رنگ‌آمیزی به روش پریودیک اسید شیف PAS

روش پریودیک اسید شیف ^[۱] که اغلب با نام تکنیک رنگ‌آمیزی PAS شناخته می‌شود، یکی از روش‌های رنگ‌آمیزی رایج در آزمایشگاه‌های هیستوپاتولوژی است که برای شناسایی پلی‌ساکاریدها (مانند گلیکوژن) و مواد مخاطی (مانند گلیکوپروتئین‌ها ^[۲]، گلیکولیپیدها ^[۳] و موسین‌ها ^[۴]) موجود در بافت استفاده می‌شود. در این مطلب قصد داریم شما را با تکنیک رنگ‌آمیزی PAS، محلول‌های مورد استفاده در این تکنیک و روش تهیه آن‌ها و همچنین نتایج حاصل از این روشِ رنگ‌آمیزی آشنا کنیم.

تکنیک رنگ‌آمیزی PAS چگونه به متخصصین پاتولوژی کمک می‌کند؟

تکنیک رنگ‌آمیزی PAS در شناسایی کربوهیدرات‌ها کاربرد گسترده‌ای دارد. واکنش بین پریودیک اسید شیفت و کربوهیدارت‌های موجود در سلول‌های یک بافت، فرایندی اکسیداتیو (oxidative process) است. همانطور که در بخش مقدمه نیز گفته شد تکنیک رنگ‌آمیزی PAS برای شناسایی پلی‌ساکاریدها مانند گلیکوژن و مواد مخاطی موجود در بافت استفاده می‌شود. سلول‌های بافت دارای مقادیر مختلفی از گلیکوژن هستند و رنگ PAS باعث اکسیده شدن این گلیکوژن می‌شود. در اثر این واکنش، یک ترکیب اکسیداز به نام آلدهید (Aldehydes) ایجاد می‌شود. آلدهیدها به دلیل معرف بی‌رنگ شیف (colorless Schiffs fuchsin)  به رنگ صورتی، سرخابی یا قرمز در می‌آیند.

کاربردهای رنگ آمیزی به روش پریودیک اسید شیف PAS

رنگ‌آمیزی به روش PAS کاربردهای زیادی در حوزه‌های مختلف آزمایشگاهی دارد. به همین دلیل پیش از اینکه به سراغ روش رنگ‌آمیزی و محلول‌های مورد استفاده در این تکنیک برویم، اجازه دهید مروری کوتاه بر برخی از کاربردهای این تکنیک رنگ‌آمیزی رایج داشته باشیم.

• سیتولوژی (Cytology): رنگ‌آمیزی PAS در شناسایی غیر افتراقی تومورها و در تشخیص سرطان غدد (آدنوکارسینوم ^[۵]) مورد استفاده قرار می‌گیرد.
• آسیب‌شناسی (Pathology): از دیگر کاربردهای رنگ‌آمیزی PAS می‌توان به آسیب‌شناسی کبد و کلیه اشاره کرد.
• مطالعات قارچ‌شناسی (Fungal studies): از روش رنگ‌آمیزی PAS می‌توان برای نشان دادن هیف‌های قارچی (fungal hyphae) و مخمرهای قارچ (yeast-forms) در نمونه‌های بافتی استفاده کرد. این بررسی‌ها در شناسایی عفونت‌های کاندیدا آلبیکانس ^[۶]، آسپرژیلوس فومیگاتوس ^[۷] و کریپتوکوکوس نئوفورمانس ^[۸] موثر است.
• آسیب‌شناسی دستگاه گوارش: برای تشخیص وجود مخاط در دستگاه گوارش نیز از روش رنگ‌آمیزی PAS استفاده می‌شود.
• مطالعات ریوی: از رنگ PAS جهت بررسی پروتئينوز آلوئولي ^[۹] یا آمورفی ^[۱۰] نیز استفاده می‌شود.
• پوست: برای مطالعه بدن‌های گلوبوئید ^[۱۱]
• نمونه برداری از عضلات: برای نشان دادن اجزای گلیکوژن.

روش رنگ‌آمیزی PAS برای تشخیص سرطان پروستات، آسیب‌شناسی پانکراس، مشکلات روده کوچک و بیضه و همچنین برای تشخیص گرانول‌ها در سیتوشیمی آنزیمی نیز کاربرد دارد.

روش رنگ‌آمیزی PAS

در ادامه قصد داریم تا در ابتدا شما را مواد ومحلول‌های مورد استفاده در روش رنگ‌‌آمیزی PAS  و نحوه‌آماده‌سازی هریک آشنا کرده و سپس به بررسی روش رنگ‌آمیزی و نتایج آن بپردازیم. دقت داشته باشید که در این روش از برش‌های ۴ میکرومتریِ بافتِ پارافین‌گیری شده، استفاده شده است.

۱. مواد محلول‌ها

۱-۱. فیکساتیو:

بافر فرمالین خنثی ۱۰% ^[۱۲]، فیکساتیو Zenker’s  هر ماده تثبیت کننده‌ی مناسب دیگر.

توجه داشته باشید که اگر رنگ‌آمیزی PAS بر روی بافت انجام می‌شود، بهتر است از بافر فرمالین خنثی ۱۰%  یا محلول بوئن (Bouin solution) به‌عنوان فیکساتیو استفاده شود. اما در رابطه با اسمیر خون، متانول به عنوان فیکساتیو توصیه می‌شود.

همچنین استفاده از گلوتارآلدئید (Glutaraldehyde) توصیه نمی‌شود زیرا گروه‌های آلدهیدی آزاد ممکن است با معرف شیف واکنش نشان داده و منجر به نتایج مثبت کاذب شوند.

۲-۱. محلول پریودیک اسید % ۰/۵:

پریودیک اسید ——————————————– ۰/۵ گرم

آب مقطر ———————————————— ۱۰۰/۰میلی‌لیتر

۱-۳. محلول Modified Lillies Schiff:

۰/۳ گرم پاراروزانیلین (pararosanilin) را در ۲۰ میلی لیتر اتیل الکل ۲۰٪ حل کنید.

۸۰ میلی لیتر آب مقطر، ۲/۰ گرم سدیم متابی‌سولفیت (sodium metabisulfite) ، ۰/۱۵ گرم سدیم هیدروسولفیت (sodium hydrosulfite) را به محلول بالا اضافه کرده و کاملاً مخلوط کنید.

سپس ۱/۰ میلی لیتر اسید کلریدریک (hydrochloric acid) و ۰/۳ گرم زغال فعال (ctivated charcoal) را به محلول اضافه کنید.

محلول را 3 دقیقه هم بزنید و از طریق کاغذ فیلتر رد کنید. رنگ محلول باید مثل آب شفاف باشد.

معرف شیف را در یخچال و در دمای 3 الی 6 درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید. در صورت نگهداری در یخچال، محلول حداقل یک سال ماندگار است.

• سدیم بورات % ۰/۳:

سدیم بورات (Na2 B4 O7 10H2O)  ——————————— ۰/۳ گرم

آب مقطر ————————————– ۱۰۰/۰ میلی لیتر

۲. مراحل رنگ‌آمیزی

۱. مراحل پارافین‌زدایی و هیدراسیون را انجام دهید.

۲. نمونه را به مدت ۱۰ دقیقه در محلول پریودیک اسید قرار دهید تا اکسیده شود. اگر نمونه کلیه، پوست و یا بیوپسی کبد است، این زمان را به ۱۵ دقیقه افزایش دهید.

۳. لام را ۴ مرتبه با استفاده از آب مقطر آبکشی کنید.

۴. نمونه را به مدت ۱۵ دقیقه در محلول Modified Lillies Schiff قرار دهید. برای نمونه‌های کلیه و پوست این زمان را به ۳۰ دقیقه افزایش دهید.

۵. سپس مجددا لام را 4 مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.

۶. لام را به مدت ۱۵ ثانیه در سدیم بورات ۰/۳٪ قرار دهید و سپس ۴ مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.

۷. لام را به مدت ۴۵ ثانیه در هماتوکسیلین اسیدی شده لیلی-مایر قرار دهید و سپس آن را ۳ مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.

۸. نمونه را در سدیم بورات % ۰/۳ قرار دهید و پس از گذشت ۱۵ ثانیه آن‌را ۴ مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.

۹. دهیدراسیون را به کمک درجه‌بندی‌ها و غلظت‌های مختلف الکل انجام داده و سپس لام را با استفاده از زایلین شفاف (clear) کنید.

۳. بررسی نتایج

گلیکوژن، موسین، رتیکولوم (reticulum)، کلوئید (colloid droplets)، رسوبات هیالین در گلومرول‌ها (hyaline deposits in glomeruli)، غشاهای پایه، کلوئید ساقه هیپوفیز و تیروئید —————————– قرمز یا بنفش

قارچ‌ها—————————————— قرمز

هسته—————————————— آبی

۴. نکات مهم

۱. این موضوع که آیا معرف شیف قابل استفاده است یا خیر را می‌توان با ریختن چند قطره از معرف در ۱۰ میلی‌لیتر فرمالدئید با درجه واکنش (۴۰-۳۷٪) در یک لیوان کوچک آزمایش کرد. اگر محلول به سرعت به بنفش مایل به قرمز تبدیل شود، قابل استفاده است. اما اگر واکنش به تأخیر بیفتد و رنگ آن به رنگ آبی-بنفش متمایل باشد، محلول قابل استفاده نبوده و باید دور ریخته شود.

۲. فرمول معرف Lillies Schiff اصلاح شده است. این محلول اصلاح شده برای تهیه، به پاراروزانیلین کمتری احتیاج دارد، خیلی سریع‎تر آماده می‌شود، نتایج رنگ آمیزی مطلوبی دارد و به نظر می‌رسد ثبات بیشتری نسبت به فرمول اصلی داشته باشد.

جمع‌بندی

امروزه الگوهای هیستوشیمیایی به عنوان ابزارهای تشخیصی ارزشمند و مقرون به صرفه در حوزه‌ی  آسیب‌شناسی به کار می‌روند و تغییراتی جزئی در این الگوها می‌تواند به تشخیص زود هنگام بسیاری از بیماری ‌ها و همچنین شناسایی پاتوژن‌های مختلف کمک کند. روش رنگ‌آمیزی PAS یکی از پرکاربردترین تکنیک‌ها برای نشان دادن گلیکوپروتئین‌ها ، کربوهیدرات ها و مخاط و بررسی الگوهای هیستوشیمیایی است. به همین دلیل در این مطلب سعی کردیم این روش رنگ‌آمیزی، کاربردها و نتایج حاصل از آن را توضیح دهیم.

توجه داشته باشید که تکنیک‌های رنگ‌آمیزی ممکن است در آزمایشگاه‌های مختلف متفاوت باشند و روش توضیح داده شده در این مقاله تنها یکی از انواع روش‌های رنگ‌آمیزی PAS به شمار می‌رود. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد. اگر تجربه‌ی رنگ‌آمیزی به روش PAS را دارید، خوشحال می‌شویم تجربیات خود را با ما و دیگر خوانندگان این مطلب به اشتراک بگذارید.

واژه‌نامه