لژیونلا، عفونتی خطرناک در آب آشامیدنی

لوله‌های آبی که به طور مرتب استفاده نمی‌شوند، منبعی برای تجمع باکتری و آلودگی آب خواهند بود. لژیونلا (Legionella)، انتروکوکوس (Enterococcus) و سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomonas aeruginosa) را می‌توان از خطرناک‌ترین باکتری‌های موجود در آب آشامیدنی محسوب کرد. این باکتری‌های گرم منفی و میله‌ای شکل آبزی هستند و به عنوان پاتوژن‌های بالقوه انسانی در نظر گرفته می‌شوند.

آلودگی آب توسط این گونه‌های باکتریایی در گذشته وجود داشت. اما امروزه با توجه به شرایط شیوع کرونا و بسته بودن بسیاری از مراکز مانند هتل‌ها و محیط‌های اداری، این مشکل بیش از پیش مورد اهمیت قرار گرفته است.

در این مطلب قصد داریم به بررسی باکتری لژیونلا در آب آشامیدنی و نحوه تشخیص آن بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

آشنایی بیشتر با باکتری لژیونلا

از بین گونه‌های لژیونلا، گونه‌ی Legionella pneumophila  بیشترین میزان بیماری‌زایی را در انسان دارد. این باکتری سبب بروز بیماری لژیونر (لژیونلوز^[1]) می‌شود. لژیونلوز نوعی ذات الریه شدید است که در صورت عدم درمان کشنده خواهد بود. البته نوع خفیف‌تری از این بیماری نیز وجود دارد که با نام تب پونتیاک (Pontiac fever) شناخته می‌شود و شبیه آنفولانزا است.

 عفونت ناشی از باکتری لژیونلا زمانی رخ می‌دهد که آب آلوده (به شکل آئروسل) استنشاق شده و وارد ریه‌ها می‌شود. به عنوان مثال هنگام دوش گرفتن یا از طریق سیستم تهویه مطبوع.

علائم ابتلا به عفونت لژیونلا

پیش از اینکه به سراغ روش‌های تشخیص و شناسایی باکتری لژیونلا برویم، بهتر است به این موضوع اشاره کنیم که این باکتری تا چه حد می‌تواند خطرناک باشد. چنانچه فردی در معرض باکتری لژیونلا قرار گیرد، معمولا طی 2 الی 10 روز علائم زیر را تجربه خواهد کرد:

• سردرد
• درد عضلانی
• لرز
• تب 104 فارنهایت (40درجه سانتی‌گراد) یا بالاتر
• خستگی
• سرفه
• مشکل در تنفس
• درد قفسه سینه
• تهوع و استفراغ
• اسهال
• تغییرات در وضعیت روحی

همانطور که گفته شد، باکتری لژیونلا باعث بروز بیماری خفیف‌تری به نام تب پونتیاک نیز می‌شود. وجه تمایز تب پونتیاک با بیماری لژیونلوز عبارتند از:

• تب پونتیاک یک بیماری خفیف شبیه آنفولانزا است که شدت آن بسیار کمتر از لژیونر است.
• علائم تنفسی تحتانی مانند سرفه ایجاد نمی‌کند.
• علائم تب پونتیاک معمولاً 24 تا 72 ساعت پس از تماس با باکتری شروع می شود. اما بروز علائم لژیونلوز ممکن است تا 2 هفته طول بکشد.
• تب پونتیاک بدون درمان، اغلب در عرض 3 تا 5 روز، خود به خود از بین می‌رود. اما بیماری لژیونلوز در صورت عدم درمان ممکن است خطر مرگ را برای بیمار به دنبال داشته باشد.

تشخیص باکتری لژیونلا در نمونه آب

لژیونلا در صورت عدم گردش آب در لوله‌ها و مخازن رشد می‌کند و در دمای بین 25 تا 50 درجه سانتی گراد تکثیر می‌شود. به منظور جلوگیری از ایجاد مشکل لژیونلا در لوله‌های آب استفاده نشده، نباید از تعمیر و نگهداری لوله‌ها غافل شد. بنابراین توصیه می‌شود حداقل هفته‌ای یک‌بار اجازه دهید آب از تمام نقاط شیر عبور کند و به صورت دوره‌ای آب لوله‌کشی را آزمایش کنید تا از سلامت آن مطمئن شوید.

جهت تشخیص باکتری لژیونلا در آب، آزمایش‌های میکروبیولوژیکی سنتی مبتنی بر محیط کشت کاربرد دارد. اما آزمایشگاه‌ها می‌توانند از روش‌های بیولوژیکی مولکولی مانند PCR نیز برای تشخیص این باکتری استفاده کنند. در ادامه به بررسی تکنیک‌های تشخیص باکتری لژیونلا در نمونه آب خواهیم پرداخت.

۱. جمع‌آوری نمونه

جهت تشخیص باکتری لژیونلا توصیه می‌شود یک لیتر آب از محل مورد نظر جمع‌آوری گردد. گاهی اوقات برای شناسایی لژیونلا در آبی که غلظت بسیار کمی از این باکتری‌ها دارد، مانند منابع آب شهری، به حجم بیشتری آب (1 تا 10 لیتر) نیاز است. اما اگر نمی‌توان یک لیتر از منبع نمونه جمع آوری کرد، حجم کمتری قابل قبول است. نمونه‌های آب باید در یک بطری پلاستیکی پلی‌پروپیلنی استریل جمع آوری شوند. اگر منبع آب اخیراً با کلر تصفیه شده است، 0/5 میلی لیتر سدیم تیوسولفات 0/1  نرمالیته (0.1N sodium thiosulfate) را به هر نمونه 1 لیتری اضافه کنید تا ماده ضد عفونی کننده خنثی شود.

تمام نمونه‌ها باید در ظروف حمل مناسب به آزمایشگاه منتقل شوند تا از سرما و یا گرمای زیاد محیط محافظت شوند. اگر این احتمال وجود دارد که نمونه ظرف 72 ساعت به آزمایشگاه نرسد،  باید قبل از ارسال در یخچال نگهداری شود. همچنین نمونه هایی که به آزمایشگاه می‌رسند اما ظرف 72 ساعت پس از جمع آوری، امکان پردازش آن‌ها وجود ندارد نیز باید در یخچال نگهداری شوند.

۲. روش سنتی تشخیص لژیونلا- محیط کشت

لژیونلا معمولاً با فیلتراسیون و سپس عملیات حرارتی یا اسیدی از آب جدا می‌شود.

گونه‌های لژیونلا برای رشد نیازمند نوعی اسید آمینه به نام ال سیستئین (L-cysteine) هستند.

جهت تشخیص لژیونلا، نمونه آب در آگار BCYE (عصاره مخمر زغال چوب بافر ^[2]) کشت داده می‌شوند.

اگرچه اکثر گونه‌های لژیونلا به راحتی در BCYE رشد می‌کنند، اما برخی برای افزایش رشد نیاز به مکمل با آلبومین سرم گاوی دارند. مانند Legionella micdadei و چندین گونه از Legionella bozemanii .

جهت بررسی و تشخیص گونه‌های لژیونلا در نمونه آب از 4 محیط کشت زیر استفاده می‌شود:

• عصاره مخمر زغال چوب بافر: به عنوان محیط کشت پایه
• محیط کشت PCV : حاوی پلی میکسین Bء^[3]، سیکلوهگزیماید^[4]، و وانکومایسین ^[5]
• محیط کشتGPCV : همان محیط PCV که شامل اسید آمینه گلیسین^[6] نیز می‌باشد.
• PCV بدون ال سیستئین [PCV(-)] : به عنوان یک محیط کنترل منفی استفاده می‌شود.

۳. غنی سازی حرارتی

به کمک غنی‌سازی حرارتی (Heat Enrichment) می‌توان تشخیص لژیونلا را بهبود بخشید.

 این روش مبتنی بر این یافته است که بسیاری از نمونه‌های آب حاوی تک یاخته‌هایی هستند که می‌توانند به عنوان میزبان برای تکثیر درون سلولی لژیونلا عمل کنند.

به همین دلیل انکوباسیون نمونه اولیه در دمای 35 درجه سانتی گراد به لژیونلا اجازه می‌دهد در این تک یاخته‌ها تکثیر شوند و به غلظت قابل کشت برسند.

۴. اسیدکاری

لژیونلاها نسبت به سایر باکتری‌های آب شیرین در برابر pH پایین مقاوم هستند. به همین دلیل برای کاهش تعداد باکتری‌های قبل از کشت در برخی از نمونه‌های آب با غلظت بالای باکتری، می‌توان از اسیدکاری نمونه استفاده نمود.

• 1 میلی لیتر از سوسپانسیون نمونه را در یک لوله سانتریفیوژ استریل 15 میلی لیتری حاوی 1 میلی‌لیتر بافر اسید قرار داده و مخلوط کنید.
• سوسپانسیون اسیدی شده را به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
• در صورت رشد بیش از حد نمونه در پلیت‌ها پس از 15 دقیقه، اسیدکاری را می توان تا 30 دقیقه افزایش داد.

۵. تهیه نمونه برای آزمایش باکتریولوژیک

الف) آب تصفیه (آب آشامیدنی)

جهت آماده سازی نمونه آب شرب برای آزمایش تشخیص لژیونلا، لازم است نمونه‌ها در یک قیف فیلتر استریل 47 میلی متری حاوی فیلتر پلی کربنات 0.2 میکرومتری ریخته شوند. این کار که به غلیظ شدن نمونه کمک می‌کند، باید زیر هود بیولوژیکی انجام شود. هنگامی که نمونه از صافی عبور کرد، فیلتر با استفاده از پنس استریل از نگهدارنده خارج می‌شود و در یک لوله سانتریفیوژ 50 میلی‌لیتری استریل حاوی 5 میلی لیتر آب استریل قرار می‌گیرد. سپس لوله به مدت یک دقیقه سانتریفیوژ می‌شود تا باکتری‌ها و مواد آلی از فیلتر آزاد شود. (جهت سانتریفیوژ کردن نمونه به پروتکل‌های آزمایشگاه خود مراجعه کنید.)

پس از سانتریفیوژ کردن و تغلیظ نمونه، 0/1 میلی‌لیتر از آن را در پلیت‌های حاوی 4 محیط کشت مذکور تلقیح کنید. از روش کشت خطی استفاده نمایید.

پلیت‌ها را در دمای 35 درجه سانتیگراد در یک انکوباتور مرطوب با اتمسفر 2/5 درصد CO2 انکوباسیون کنید.

باقیمانده نمونه را می‌توانید در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید.

ب) کشت مستقیم (آب غیر قابل شرب)

آب غیر شرب به ندرت نیاز به تغلیظ دارد و می‌تواند مستقیماً پردازش شود. نمونه‌هایی که دارای غلظت بالایی از باکتری‌ها هستند، می‌توانند با یک بافر با pH پایین رقیق شوند و یا از روش رقت سریالی برای رقیق کردن آن‌ها استفاده نمود (با استفاده از آب لوله کشی استریل بدون کلر). به این ترتیب جداسازی اولیه لژیونلا آسان‌تر خواهد بود.

جهت تشخیص باکتری لژیونلا در آب غیرشرب، 0/1 میلی لیتر از نمونه را روی پلیت حاوی آگار به روش کشت خطی، قرار دهید.

پلیت‌ها را در دمای 35 درجه سانتیگراد در یک انکوباتور مرطوب با اتمسفر 2/5 درصد CO2 انکوباسیون کنید.

بررسی محیط کشت برای لژیونلا

• پس از 72 الی 96 ساعت انکوباسیون، تمامی کشت‌ها را بررسی کنید.
• کلنی‌های باکتری لژیونلا محدب و گرد با لبه‌های کامل هستند. مرکز کلنی معمولاً به رنگ سفید روشن است. با بررسی بیشتر پلیت با نور فرابنفش موج بلند می‌توان به راحتی کلنی‌های باکتری لژیونلا را تشخیص داد.
• هر کلنی مشکوک را به صورت آسپتیک روی پلیت آگار BCYE بدون ال سیستئین قرار دهید.
• 2 الی4 کلنی نماینده از هر نمونه آب انتخاب کنید.
• کلنی را تلقیح کنید و پلیت‌ها را به مدت 24 ساعت انکوبه کنید.
• اگر بعد از 24 ساعت رشدی مشاهده نشد، انکوباسیون را برای 24 ساعت دیگر ادامه دهید.
• کلنی‌هایی که روی آگار BCYE رشد می‌کنند، اما در آگار بدون ال سیستئین رشد ندارند، گونه‌های احتمالی لژیونلا هستند و باید برای شناسایی قطعی با استفاده از آنتی‌بادی فلورسنت مستقیم^[7] (DFA) یا آزمایش آگلوتیناسیون اسلاید^[8] (SAT) بررسی شوند.
• از آنجایی که لژیونلا یک باکتری نسبتاً کند رشد است، پلیت های منفی باید تا 7 روز پس از تلقیح مجدد انکوبه شوند و سپس مجدداً بررسی شوند.
• بعد از روز هفتم می‌توانید پلیت‌ها را دفع کنید.

روش جدید تشخیص لژیونلا

فناوری‌های مختلفی وجود دارند که امروزه به عنوان جایگزینی برای کشت لژیونلا در آگار مورد استفاده قرار می‌گیرند. به عنوان مثال، برهمکنش‌های آنتی‌بادی/آنتی ژن با استفاده از روش‌های ایمونواسی فلورسنت مستقیم یا غیرمستقیم و یا روش‌های مولکولی مانند PCR.

گاهی اوقات ترکیبی از این تکنیک‌ها برای ارائه نتایج سریع‌تر مورد استفاده قرار می‌گیرد.

جمع‌بندی

همانطور که گفته شد باکتری لژیونلا نوعی ارگانیسم بیماری‌زا برای انسان است که در آب آشامیدنی و یا غیر شرب یافت می‌شود و لوله‌های آب زیستگاه اصلی این میکروارگانیسم به شمار می‌روند.

گونه‌های لژیونلا سبب بروز بیماری تنفسی در انسان شده و در صورت عدم تشخیص و درمان می‌توانند خطر مرگ را به دنبال داشته باشند.

از آنجایی که نحوه انتقال این باکتری به انسان بسیار راحت و تنها از طریق آئروسل موجود در آب (حین آشامیدن آب، دوش گرفتن و یا آب بازی) صورت می‌گیرد، تشخیص آن در نمونه آب از اهمیت بالایی برخوردار است.

این گونه‌های باکتریایی پس از کشت به صورت کلنی‌هایی سفید و محدب با مرکز روشن قابل تشخیص هستند. در این مطلب سعی کردیم به معرفی این باکتری و روش تشخیص آن بپردازیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.

واژه نامه