.

3- انکوباتور و دستگاه بن ماری را مرتبا تمیز کنید

دستگاه انکوباتور خود را مرتبا تمیز کنید. توجه داشته باشید که روش‌های نظافت این دستگاه بسته به پروتکل‌‌های تنظیم شده توسط آزمایشگاه و یا سازنده متفاوت خواهند بود.

اگر داخل دستگاه انکوباتور از سینی آب استفاده می‌کنید، این سینی را تمیز کرده و آب درون آن را دائماً تعویض کنید. ممکن است گاهی اوقات لازم باشد تا برای جلوگیری از ایجاد آلودگی، مواد شیمیایی را به محتوای سینی اضافه کنید. در چنین شرایطی توصیه می‌شود همیشه بررسی کنید که آیا این ماده شیمیایی با جنس سینی سازگار هستند یا خیر.

به همین ترتیب، آبِ درون بن ماری که محیط کشت در آن گرم می‌شود نیز باید به‌طور منظم تغییر کند.

4- تمام سطوح را ضدعفونی کنید

معمولا برای ضدعفونی کردن سطوح از اتانول 70% استفاده می‌شود. بنابراین برای افزایش کارایی این ماده ضدعفونی کننده، اطمینان حاصل کنید که غلظت آن 70% باشد.

توجه داشته باشید که هربار به چیزی خارج از هود دست می‌زنید (به طور مثال برای حرکت دادن صندلی، قرار دادن اشیا خارج از هود و یا لمس عینک)، حتما دستکش خود را عوض کنید.

5- قرار گرفتن کشت سلول در معرض محیط‌های غیراستریل را به حداقل برسانید

از آنجایی که برای استریل ماندن فضای داخل هود و انکوباتور تلاش زیادی صورت گرفته است، دقت داشته باشید تا کشت سلول اغلب در همین محیط‌های استریل مورد ارزیابی و بررسی قرار گیرد. چنانچه بنابر ضرورت مجبور شدید محیط کشت را به محیط‌های دیگری منتقل کنید، زمان قرارگیری کشت سلول در معرض این محیط‌های غیر استریل را به حداقل میزان ممکن کاهش دهید. به عنوان مثال، وقتی که کشت را زیر میکروسکوپ بررسی می‌کنید، ویدیو تایم لپس (Time-lapse photography) کشت را آماده می‌کنید و یا زمانی که کشت را از انکوباتور به زیر هود منتقل می‌کنید.

6- از معرف‌ها و تجهیزات استریل استفاده کنید

یکی دیگر از اقداماتی که می‌تواند از آلودگی محیط کشت جلوگیری کند، استفاده از مواد و معرف‌های استریل است. به طور مثال  محیط کشت، ^[5]PBS و یا هر ماده‌ای که در تماس مستقیم با کشت سلول قرار می‌گیرد، باید استریل باشد. یکی دیگر از روش‌های استریل نگه داشتن محیط کشت، تقسیم مقدار آن است. به این ترتیب، اگر یک قسمت از کشت آلوده شود، کل محیط کشت تحت تأثیر قرار نمی‌گیرد.

جدا از معرف‌ها، تجهیزات و وسایل آزمایشگاهی که در تماس با محیط کشت هستند نیز باید استریل باشند. جهت استریل کردن این موارد، ‌می‌توان از دستگاه اتوکلاو استفاده کرد. اما دقت داشته باشید که این تجهیزات از قابلیت اتوکلاو شدن برخوردار باشند.

7- از نوک سمپلرهای فیلتر دارد استفاده کنید و آن‌ها را مرتبا عوض کنید

استفاده از نوک سمپلرهای فیلتردار باعث می‌شود تا بخار نمونه به داخل سمپلر وارد نشود. در غیر این صورت ممکن است سمپلر آلوده شود و این آلودگی به نمونه‌های مختلف نیز منتقل گردد. اما انتقال آلودگی تنها به این مورد ختم نمی‌شود. بلکه تعویض نکردن نوک سمپلر نیز می‌تواند منبع آلودگی محسوب شود. به همین دلیل، اطمینان حاصل کنید که نوک سمپلر را در طول آزمایشات، تعویض کنید. زمانی که لازم است نمونه‌ای از کشت درون بطری‌ها برداشته شود، سمپلر را داخل بطری فرو نبرید. بلکه از پیپت‌های بلند شیشه‌ای استفاده کنید که به این منظور  طراحی شده‌اند.

8- کشت سلول را مرتبا بررسی کنید

بررسی مداوم و منظم کشت زیر میکروسکوپ در اغلب موارد مفید خواهد بود. همانطور که در قسمت معرفی انواع آلودگی‌ها ذکر کردیم، آلوده شدن محیط کشت سلول در بیشتر موارد از طریق روش‌های میکروسکوپی قابل تشخیص است. اما دقت داشته باشید که حین انجام این بررسی‌ها، محیط کشت را برای مدت زیادی از انکوباتور دور نکنید تا خطر ایجاد آلودگی کاهش یابد. تغییرات مورفولوژیکی یا میزان تکثیر غیرمعمول را بررسی کنید و درصورت آلوده بودن محیط، اقدامات لازم را انجام دهید.

9- نمونه‌های آلوده را به درستی دفع کنید

چنانچه فکر می‌کنید، نمونه‌ی شما آلوده شده است، آن را از ماده سفیدکننده 10% پر کرده و برای مدتی درون سینک آزمایشگاه و دور از انکوباتور قرار دهید. سپس محتوی ظرف را داخل سینک ظرفشویی خالی کرده و ظرف کشت را دور بیندازید. همچنین درصورت آلوده بودن نمونه‌های خود، همکارانتان را مطلع سازید. علی‌الخصوص افرادی که نمونه‌های خود را در همان انکوباتوری که شما استفاده می‌کردید، نگهداری می‌کنند. همچنین در صورت امکان انکوباتور را تخلیه کرده و آن را تمیز کنید.

10- اقدامات کلی و عمومی

• بدیهی است که هیچ نمونه حاوی باکتری نباید در دستگاه انکوباتور کشت سلولی شما قرار گیرد.
• اگر بیمار هستید، سعی کنید از انجام فعالیت‌های مرتبط با کشت سلولی خودداری کنید.
• صحبت در مقابل انکوباتورهای باز یا هنگام کار زیر هود را به حداقل برسانید.
• درب انکوباتور را برای مدت طولانی باز نگذارید.
• دستان خود را قبل و بعد از دست زدن به کشت سلول بشویید.

جمع‌بندی

کشت سلول یکی از روش‌های پرکاربرد آزمایشگاهی است که در شناسایی و تشخیص میکروارگانیسم‌های مختلف موثر است. اما عوامل آلوده‌کننده مختلفی در محیط‌های آزمایشگاهی وجود دارند که نفوذ آن‌ها به محیط کشت می‌تواند سبب بروز نتایج کاذب مثبت و یا منفی شود. شناخت این عوامل و نحوه تشخیص آن‌ها در جلوگیری از آلوده شدن محیط کشت سلول موثر خواهد بود.

به همین دلیل در این مقاله سعی کردیم تا ابتدا مروری بر رایج‌ترین عوامل آلوده کننده محیط‌های کشت داشته باشیم و سپس نکاتی را برای جلوگیری از نفوذ این عوامل به محیط کشت بیان کنیم.

واژه‌نامه: