دستورالعمل اجرایی آزمایش مایع مغزی نخاعی برای جدا كردن و شناسایی عوامل قارچی با تاكید بر كریپتوكوكوس نئوفرمنس

تهیه و تنظیم: دكتر محمد قهری  

مقدمه

علائم عمومی مننژیت قارچی

مایع مغزی نخاعی (CSF) در بیماران مبتلا به مننژیت قارچی دارای منظره‌ی شفاف است. سطح پروتئین عموما افزایش یافته است و ممكن است بیشتر از یك گرم در لیتر باشد. قند آن معمولا پائین است. تعداد سلول‌ها در هر میلی‌متر مكعب افزایش متوسطی دارد (از چندین عدد تا چند صد عدد).

آزمایش مستقیم میكروسكپی از مایع مغزی نخاعی

حداقل 10 میلی‌لیتر از مایع مغزی نخاعی (CSF) را سانتریفیوژ كرده و رسوب آن را مورد آزمایش مستقیم میكروسكپی و کشت قرار می‌دهند. گسترش مرطوب شامل آزمایش مستقیم یك قطره از رسوب، تهیه لام با مركب چین و رنگ‌آمیزی‌ها شامل  رنگ آمیزی متیلن بلو، رنگ آمیزی گرم، رنگ آمیزی كالكوفلوروایت، رنگ آمیزی گیمسا، رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور و رنگ آمیزی PAS می‌باشد.

منظره میكروسكپی از رسوب مایع مغزی نخاعی CSF در یك نگاه اجمالی

 كریپتوكوكوس نئوفرمنس: به صورت مخمرهای كپسول‌دار (5 تا10 میكرون و با كپسول20 تا30 میكرون قطر دارند) مشاهده می‌شوند. در مننژیت كریپتوكوكوسی عموما منونوكلئرها غلبه دارند و مننژیت مزمن لنفوسیتیك ایجاد می‌كند. مخمرهای جوانه‌دار كوچك (3 تا 5 میكرون) به‌ویژه اگر همراه با هایفی یا سودوهایفی دیده شود دلالت بر كاندیدا      می‌كند. مننژیت حاد یا نوتروفیلیك غالبا در مننژیت كاندیدایی دیده می‌شود. باید توجه داشت كه كاندیدا گلابراتا فقط شامل بلاستوكونیدی (5/2 تا 5/4 میكرون) است. اندازه‌ی سلول‌های مخمری هیستوپلاسما كپسولاتوم كوچكتر (2 تا 4 میكرون) است. سلول‌های بلاستومایسس درماتیتیدیس بزرگتر (8 تا 15 الی30 میكرون) می‌باشند. در مننژیت ناشی از بلاستومایسس درماتیدیس پلی مرفونوكلئرها غلبه دارند. هیستوپلاسما و بلاستومایسس در بافت معمولا هایفی ندارند. در مننژیت قارچ‌های رشته‌ای نوتروفیل‌ها غلبه دارند. قارچ‌های رشته‌ای بیشتر موجب گرانولوما یا آبسه‌ی مغزی می‌شوند تا مننژیت. در مننژیت ناشی از كوكسیدیوئیدس ایمیتیس ائوزینوفیل‌ها حضور دارند و مننژیت گرانولوماتوزی ایجاد می‌كند.

عوامل قارچی ایجاد كننده مننژیت: كریپتوكوكوس نئوفرمنس، كریپتوكوكوس گتی، گونه‌های كاندیدا، گونه‌های آسپرجیلوس، كوكسیدیوئیدس ایمیتیس، بلاستومایسس درماتیتیدیس، هیستوپلاسما كپسولاتم، اسپوروتریكس شنكئی، پاراكوكسیدیوئیدس برازیلینسیس، و پنی سیلیوم مارنفئی و علل قارچی نادر شامل كلادوفیالوفورا بانتیانا، موكور، رودوترولا می‌باشند.

علل زمینه‌ای: پیوند ارگان، شیمی درمانی سرطان، بستری بودن در ICU ، بیماران دارای اختلالات سیستم ایمنی، سركوبی سیستم ایمنی، بدخیمی‌های خونی (لوسمی، لنفوم)، درمان‌های كورتیكوستروئیدی، بیماری‌های التهابی (ساركوئیدوز)، نوزادان نارس،  بیماران HIV مثبت.

مننژیت ناشی از كریپتوكوكوس نئوفرمنس

در مننژیت ناشی از کریپتوکوکوس نئوفرمس، مایع مغزی نخاعی (CSF) شفاف و به ندرت زرد رنگ یا كدر است. تعداد لكوسیت‌ها افزایش دارد ولی معمولا از 800 سلول تجاوز نمی‌كند. تعداد لنفوسیت‌ها اغلب بالا است اما گاهی نوتروفیل‌ها هم زیاد می‌شوند. پروتئین بین 40 تا 600 میلی‌گرم درصد متغیر است. میزان قند پائین است (اغلب حدود 10 میلی‌گرم درصد).

آزمایش میكروسكپی با پتاس 10%، رنگ‌آمیزی با گیمسا و استفاده از روش اختصاصی مركب چین (مخمرهای گرد به قطر 5 تا 20 میكرون، اتصال نقطه‌ای جوانه به سلول مادر، كپسول ضخیم ژلاتینی) برای تشخیص ارگانیسم صورت می‌گیرد. به‌جز گونه‌های غیرعادی كلیه مخمرهای جنس كریپتوكوكوس مخمرهایی بدون رشته، كپسول‌دار و بدون رنگدانه كاروتنوئید هستند. انواع كریپتوكوكوس‌ها اوره آز مثبت هستند و در محیط حاوی اوره با ایجاد كربنات آمونیوم (قلیائی) رنگ محیط را  بعد از چهار روز قرمز می‌كنند. كریپتوكوكوس‌ها عمدتا هیچ‌یك از قندها را تخمیر نمی‌كنند. حساسیت آن‌ها در مقابل اكتیدیون متغیر است. (به‌طور كلی 1/0 میلی‌گرم در میلی‌لیتر از رشد كریپتوكوكوس در محیط کشت جلوگیری می‌كند). همچنین تولید آنزیم فنل اكسیداز می‌كنند.

تشخیص آزمایشگاهی مننژیت كریپتوكوكوسی در بیماران ایدزی:

تعداد زیاد ارگانیسم در مایع مغزی نخاعی (CSF) این بیماران موجب مثبت شدن آزمایش مستقیم میكروسكپی با مركب چین می‌شود (70 تا 90% موارد نتیجه مثبت است). توضیح اینكه درآزمایش مركب چین هنگامی‌كه تعداد سلول در هر میلی‌لیتر بین 1000 تا 10.000 باشد نتیجه مثبت خواهد بود. در بیماران ایدزی این میزان برابر 100.000 الی 10.000.000 سلول است. لكوسیت‌ها، قطرات چربی، سلول‌های بافتی و گلبول‌های میلین ممكن است با اشتباه گرفتن با عناصر مخمری موجب نتیجه مثبت كاذب در آزمایش مركب چین گردند. سانتریفیوژ كردن نمونه با سرعت 500 دور در دقیقه به‌مدت 10 دقیقه حساسیت این تست را افزایش می‌دهد (casadevall, 1998). تعداد گلبول‌های سفید كاهش دارد و یا ممكن است نرمال باشد.

تشخیص آزمایشگاهی مننژیت كریپتوكوكوسی در بیماران غیر ایدزی:

آزمایش مركب چین تقریبا در 50% بیماران مثبت است. تعداد گلبول‌های سفید مایع نخاع افزایش نشان می‌دهد و اكثرا از نوع لنفوسیتی هستند.

کشت:

کریپتوکوکوس نئوفرمنس معمولا در مدت 48 تا 72 ساعت رشد می‌كند. دمای مطلوب برای رشد آن 30 تا 35 درجه است هرچند كه در 37 درجه سانتیگراد نیز رشد می‌كند. (سابورودكستروز آگار محتوی كلرامفنیكل، محیط خوندار و BHI). در مقابل حرارت بسیار حساس است و در دمای 40 تا 42 درجه رشد نمی‌كند. كلنی‌های سفید خامه‌ای با هاله‌ای صورتی ظاهر می‌شود كه بعد از 5 تا 8 روز سطح كلنی‌ها صاف، مرطوب و موكوئیدی شده و به رنگ گل اخرا در می‌آیند. کشت از حجم زیاد مایع مغزی نخاعی (CSF) و تكرار نمونه‌گیری می‌تواند كمك‌كننده باشد. محیط کشت اختصاصی birdseed agar است كه محتوی تركیبات دی فنولیك بوده و Cryptococcal laccase موجب تشكیل ملانین و در نتیجه ظهور كلنی‌های قهوه‌ای رنگ می‌شود.

از محیط کشت اختصاصی Concanavine-glycin thymol blue agar برای تشخیص افتراقی كریپتوكوكوس نئوفرمنس از كریپتوكوكوس گتی استفاده می‌شود. (زمان انكوباسیون این محیط 5 روز در دمای 30 درجه می‌باشد). در این محیط كریپتوكوكوس گتی رنگ سبز محیط کشت را به رنگ آبی تبدیل می‌كند. باید توجه داشت كه مخمرهای دیگری نظیر كریپتوكوكوس لورنتی (C. laurentii) و تریكوسپورون موكوئیدس نیز می‌توانند موجب تغییر رنگ این محیط کشت شوند (CGB- positive). اما هردو این مخمرها از نظر تولید ملانین منفی هستند. بنابراین تست CGB فقط برای تشخیص افتراقی كریپتوكوكوس گتی از كریپتوكوكوس نئوفرمنس مفید است. در یك مطالعه از 149 بیمار HIV منفی مبتلا به مننژیت، 89% آن‌ها کشت مثبت داشته‌اند (pappas, 2001). در بیماران ایدزی این میزان برابر 95 تا  100% بوده است (zugen, 1986 & Kovacs, 1985). آزمایش مستقیم و کشت اختصاصی هستند ولی دارای میزان حساسیت برابر با 50 تا 80 درصد می‌باشند.

سرولوژی:

اندازه‌گیری آنتی‌بادی سودمند نیست. اندازه‌گیری آنتی‌ژن كریپتوكوكال تست سریع و ساده‌ای است. آزمایش آگلوتیناسیون لاتكس و الایزا دارای حساسیت بیش از 90% (در بعضی گزارش‌ها حساسیت آگلوتیناسیون لاتكس 85% و حساسیت الایزا را حدود 805 ذكر كرده‌اند) و تیتر بیشتر از یك چهارم (1/4) بسیار اختصاصی است. تیتر مساوی یا بیشتر از 1/8 نشان‌دهنده‌ی عفونت فعال است. در بیماران HIV مثبت بدون علامت، با كمك این تست میتوان تشخیص سریع و زودرس انجام داد.

چند نمونه از تحقیقاتی كه در آن‌ها حساسیت آزمایش آگلوتیناسیون لاتكس مطالعه شده است:

در افراد HIV منفی: در سایر بیماران به‌ویژه افراد دارای ایمنی شایسته، کشت و آزمایش آنتی ژن مایع مغزی نخاعی (CSF) گاهی اوقات منفی و در نتیجه تشخیص مشكل است.

علل بروز واكنش مثبت كاذب در تست آگلوتیناسیون لاتكس:

فاكتور روماتوئید

كانسر (بسیار ضعیف)

عفونت مربوط به تریكوسپورون (آنتی ژن پلی ساكاریدی كپسولی شبیه كریپتوكوك تولید می‌كند)

عفونت مربوط به  Stomatococcus mucilaginosis (آنتی ژن كپسولی تولید می‌كند كه واكنش متقاطع با كپسول كریپتوكوك می‌دهد)

عفونت با Capnocytophaga canimorsus

آلودگی با ابزارهای آزمایشگاهی (during pippeting)

آلودگی به هنگام استفاده از مواد ضدعفونی كننده و صابون برای تمیزكردن اسلایدها، آلودگی با آگار و آگارز

برای جلوگیری از واكنش‌های ناخواسته:

نمونه‌ها باید با آنزیم‌های پروتئولیتیك مانند پروناز آماده‌سازی شوند و با 2-بتا مركاپتواتانول یا دی تیوتریتول احیاء شوند.

واكنش‌های منفی كاذب ممكن است به‌علت اثر پروزون، عفونت با یك استرین با كپسول بسیار ضعیف، بار پائین ارگانیسم در نمونه و یا مشكلات مربوط به كیت دیده شوند.

مننژیت آسپرجیلوسی

کنیدی‌های آسپرجیلوس از طریق دستگاه تنفس و سینوس‌های اطراف بینی وارد بدن می‌شوند. تهاجم به سیستم اعصاب مركزی به‌وسیله‌ی تلقیح مستقیم به نواحی كه به لحاظ آناتومیك نزدیك مغز هستند و یا به‌وسیله‌ی انتشار هماتوژنوس صورت می‌گیرد. علاوه‌بر عفونت اولیه در ریه‌ها، انتشار خونی به‌وسیله‌ی تلقیح مستقیم به داخل جریان خون از طریق گوش میانی، سینوس‌های اطراف بینی، چشم و ماستوئید و یا در نتیجه‌ی عمل جراحی قلب باز اتفاق می‌افتد. آسپرجیلوس فومیگاتوس و آسپرجیلوس فلاووس از عوامل شایع هستند. آسپرجیلوس ترئوس اگرچه یك عامل غیرمعمول تهاجم به سیستم اعصاب مركزی است اما به لحاظ مقاومت به آمفوتریسین B دارای اهمیت است و مرگ و میر بالایی دارد.

اقدامات آزمایشگاهی:

آماده‌سازی نمونه: نمونه CSF به مدت 10 دقیقه با دور 10.000 سانتریفیوژ شود.

رسوب: برای آزمایش میكروسكپی از روش رنگ ‌آمیزی گرم و رنگ آمیزی متیلن بلو و رنگ آمیزی كالكوفلور وایت استفاده شود.

کشت: در محیط سابورودكستروز آگار محتوی 10% كلرامفنیكل و آبگوشت سابورو تلقیح شده و محیط آبگوشتی را در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 3 هفته نگهداری می‎نمایند. کشت‌های مثبت هنگامی به‌دست می‌آیند كه حجم زیادی از نمونه به محیط کشت تلقیح شود (ترجیحا 5 میلی‌لیتر و بیشتر).

سرولوژی: اندازه‌گیری آنتی ژن اختصاصی آسپرجیلوس (گالاكتومانان) در سرم و مایع مغزی نخاعی توسط ساندویچ الایزا به تشخیص كمك می‌كند.

نحوه انجام آزمایش بر روی نمونه  CSF  از نظر عوامل قارچی  

(با تاكید بر كریپتوكوكوس نئوفرمنس)

توجه: تا قبل از انجام کشت نمونه نباید در یخچال قرارگیرد زیرا استرین‌های كریپتوكوكوس نسبت به دمای پایین حساس بوده و از بین می‌روند.

• ابتدا نام و مشخصات بیمار به‌دقت ثبت شود.
• حجم نمونه اندازه‌گیری و ثبت شود.
• رنگ و میزان شفافیت یا كدورت نمونه به‌دقت ثبت شود.
• تمام نمونه به‌مدت 15 دقیقه با دور 1000 سانتریفیوژ شود.
• مایع رویی به لوله استریل دیگری برای انجام تست‌های سرولوژیك منتقل شود.

از رسوب نمونه (pellet) آزمایش مستقیم میكروسكپی و کشت انجام می‌شود. ابتدا رسوب را خوب به هم زده تا مخلوط همسانی به‌دست آید، سپس:

الف- آزمایش‌های میكروسكپی از رسوب:

• آزمایش مستقیم میكروسكپی:

هدف: بررسی وجود یا فقدان عناصر قارچی (هایفی كاذب و مخمرهای جوانه‌دار) و آمیب‌های آزادزی (Amphizoic Amoeba) مانند نگلریا و آكانتاموبا.

روش كار: تهیه لام مرطوب به‌صورت مستقیم با برداشت یك قطره از رسوبی كه خوب مخلوط شده‌ است و قراردادن آن روی لام و مشاهده میكروسكپی با عدسی 10 و 40 وضعیت گلبول‌های قرمز و سفید نیز  در این آزمایش از نظر فراوانی در نظر گرفته می‌شود.

• تهیه لام با مركب چین: یك قطره از رسوب CSF را روی لام قرار داده و به آن یك قطره مركب چین (كه حجم آن یك سوم حجم قطره‌ی برداشت شده از مایع CSF باشد) افزوده و بعد از مخلوط‌كردن با عدسی 10 و 40 بررسی می‌كنیم. در صورت وجود سلول‌های مخمری كپسول‌دار اطراف این سلول‌ها هاله‌ی ضخیم و شفافی دیده می‌شود و با عدسی 10 منظره شبیه آسمان سیاه پرستاره مشاهده می‌گردد. برخی از استرین‌های كریپتوكوك فاقد كپسول و یا برخی ممكن است دارای كپسول ظریفی باشند. مخمرهای كپسول دار در مایع مغزی نخاعی (CSF) حدود 60 درصد بیماران مبتلا دیده می‌شود. حساسیت این آزمایش را از 60% تا 72% گزارش كرده‌اند.

توجه : برای تهیه لام جهت رنگ‌آمیزی‌های زیر ابتدا لام را به صورت زیر تهیه كنید:

یك قطره درشت از رسوب را روی لام قرار داده و بدون اینكه آن را پهن كرده یا بگسترانید اجازه دهید در مجاورت هوا خشك شود. بعد از خشك شدن یك قطره‌ی دیگر به همین شكل روی قطره‌ی خشك شده ریخته و مجددا اجازه دهید تا در مجاورت هوا خشك شود. سپس لام را با كمك حرارت مختصر و یا به‌كمك متانول فیكس نموده و رنگ‌آمیزی‌های زیر را انجام دهید. (به این‌صورت یك گسترش نسبتا ضخیم و پرسلول حاصل خواهد شدكه مشاهده و بررسی میكروسكپی آن سریع‌تر و دقیق‌تر خواهد گردید).

3- رنگ‌ آمیزی گیمسا یا رایت گیمسا: از همان دستورالعمل رنگ‌آمیزی برای هماتولوژی استفاده می‌شود. هدف از این نوع رنگ‌آمیزی بررسی وضعیت گلبول‌های سفید از نظر برتری حضور منونوكلئرها یا پلی‌نوكلئرها و نیز مشاهده احتمالی سلول‌های مخمری می‌باشد.

4- رنگ ‌آمیزی گرم: هدف از رنگ آمیزی گرم بررسی وجود احتمالی عناصر باكتریال و نیز سلول‌های مخمری می‌باشد.

5– رنگ آمیزی كانیون: رنگ آمیزی کانیون برای بررسی وجود احتمالی باكتری‌های رشته‌ای نظیر نوكاردیا می‌باشد.

ب- کشت از رسوب در محیط‌های زیر انجام گیرد:

سابورودكستروز آگار، سابورو كلرآمفنیكل‌دار، BHI و انكوباسیون در دمای آزمایشگاه یا 30 درجه سانتیگراد به مدت 2 تا 5 روز

محیط ژلوز خوندار و انكوباسیون در 37 درجه سانتیگراد و محیط ژلوز شكلاتی و انكوباسیون در شرایط 5 تا 10 درصد گاز كربونیك و 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 تا 5 روز

محیط کشت Lowenstein-Jensen: کشت از نظر AFB در هر نمونه باید صورت گیرد. این کشت‌ها تا یك ماه باید در شرائط 37 درجه سانتیگراد نگهداری شوند.

توضیحات:

میزان حساسیت کشت را حدود 56% گزارش می‌كنند. کشت حجم زیادی از نمونه و در بعضی موارد کشت نمونه های متعدد حساسیت کشت را افزایش می‌دهد.

پلیت‌های حاوی محیط‌های کشت فوق را باید روزانه از نظر رشد بررسی و تا 3 هفته نگهداری كرده و در صورت عدم رشد بعد از 3 هفته منفی تلقی نمود. رشد هرگونه كلنی با رنگ آمیزی گرم مورد بررسی قرارگیرد و در صورت مشاهده سلول‌های مخمری رنگ آمیزی كپسول (مركب چین و یا رنگ نیگروزین10%) انجام شود.

كریپتوكوكوس نئوفرمنس معمولا ظرف 2 تا 3 روز به‌صورت كلنی‌های كرم رنگ سفید تا زرد مایل به قهوه‌ای ظاهر      می‌شوند. استرین‌های كپسول‌دار كلنی‌های براق و درخشانی را ایجاد می‌كنند و استرین‌هایی كه فاقد كپسول بوده یا كپسول ضعیفی دارند خشك به نظر می‌رسند.

ممكن است بعد از 24 الی 48 ساعت كلنی‌های سفید خامه‌ای با هاله‌ی صورتی ظاهر شوند كه بعد از 5 تا 8 روز به صورت كلنی‌های صاف، مرطوب و موكوئیدی به نظر برسند. در محیط سابورو مالتوز آگار كلنی‌ها رنگ گل اخرا به خود  می‌گیرند.

در محیط EMB بعد از یك هفته به صورت مرطوب و سیال در می‌آیند.

در صورت رشد كلنی‌های مخمری مشكوك به كریپتوكوكوس نئوفرمنس به منظور تائید حداقل میتوان از تست‌های زیر كمك گرفت:

تست هیدرولیز اوره در محیط chrisensen’s urea agar ( نتیجه مثبت است)

تست احیاء نیترات (نتیجه منفی است)

تست فنل اكسیداز (نتیجه مثبت است)

با توجه به اینكه رنگ آمیزی گرم و رنگ آمیزی گیمسا بیشتر متداول می‌باشند در اینجا فقط به شرح جزئیات روش رنگ آمیزی كانیون بسنده می‌شود:

روش رنگ آمیزی كانیون (زیل‌نلسون اصلاح شده)

هدف: برای رنگ‌آمیزی باكتری‌های اسید فست مانند مایكوباكتریوم‌ها و نیز باكتری‌های اسید فست نسبی یا اسید فست ضعیف مانند نوكاردیاها می‌باشد.

نكته: استفاده از رنگ كربول فوشین carbolfuchsin)) در این رنگ آمیزی به دلیل اینكه دارای غلظت بیشتری از فنل و فوشین بازیك است نیازی به حرارت دادن (مانند زیل نلسون كلاسیك) ندارد.

روش رنگ آمیزی کانیون:

• رنگ كانیون كربول فوشین را روی لام بریزید و 5 دقیقه صبر نمائید.
• شستشوی كامل با آب
• اسید الكل (اسیدكلریدریك 3% در اتانول) به مدت 3 دقیقه روی لام قرار دهید.
• شستشوی كامل با آب
• رنگ متیلن بلو به مدت 3 دقیقه روی لام بماند.
• شستشوی كامل با آب
• لام را خشك كرده و با عدسی روغنی میكروسكوپ مشاهده كنید.

نكته 1- اسیدكلریدریك 3% كه در محلول اسیدالكل وجود دارد برای مایكوباكتریوم‌ها مناسب است. اگر هدف بررسی و مشاهده نوكاردیاها باشد بهتر است در تركیب اسید الكل به عوض اسیدكلریدریك از اسید سولفوریك 1% استفاده شود.

نكته 2- در رنگ آمیزی کانیون، باكتری‌های اسیدفست قرمز و باكتری‌های غیراسیدفست آبی رنگ می‌گیرند.