فنیل اتیل الکل آگار: ترکیبات، آماده‌سازی و موارد استفاده

محیط کشت، ترکیبی از مواد از پیش تعریف شده است که از رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها در یک محیط مصنوعی یا آزمایشگاهی پشتیبانی می‌کند. محیط کشت‌ها اغلب برای جداسازی ارگانیسم‌ها از نمونه‌های مختلف مانند نمونه‌های بالینی، غذا یا محیط مورد استفاده قرار می‌گیرند.

بر اساس قوام، محیط‌ کشت‌ها به صورت جامد، نیمه جامد و مایع (آبگوشت) دسته بندی می‌شوند و از لحاظ عملکردی نیز می‌توان آن‌ها را به صورت افتراقی، انتخابی، غنی شده و انتقالی طبقه‌بندی کرد.

پیش‌تر در مقاله‌ای با عنوان ” محیط کشت‌، ابزاری با ارزش در میکروبیولوژی ” به معرفی محیط کشت‌ها پرداختیم. در این مقاله قصد داریم تا در رابطه با فنیل اتیل الکل آگار (Phenylethyl alcohol agar) که نوعی محیط کشت است اطلاعاتی ارائه کنیم.

فنیل اتیل الکل آگار چه زمانی مورد استفاده قرار می‌گیرد؟

فنیل اتیل الکل آگار (PEA) یک محیط انتخابی است که برای کشت ارگانیسم‌های گرم مثبت، به‌ویژه کوکسی‌ها (cocci)، از نمونه حاوی مخلوطی از عوامل بیماری‌زا استفاده می‌شود. ماده فعال در فنیل اتیل الکل با تداخل در سنتز DNA، رشد ارگانیسم‌های گرم منفی را مهار کرده و یا کاهش می‌دهد و در عین حال رشد کوکسی‌های گرم مثبت را امکان پذیر می‌کند. به‌طور مثال استافیلوکوکوس اورئوس که یک ارگانیسم گرم مثبت است، در فنیل اتیل الکل آگار رشد می‌کند در حالی که سراشیا مارسسنس (Serratia marcescens) که ارگانیسمی گرم منفی است در این محیط کشت رشد نمی‌کند.

فنیل اتیل الکل آگار حاوی موادی است که نفوذپذیری غشای باکتری‌های گرم منفی را تغییر می‌دهد و منجر به نشت مقادیر زیادی پتاسیم سلولی می‌شود که در نهایت اختلال یا مهار سنتز DNA باکتری‌های گرم منفی را به دنبال دارد.

به طور کلی می‌توان گفت فنیل اتیل الکل آگار در موارد زیر کاربرد دارد:

• اگر منبع نمونه حاوی مخلوطی از عوامل بیماری زا باشد (به عنوان مثال، نمونه‌ی دستگاه گوارش یا مایع صفاقی) و رنگ‌آمیزی گرم نشان دهد این نمونه حاوی باکتری‌های گرم منفی است. در چنین شرایطی فنیل اتیل الکل آگار باکتری‌های گرم منفی و به طور خاص گونه پروتئوس، را در نمونه‌های حاوی فلور باکتری مخلوط مهار می‌کند.
• فنیل اتیل الکل آگار برای رشد انتخابی استافیلوکوکوس و استرپتوکوکوس در نمونه‌های مخلوط استفاده می‌شود.
• آگار PEA با 5٪ خون گوسفند برای جداسازی بهتر باکتری‌های بی‌هوازی گرم مثبت و گرم منفی از نمونه‌های روده‌ای استفاده می‌شود. به این صورت که باکتری‌های گرم منفی اختیاری را مهار کرده و از تجمع بیش از حد پروتئوس و کلستریدیوم سپتیکوم جلوگیری می‌کند.

ترکیبات فنیل اتیل الکل آگار

محیط کشت فنیل اتیل الکل آگار را می توان به عنوان پودر مخلوط شده از تامین کنندگان خریداری کرد و سپس برای تهیه پلیت‌ حاوی این آگار دستورالعمل های سازنده را دنبال نمود.

 این محیط کشت به صورت پلیت‌های حاوی آگار پیش ساخته نیز قابل خریداری است.

جدول 1. ترکیبات فنیل اتیل الکل آگار

pH نهایی در دمای 25 درجه سانتی‌گراد : 0.2 ± 7.3

نحوه آماده‌سازی محیط کشت

جهت تقویت رشد باکتری‌های بی‌هوازی، ممکن است مکمل خون گوسفند 5٪ به محیط پایه آگار فنیل اتیل الکل (PEA) اضافه شود.

برای تهیه آگار مراحل زیر را طی کنید:

1. مواد را در یک لیتر آب مقطر تعلیق و کاملاً مخلوط کنید.
2. مواد را روی حرارت ملایم مخلوط کنید و به مدت 1 دقیقه بجوشانید تا کاملاً حل شود.
3. محلول آماده شده را به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی‌گراد اتوکلاو کنید.
4. اجازه دهید محلول سرد شود و حدودا به دمای 45 درجه سانتی‌گراد برسد.
5. با استفاده از تکنیک آسپتیک خون گوسفند استریل 5 % را به محلول اضافه کرده و کاملا مخلوط کنید.
6. محیط کشت ذوب شده را درون پتری دیش استریل ریخته (تقریباً 20 تا 30 میلی لیتر در هر پتری دیش) و اجازه دهید تا جامد شود.

جدول 2. مقایسه فنیل اتیل الکل آگار حاوی خون گوسفندی و فاقد آن

نکته: محیط کشت نگهداری شده در یخچال را باید قبل از تلقیح برای مدتی در محیط آزمایش قرار داد تا به دمای اتاق برسد.

بسته به اهداف مطالعه، با استفاده از روش کشت خطی یا هر روش دیگر، کشت میکروارگانیسم مورد نظر خود را به سطح آگار منتقل کنید.

انکوباسیون ارگانیسم‌ها روی فنیل اتیل الکل آگار

پس از کشت ارگانیسم روی فنیل اتیل الکل آگار، آن را به مدت 24 تا 48 ساعت در دمای 2 ± 35 درجه سانتی گراد انکوباسیون کنید. بسته به اهداف مطالعه، پتری دیش‌های حاوی فنیل اتیل الکل آگار  به همراه خون را می توان در جو هوازی (aerobic)، بی هوازی (anaerobic) و 5٪ CO₂ انکوباسیون کرد. انکوباسیون در جو CO₂ بالا امکان شناسایی باکتری‌هایی را فراهم می‌کند که به غلظت CO₂ نیاز دارند و همچنین باعث رشد بهتر سایر عوامل بیماری‌زا نیز می‌شود.

تفسیر نتایج

پس از انکوباسیون مناسب، رشد باکتری‌ها به صورت کلنی در سطح آگار قابل مشاهده خواهد بود. باکتری‌های گرم مثبت رشد خوبی را نشان می‌دهند در حالی که اکثر باکتری‌های گرم منفی رشد نمی‌کنند یا رشد آن‌ها تا حد زیادی مهار می‌شود.

پاسخ رشد برخی از باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی روی فنیل اتیل الکل آگار

همانطور که گفته شد فنیل اتیل الکل آگار برای کشت ارگانیسم‌های گرم مثبت محیط مناسبی است. اما تمامی میکروارگانیسم‌ها در یک محیط کشت به یک نسبت رشد نمی‌کنند. جدول 3 پاسخ رشد برخی از باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی را روی این آگار نشان می‌دهد.

جدول 3. پاسخ رشد ارگانیسم‌ها در فنیل اتیل الکل آگار

نکات مهم

حین استفاده از فنیل اتیل الکل آگار باید به این نکته توجه داشت که استفاده از این آگار 100% باعث تمایز باکتری‌های گرم مثبت نخواهد شد و همواره درصدی از خطا وجود دارد. به طور مثال:

برخی از کوکسی‌های گرم مثبت ممکن است حین استفاده از فنیل اتیل الکل آگار کمی مهار شوند و بسیاری از آن‌ها نیز برای دیده شدن و رشد کافی به 48 ساعت انکوباسیون احتیاج دارند.

همچنین سودوموناس آئروژینوزا که یک باکتری گرم منفی است، در این محیط مهار نمی‌شود. برخی اوقات نیز ممکن است گونه‌هایی از  باکتری‌های گرم منفی کلنی‌های کوچکی روی آگار ایجاد کنند اما اغلب در ربع اول روی آگار کاهش می‌یابند.

جمع‌بندی

همانطور که در قسمت مقدمه نیز گفته شد، محیط کشت ترکیبی از مواد از پیش تعریف شده است که به کمک آن می‌توان میکروارگانیسم‌ها را در یک محیط مصنوعی یا آزمایشگاهی رشد داد. فنیل اتیل الکل آگار یکی از انواع محیط کشت انتخابی یا سلکتیو است که به مشاهده‌ی ارگانیسم‌های گرم مثبت در یک نمونه حاوی مخلوطی از ارگانیسم‌ها کمک می‌کند. در این مطلب سعی کردیم تا اطلاعاتی دررابطه با این محیط کشت بیان کنیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.