مقدمه‌ای بر رنگ‌های روتین و خاص در آزمایشگاه

رنگ آمیزی بافت‌ و یا میکروارگانیسم‌ها در آزمایشگاه روش رایجی است که کاربرد زیادی در تشخیص انواع بیماری‌ها دارد. با استفاده از تکنیک‌های رنگ آمیزی، آسیب شناسان و محققان قادر هستند تا مورفولوژی (ساختار) بافت را زیر میکروسکوپ مشاهده کنند و یا به دنبال وجود انواع سلول‌های خاص یا حتی میکروارگانیسم‌هایی مانند باکتری‌ها بروند.

در آزمایشگاه‌های هیستوپاتولوژی، اصطلاح “رنگ آمیزی روتین” به رنگ هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) اطلاق می‌شود که به طور “روتین” برای آشکارسازی ساختار یک بافت در اکثر نمونه‌های بافتی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

در مقابل رنگ‌های خاص به دسته‌ای از رنگ‌های آزمایشگاهی گفته می‌شود که به کمک آن‌ها می‌توان گروه خاصی از ارگانیسم‌ها را شناسایی کرد. این رنگ‌ها اغلب زمانی مورد استفاده قرار می‌گیرند که H&E  تمام اطلاعات مورد نیاز آسیب‌شناس یا محقق را فراهم نکند.

در این مقاله قصد داریم تا مروری بر رنگ‌های روتین و خاص در آزمایشگاه‌های بافت شناسی داشته باشیم. پس در ادامه‌ی این مطلب با ما همراه باشید.

چگونه یک بافت در آزمایشگاه رنگ آمیزی می‌شود؟

قبل از رنگ آمیزی و بررسی بافت زیر میکروسکوپ لازم است یکسری اقدامات صورت گیرد تا بتوان یک قسمت بسیار نازک از بافت (معمولاً 2–7 میکرومتر) را روی لام میکروسکوپ قرار داد. برای این کار دو روش اصلی وجود دارد که در ادامه به صورت اجمالی به بررسی آن‌ها خواهیم پرداخت.

1- Frozen section

از این تکنیک در مواقعی استفاده می‌شود که لازم باشد پاسخ بررسی بافت سریعاً حاضر شود (به طور مثال حین جراحی که جراح هنگام برداشتن تومور باید از حاشیه برداشتن آن مطلع شود).

این تکنیک علی رغم اینکه امکان دسترسی سریع به نتایج را فراهم می‌کند، اما کیفیت بافت آماده شده به اندازه‌ی آماده‌سازی بافت با استفاده از پارافین نیست. (آماده سازی بافت با استفاده از پارافین در قسمت‌های بعدی ذکر شده است)

روند آماده سازی یک Frozen section به شرح زیر است:

• برای سفت شدن بافت و حفظ خواص و ساختار آن، بافت به سرعت منجمد می‌شود.
• بافت منجمد شده به کمک دستگاه کریواستات (میکروتوم مقطعی به همراه محفظه انجماد) برش داده می‌شود و جهت رنگ‌آمیزی روی لام میکروسکوپ قرار می‌گیرد.
• بافت بلافاصله فیکس می‌شود تا از پوسیده شدن آن جلوگیری گردد.
• سپس مراحل رنگ آمیزی انجام خواهد شد.

2- آماده سازی بلوک پارافین

در این تکنیک، ابتدا نمونه با استفاده از فیکساتیوها، تثبیت می‌شود و سپس به کمک پارافین قالب‌گیری می‌گردد.

این فرآیند نسبت به Frozen section زمان بیشتری لازم دارد، اما در بیشتر موارد رنگ آمیزی با کیفیت بهتری را فراهم می‌کند و بلوک‌های آماده شده می‌توانند برای مدت زمان بسیار طولانی ذخیره شوند.

روند آماده‌سازی بلوک پارافین به شرح زیر است:

1- بافت‌برداری (Grossing): ناحیه خاصی از بافت که باید مورد بررسی قرار گیرد برش داده شده و درون تیشوکاست قرار می‌گیرد.

2- فیکساسیون (Fixation): برای حفظ بافت و جلوگیری از پوسیده شدن آن، از محلول مبتنی بر فرمالدئید استفاده شده و بافت اصطلاحاً فیکس می‌شود.

3- پردازش بافت (Tissue processing): طی یک پروسه و با استفاده از معرف‌های مختلف، بافت آب‌گیری (دهیدراسیون) شده و سپس در موادی مانند گزیلول قرار میگیرد تا برای قالب‌گیری با پارافین آماده شود.

4- قالب‌گیری با پارافین (Embedding): بافت‌هایی که در تیشوکاست قرار دارند به کمک قالب بلوک‌گیری با پارافین مذاب قالب‌گیری می‌‌شوند.

5- برش مقطعی: بافت قالب گیری شده پس از اینکه از قالب بلوک گیری خارج شد، در دستگاهی به نام میکروتوم قرار می‌گیرد. در دستگاه میکروتوم به دلیل اصطکاک بین بلوکِ پارافین و تیغه‌ی دستگاه، گرما تولید می‌شود. این گرما باعث می‌شود تا هر بخش از بافتِ برش خورده به برش جدید بچسبد و به این ترتیب یک نوار از بافت تولید می‌شود. سپس این نوار درون یک حمام آب گرم شناور می‌شود تا هرگونه چین و چروک ناشی از عمل برش، از بین برود.
سپس برشِ دلخواه روی یک لام میکروسکوپ قرار می‌گیرد. پیش از رنگ آمیزی لازم است تا ابتدا لام خشک شده و پارافین به کمک یک حلال از روی لام زدوده شود.

چرا رنگ آمیزی H&E روشی روتین است؟

از رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) به طور معمول در آزمایشگاه‌های آسیب شناسی (پاتولوژی) استفاده می‌شود زیرا این روش با رنگ‌آمیزی واضح ساختارهای سلولی از جمله سیتوپلاسم، هسته و اندامک‌ها و اجزای خارج سلول، نمای بسیار دقیقی از بافت را به آسیب‌شناس یا محقق ارائه می‌دهد.

اطلاعات به دست‌آمده به کمک این روش رنگ‌آمیزی، غالباً برای تشخیص بیماری‌ها بر اساس ساختار یا بی‌نظمی سلول‌ها مفید هستند. همچنین به کمک رنگ‌آمیزی H&E می‌توان هرگونه ناهنجاری را در سلول‌ مشاهده کرد. (مانند تغییرات هسته‌ای که به طور معمول در سرطان دیده می‌شود).

در یک آزمایشگاه بافت شناسی بالینی، اغلب نمونه‌ها ابتدا با H&E رنگ آمیزی می‌شوند. گاهی اوقات در صورت نیاز به اطلاعات اضافی برای تجزیه و تحلیل دقیق‌تر یک بافت، از رنگ‌های پیشرفته (advanced stains) نیز استفاده می‌شود. به عنوان مثال برای تمایز بین دو نوع سرطان از نظر مورفولوژیکی. با این وجود، حتی هنگامی که محققین از روش‌های پیشرفته رنگ‌آمیزی استفاده می‌کنند، بازهم روش H&E بخشی مهم از تصویر تشخیصی را تشکیل می‌دهد. زیرا به کمک آن مورفولوژی بافت زیرین مشخص شده و به آسیب‌شناس یا محقق اجازه می‌دهد تا نتایج رنگ‌آمیزی پیشرفته را بهتر تفسیر کند.

استفاده از روش رنگ‌آمیزی H&E، به قدری در آزمایشگاه‌های بالینی و پاتولوژی بالا است که اغلب آزمایشگاه‌ها از سیستم‌های کاملاً خودکار برای رنگ‌آمیزی لام استفاده می‌کنند و رنگ آمیزی دستی نسبت به قبل بسیار کمتر شده است.

شکل‌های 3 الی 6 تصاویری از بافت‌های رنگ آمیزی شده به کمک تکنیک رنگ‌آمیزی هماتوکسلین-ائوزین را نشان می‌دهد.

مروری بر رنگ‌های هماتوکسلین و ائوزین

 در رنگ‌آمیزی H&E از دو رنگ هماتوکسیلین و ائوزین استفاده می‌شود. این ترکیب، عناصر مختلف بافت را به صورت متفاوتی رنگ‌آمیزی می‌کند.

 هماتوکسیلین یک رنگ با پایه باز است که عناصر اسیدی را به رنگ آبی مایل به بنفش رنگ‌آمیزی می‌کند. این رنگ برای ساختارهای اسیدی یا بازوفیلیک^[1] از جمله هسته سلول^[2] که حاوی DNA و نوکلئوپروتئین^[3] است و اندامک‌هایی که حاوی RNA هستند مانند ریبوزوم‌ها^[4] و شبکه آندوپلاسمی خشن^[5] مورد استفاده قرار می‌گیرد.

ائوزین یک رنگ اسیدی است که ساختارهای بازی یا اسیدوفیلیک^[6] شامل سیتوپلاسم^[7]، دیواره‌های سلول^[8] و فیبرهای خارج سلولی^[9] را به صورت قرمز یا صورتی رنگ‌آمیزی می‌کند.

هماتوکسیلین از چوب درخت بقم (hematein) استخراج می‌شود. این رنگ پس از خالص‌سازی، اکسید شده و با یک ماده موثر (معمولاً کاتیون‌های فلزی مانند آهن، آلومینیوم، و یا تنگستن) ترکیب می‌شود تا به ساختارهای سلول متصل گردد. انواع مختلفی از هماتوکسیلین برای استفاده در دسترس است که تا حدی بر اساس انتخاب یون‌های فلزی استفاده می‌شوند و از لحاظ شدت رنگ با یکدیگر تفاوت دارند. از بین انواع مختلف هماتوکسیلین که در بافت شناسی استفاده می‌شود، هماتوکسیلین Gillء^[10]، هماتوکسیلین هریس^[11] و هماتوکسیلین مایر^[12] محبوب‌تر هستند.

ائوزین در اثر واکنش بین برم^[13] و فلورسین^[14] تشکیل می‌شود. دو نوع ائوزین به طور معمول در بافت‌شناسی مورد استفاده قرار می‌گیرند: ائوزین Y که کمی مایل به زرد است و ائوزین B که کمی مایل به آبی است. اما به‌طور کلی ائوزین Y محبوبیت بیشتری دارد.

در شکل‌های 7 و 8 تصاویری از ساختار شیمیایی دو رنگ هماتوکسلین و ائوزین نمایش داده شده است.

مروری بر رنگ‌های خاص مورد استفاده در پاتولوژی

اصطلاح “رنگ‎‌های خاص” به طور کلی به هر رنگی بجز H&E گفته می شود. رنگ‌های خاصِ مورد استفاده در آزمایشگاه بسیار متنوع هستند و برای مشخص کردن ساختارهای بافتیِ خاص، عناصر و میکروارگانیسم‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند که با استفاده از روش H&E نمی‌توان آن‌ها را شناسایی نمود.

توجه داشته باشید که علی رغم وجود صدها نوع رنگ خاص، فقط تعداد کمی از آن‌ها در بافت‌شناسی بالینی استفاده می‌شوند. همچنین با وجود اینکه بسیاری از آزمایشگاه‌های بزرگتر از ابزارهای خودکار برای رنگ‌آمیزی استفاده می‌کنند، اما رنگ آمیزی خاص هنوز هم به صورت دستی انجام می‌شود.

مثال‌هایی از رنگ‌های خاص

تصاویر زیر برخی از رنگ‌های خاص و رایج و کاربردهای آن‌ها را نشان می‌دهد.

از ماسون تری کروم^[15] برای مشخص کردن رشته‌های کلاژن در بافت همبند استفاده می‌شود.

 این ماده برای کمک به افتراق کلاژن و عضله صاف در تومورها و کمک به تشخیص بیماری‌ها یا تغییرات در بافت همبند / عضله مورد استفاده قرار می‌گیرد.

رنگ  silver (GMS اصلاح شده)^[16] برای مشاهده بافتی قارچ‌ها، غشای پایه و برخی ارگانیسم‌های فرصت طلب مانند پنوموسیستیس کارینی^[17] در نمونه‌های بافتی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

رنگ PASء^[18] عمدتا برای رنگ آمیزی ساختارهای حاوی مقدار زیادی کربوهیدرات مانند گلیکوژن، گلیکوپروتئین‌ها، پروتئوگلیکان‌ها که به طور معمول در بافت‌های همبند، مخاط و غشای پایه یافت می‌شوند، مورد استفاده قرار می‌گیرد.

 این رنگ برای رنگ‌آمیزی نمونه‌‌های کلیه و کبد و بررسی برخی از بیماری‌های ذخیره سازی گلیکوژن در عضلات مخطط و عفونت‌های قارچی کاربرد دارد.

پرشین بلو^[19] برای شناسایی آهن فریک (Fe3+) در آماده‌سازی بافتی، اسمیر خون یا رنگ آمیزی مغز استخوان استفاده می‌شود. مقادیر اندکی آهن فریک (هموسیدرین) معمولاً در مغز استخوان و طحال یافت می‌شود. اما  مقادیر غیرطبیعی آهن می‌تواند نشانگر هموکروماتوز و هموسیدروز باشد.

رنگ زیل نلسون برای شناسایی باسیل‌های اسید فست در بافت استفاده می‌شود. (به عنوان مثال شناسایی سل در بافت ریه)

آبی آلسیان به طور معمول با pH 2.5 تهیه می‌شود و برای شناسایی موکوپلی ساکاریدهای اسیدی^[20] و مخاط‌های اسیدی^[21] استفاده می‌شود.

برخی اوقات برای رنگ‌آمیزی بافت از ترکیب دو رنگ آبی آلسیان و PAS استفاده می‌شود

از رنگ‌های تریکروم برای رنگ‌آمیزی و شناسایی فیبرهای عضلانی، کلاژن و هسته استفاده می‌شود.

از این رنگ‌ها  می‌توان برای کنتراست ماهیچه‌های اسکلتی، قلبی یا عضله‌ی صاف استفاده کرد.

رنگ‌آمیزی با گوموری تری کروم^[22] نسبت به ماسون تری‌کروم پیچیدگی کمتری دارد.

گیمسا^[23] مهم‌ترین رنگی است که برای مشاهده نمونه سلول‌های خونی و مغز استخوان مورد استفاده قرار می‌گیرد.

با استفاده از این رنگ، سیتوپلاسم آبی کم رنگ و هسته رنگ آبی تیره مایل به بنفش مشاهده می‌شود.

با استفاده از این رنگ  گلبول‌های قرمز نیز به صورت صورتی کمرنگ مشاهده می‌شوند.

رنگ رتیکولین^[24] که با نام رنگ الاستین نیز شناخته می‌شود یک رنگ نقره (Silver) است که برای نشان دادن الیاف رتیکولین استفاده می‌شود (بیشتر در بافت پیوندی) و نمونه را به صورت آبی یا سیاه رنگ‌آمیزی می‌کند.

به کمک رنگ ون گیسون^[26] الیاف الاستیک موجود در بافت همبند قابل مشاهده می‌شوند. این رنگ در نشان دادن تغییرات پاتولوژیک در الیاف الاستیک، مانند شکستگی یا شکاف که ممکن است در اثر واسکولیت یا اختلالات بافت همبند مانند سندرم مارفان ایجاد شود، مفید است.

با استفاده از این رنگ، الیاف الاستیک آبی تا سیاه،کلاژن قرمز و مابقی اجزای بافت همبند زرد دیده می‌شوند.

رنگ روغن قرمز Oء^[25] ، یک رنگ محلول در چربی است که برای رنگ‌آمیزی تری گلیسیریدها و چربی‌های خنثی به رنگ قرمز روشن استفاده می‌شود.

رنگ کریستال ویوله^[27] امکان شناسایی ماده Nissl و میلین آکسون^[28] را در بافت عصبی فراهم می‌کند.

نکاتی برای استفاده‌ی بهتر از رنگ‌های خاص

امروزه تشخیص بیماری‌های مختلف مانند انواع سرطان‌ها اهمیت زیادی یافته است. استفاده از تکنیک‌های رنگ‌آمیزی یکی از راه‌های اصلی تشخیص انواع بیماری‌ها است. به همین دلیل کمک به بهبود کیفیت رنگ آمیزی در آزمایشگاه‌های پاتولوژی از اهمیت بالایی برخوردار است. در این قسمت از مقاله قصد داریم نکاتی را بیان کنیم که می‌توانند در بهبود کیفیت رنگ‌آمیزی بافت موثر باشند.

1- رنگ‌ها و کاربرد آن‌ها را بشناسید.

هنگام استفاده از یک رنگ، بدانید که قصد نشان دادن چه چیزی را دارید. اینکه تنها از مراحل صحیح رنگ‌آمیزی پیروی کنید کافی نیست. در واقع عدم آگاهی نسبت به آنچه در انتهای رنگ‌آمیزی دیده می‌شود، منجر به نتایج ضعیف خواهد شد.

2- به وجود نمونه روی لام توجه کنید.

پیش از رنگ‌آمیزی مطمئن شوید که لام حتما حاوی ساختار یا ماده‌ای باشد که قصد بررسی آن را دارید. اگر ساختار یا ماده به درستی روی لام قرار نگرفته باشد، ممکن است رنگ ‌آمیزی و عدم مشاهده ساختار مورد نظر باعث تشخیص نادرست گردد.

3- زمان‌بندی دقیق را رعایت کنید.

در پروسه رنگ‌آمیزی یک نمونه، انجام هر مرحله نیاز به زمان‌بندی خاصی دارد. به طور مثال ممکن است برخی رنگ‌ها 30 ثانیه روی لام باقی بمانند و برخی نیز برای رنگ‌کردن ساختار یک بافت به مدت زمان بیشتری نیاز داشته باشند. بنابراین هنگام رنگ‌آمیزی حتما زمان‌بندی صحیح را رعایت کنید.

4- میزان پایداری معرف را در نظر بگیرید.

برخی از معرف‌ها یا محلول‌های رنگ‌‌آمیزی به آرامی خراب می‌شوند و تا مدت‌ها پس از آماده‌سازی قابل استفاده هستند. در حالی که برخی دیگر بسیار ناپایدار هستند و باید بلافاصله پس از آماده‌سازی مصرف شوند. بنابراین پیش از رنگ‌آمیزی از ماندگاری معرف‌هایی که استفاده می‌کنید آگاه باشید.

همچنین معرف‌ها را در محل مناسب ذخیره کنید. توجه داشته باشید که نیاز است بعضی معرف‌ها در یخچال نگهداری شوند تا کپک و قارچ در آن‌ها رشد نکند. برخی معرف‌ها نیز ممکن است به نور حساس باشند و نیاز باشد آن‌ها را در محیطی تاریک نگهداری کرد.

5- از تکنیک صحیح استفاده کنید.

برای استفاده از هر نوع رنگ خاص، یک روش رنگ‌آمیزی وجود دارد. دقت داشته باشید که هنگام استفاده، پروتکل‌ها را دقیقاً دنبال کنید.

توجه داشته باشید هر چیزی که مشاهده می‌کنید را باید به دقت ثبت کنید.

روش شستن لام نیز از اهمیت زیادی برخوردار است زیرا شست‌وشوی نامناسب می‌تواند نتایج را تغییر دهد.

6- میکروسکوپ را به‌طور صحیح تنظیم کنید.

از تأثیر تنظیم صحیح میکروسکوپ در بررسی نمونه غافل نشوید. توجه داشته باشید که برای مشاهده برخی نمونه‌ها لازم است تا از تکنیک‌های مختلفی مانند ایمرسیون استفاده کنید.

 7- از تجهیزات مناسب استفاده کنید.

امروزه به منظور تسهیل فرایند رنگ‌آمیزی بافت تجهیزات مناسبی تولید و به بازار عرضه می‌شود. بنابراین حین فرایند رنگ‌‌آمیزی سعی کنید از تجهیزات مناسب استفاده کنید. به طور مثال ست‌ها و سینی‌های مخصوص رنگ‌آمیزی قابلیت شست و شو و رنگ‌آمیزی لام را آسانتر کرده و می‌توانند در افزایش سرعت کاربر نیز موثر باشند.

جمع‌بندی

همانطور که گفته شد، تکنیک‌های رنگ‌آمیزی روش‌های رایج و پرکاربرد برای بررسی بافت و یا ساختار میکروارگانیسم‌ها در آزمایشگاه‌های پاتولوژی محسوب می‌شوند. این تکنیک‌های رنگ‌آمیزی را به طور کلی می‌توان در دو گروه جای داد. رنگ‌آمیزی روتین و رنگ‌آمیزی خاص.

رنگ‌آمیزی به روش هماتوکسلین-ائوزین تکنیک روتینِ رنگ‌آمیزی در آزمایشگاه‌ها است که برای بررسی اغلب بافت‌ها کاربرد دارد. اما زمانی که این تکنیک موثر واقع نگردد، محققین به سراغ رنگ‌هایی می‌روند که در دسته‌ی رنگ‌های خاص جای می‌گیرد.

در این مقاله سعی کردیم تا مروری بر این دو گروه رنگ رایج در آزمایشگاه‌های پاتولوژی داشته و برخی از رایج‌ترین رنگ‌های خاص را نیز با ذکر کاربردشان بیان کنیم.

امیدواریم این مقاله مورد توجه شما قرار گرفته باشد.

از آنجایی که تکنیک‌های رنگ‌آمیزی بسیار رایج هستند، خوشحال می‌شویم که نظرات و تجربیات خود را در رابطه با هر یک از این تکنیک‌ها با ما به اشتراک بگذارید.

واژه‌نامه: