محیط کشت‌، ابزاری با ارزش در میکروبیولوژی

محیط کشت‌های آزمایشگاهی محیط‌های جامد، نیمه جامد و یا مایع هستند که حاوی مواد مغذی برای رشد میکروارگانیسم‌های مختلف بوده و شرایط لازم برای رشد آن‌ها را فراهم می‌کنند. میکروارگانیسم‌های مختلف برای رشد نیاز به شرایط مختلفی نسبت به یکدیگر دارند. به همین دلیل برای رشد آن‌ها نیز از محیط کشت‌های مختلفی استفاده می‌شود. محیط کشت اولیه برای میکروب‌شناسی بالینی به ۳ دسته اصلی تقسیم می‌شود. محیط‌های مغذی (nutritive)، افتراقی(differential) و انتخابی یا سلکتیو (selective). در این مقاله قصد داریم مروری بر این سه نوع محیط کشت داشته و مثال‌هایی از آن‌ها را نیز بیان کنیم. پس اگر کنجکاو هستید بدانید چه محیط کشتی برای رشد میکروارگانیسم‌های مورد نظر شما مناسب است، در ادامه با ما همراه باشید.

محیط کشت مغذی، افتراقی و سلکتیو

پیش از اینکه به سراغ معرفی محیط کشت مغذی، افتراقی و سلکتیو برویم، اجازه دهید مروری بر دلیل استفاده از محیط کشت‌ها داشته باشیم. همانطور که در قسمت مقدمه نیز گفته شد، محیط کشت‌ها شرایط رشد میکروارگانیسم‌های مختلف را ایجاد می‌کنند. در حقیقت اصول استفاده از محیط کشت این است که مواد مغذی و شرایط کشت به گونه‌ای کنترل شوند تا دمای خاص، هوا، نور و pH  لازم برای رشد یک ارگانیسم فراهم شود و به این ترتیب عوامل بیماری‌زا که در نمونه وجود دارند، غنی شده و میزان آن‌ها افزایش یابد.

۱. محیط کشت مغذی

محیط کشت مغذی در واقع به محیطی اطلاق می‌شود که از رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌های مختلف، بدون تمایز جنس یا گونه، پشتیبانی می‌کند.

۲. محیط کشت سلکتیو

محیط کشت‌های سلکیتو یا انتخابی، همانطور که از نامشان پیداست، محیط‌هایی هستند که تنها برای رشد میکروارگانیسم‌های خاصی استفاده می‌شوند. به این صورت که بسته به کاربرد و نوع ارگانیسم مورد نظر، به این محیط کشت‌ها موادی افزوده می‌شود که از رشد دیگر ارگانیسم‌های موجود در یک نمونه جلوگیری می‌کند. به‌طور مثال:

• افزودن آنتی بیوتیک
• اسیدهای آمینه
• افزودن رنگ‌های آزمایشگاهی و نشانگرهای رنگ مانند ائوزین متیلن بلو ^[۱] (EMB)

۳. محیط کشت افتراقی

محیط کشت‌های افتراقی به چندین نوع مختلف باکتری اجازه رشد می دهند، اما حاوی ترکیباتی هستند که به جنس میکروبی (یا حتی گونه‌ها) اجازه می‌دهند از نظر بصری متفاوت گردند.

به این ترتیب ارگانیسم یا گونه‌ی مورد نظر با ترکیبات اضافه شده (به عنوان مثال قندها) واکنش می‌دهد و این امر باعث می‌شود تا از نظر بصری در میان سایر انواع باکتری‌های موجود در یک پلیت متمایز شود. استفاده از محیط کشت افتراقی امکان شناسایی سریع موجودات مورد نظر محققین را فراهم می‌کندکه برای بررسی محیط‌های بسیار مخلوط مانند مدفوع بسیار اهمیت دارد.

برخی اوقات در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی، محققین از ترکیب ویژگی‌های انتخابی و افتراقی محیط کشت‌ها استفاده کرده و یک محیط کشت با هر دو ویژگی آماده می‌کنند. به طور مثال مانیتول سالت آگار (mannitol salt agar) یک محیط کشت انتخابی برای انتخاب استافیلوکوکوس است. اما به کمک آن می‌توان گونه‌های استافیلوکوک اورئوس ^[۲] (بر اثر تخمیر مانیتول) و یا استافیلوکوک اپیدرمیس ^[۳] (در صورت عدم تخمیر مانیتول) را نیز مشخص نمود.

مزایای استفاده از محیط کشت‌های انتخابی و افتراقی

با پیشرفت علم در حوزه میکروبیولوژی از دهه ۱۹۷۰ میلادی، تکنیک‌های جدید در تشخیص مولکولی از جمله PCR ، تعیین توالی DNA و متاژنومیکس ^[۴] ممکن است برخی از میکروبیولوژیست‌ها گمان کنند که این تکنیک‌ها برتر از تکنیک‌های سنتی و استفاده از محیط کشت‌ها هستند.  اما باید به خاطر داشت که با وجود پیشرفت روز افزون ابزارهای تشخیصی مولکولی، استفاده از محیط کشت‌های افتراقی و انتخابی، همچنان دارای مزایای خاصی است که در ادامه به برخی از آن‌ها اشاره خواهیم کرد.

۱. یکی از مزایای آشکار استفاده از محیط کشت در آزمایشگاه‌ها، هزینه‌ی انجام یک آزمایش است. آزمایش تشخیصی مولکولی برای تفسیر نتایج به معرف‌های گران‌قیمت (به عنوان مثال آنزیم‌ها)، اتوماسیون اختصاصی یا تجهیزات نیمه خودکار، نرم افزار و حتی گاهی افراد متخصص نیاز دارند. درحالی‌که استفاده از محیط کشت هزینه کمتری داشته و یک استاندارد در حوزه‌ی آزمایشگاهی و میکروب شناسی بالینی محسوب می‌شود.

۲. علاوه‎ بر این، ممکن است تکنیک‌های مولکولی در برخی موارد به اندازه محیط کشت‌ها حساس نباشند. به‌عنوان مثال، آغازگرهای متاژنومیک، حساسیت لازم برای تشخیص گونه‌های موجود در  مدفوع که غلظت آن‌ها بیش از غلظت ۱۰۵ باکتری در هر گرم است را ندارند.

۳. همچنین استفاده از محیط‌های کشت امکان جداسازی کلنی‌های خالص باکتری‌ها را فراهم می‌کند، که برای برخی از روش‌های میکروبیولوژیکی (به عنوان مثال، تست حساسیت، آزمایش بیوشیمیایی و نمونه‌سازی) اهمیت بسیار بالایی دارند.

۴. علاوه‌براین تکنیک‌های مولکولی گرچه ابزاری بسیار قدرتمند در تقویت DNA هستند، اما نمی‌توانند بین باکتری‌های زنده از باکتری‌های گذرا (transient bacteria) یا مرده تمایز قائل شوند. به همین دلیل، محیط کشت‌های افتراقی و انتخابی ابزار مهمی در آزمایشگاه میکروب‌شناسی بالینی محسوب می‌شوند.

آشنایی با برخی از محیط کشت‌های پرکاربرد در میکروبیولوژی

در ادامه چندین مثال از محیط کشت‌های باکتریولوژیکی پرکاربرد در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی  و همچنین نمونه‌هایی با یک یا چند نوع باکتری که روی آن‌ها کشت شده است، را نشان خواهیم داد. این اطلاعات می‌تواند در شناسایی مقدماتی عوامل بیماری‌زا ارزشمند باشد. بنابراین اگر به باکتریولوژی و کاربرد محیط کشت در آن علاقه‌مند هستید، تصاویر زیر را به دقت بررسی کرده و مورفولوژی کلنی‌ها، رنگ‌ها و الگوهای رشد (یا عدم رشد) را مشاهده نمایید.

۱. تریپتیک سوی آگار Tryptic Soy Agar (TSA)

• نوع: عمومی
• هدف: کشت باکتری‌های غیر فستی دیوس (non-fastidious bacteria)
• تفسیر: رشد نشان دهنده وجود  باکتری‌های غیر فستی دیوس است

نمونه:

سودوموناس آئروژینوزا ^[۸]

به رنگ سبز آبی به دلیل تولید پیوسین (pyocins) توسط باکتری‌ها توجه کنید.

اشریشیا کلی ^[۷]

استافیلوکوکوس اورئوس ^[۵]

به رنگدانه کاروتنوئید ^[۶] معمولی استافیلوکوکوس اورئوس توجه کنید.

۲. چاکلت آگار Chocolate Agar

• نوع: غنی شده
• هدف: کشت ارگانیسم‌های فستی دیوس مانند نایسریا (Neisseria) یا هموفیلوس (Haemophilus sp.).
• تفسیر: برخی ارگانیسم‌ها که در محیط استاندارد رشد نمی‌کنند، روی چاکلت آگار رشد می‌کنند.

نمونه:

اشریشیا کلی

رشد کلنی‌های سفید مایل به خاکستری

نایسریا گونوره ^[۹]

کلنی‌های کوچکی که در بررسی دقیق شفاف به نظر می‌رسند.

استافیلوکوکوس اورئوس

رشد با کلنی‌های زرد رنگ

۳. مکانکی آگار MacConkey (lactose) Agar

• نوع: انتخابی و افتراقی
• هدف: حاوی نمک‌های صفراوی (bile salts) و بنفش کریستال (crystal violet) است که باکتری‌های گرم منفی روده را انتخاب کرده و تخمیر کننده‌های لاکتوز را از غیر تخمیر کننده‌ها متمایز می‌کند.
• تفسیر: کلنی های قرمز نشان دهنده تخمیر لاکتوز  و کلنی‌های سفید نشان‌دهنده عدم تخمیر لاکتوز است.

نمونه:

سالمونلا انتریتیدیس ^[۱۰]

کلنی‌های بی‌رنگ نشان می‌دهند که باکتری رشد کرده اما تخمیر لاکتوز وجود ندارد. محیط به دلیل افزایش pH در اثر تجزیه‌ی باکتریایی پپتون، کمی زرد است

نایسریا گونوره و استافیلوکوکوس اورئوس

نایسریا گونوره و استافیلوکوکوس اورئوس در مکانکی آگار رشد نمی‌کنند.

اشریشیا کلی

کلنی‌های قرمز و رسوب قرمز به دلیل تولید اسید در نتیجه‌ی تخمیر لاکتوز

۴. ائوزین متیلن بلو اگار Eosin-methylene Blue Agar (EMB)

• نوع: افتراقی (لاکتوز) و انتخابی (مهار رنگ و رسوب در pH اسیدی)
• هدف: تخمیر کننده‌های لاکتوز ( coli) را از غیر تخمیر کننده‌ها (سالمونلا، شیگلا) متمایز می‌کند
• تفسیر: تخمیر کننده‌های لاکتوز به رنگ  آبی / سیاه و غیر تخمیر کننده‌ها بی رنگ یا بنفش روشن مشاهده خواهند شد.

نمونه:

کلبسیلا پنومونیه ^[۱۱]

کلنی های موکوئیدی ^[۱۲] به دلیل تولید کپسول و مراکز تاریک به دلیل تخمیر لاکتوز به وجود آمده‌اند.

اشریشیا کلی

رنگ سبز براق به دلیل تخمیر لاکتوز است.

سالمونلا انتریتیدیس

کلنی‌های صورتی نشان دهنده عدم تخمیر لاکتوز است

۵. هکتون آگار Hektoen Agar

• نوع: انتخابی و افتراقی
• هدف: شناسایی تخمیر لاکتوز و تولید H₂S
• تفسیر: تخمیر کننده‌های لاکتوز به رنگ زرد یا مرجانی دیده می‌شوند. عدم تخمیر کلنی‌های بی رنگ و تولید   H₂S رسوب سیاه ایجاد می‌کند.

نمونه:

سالمونلا انتریتیدیس

کلنی‌های شفاف نشان دهنده عدم تخمیر لاکتوز و رسوب سیاه در مرکز کلنی‌ها به دلیل تولید H2S است.

اشریشیا کلی

رنگ مرجانی تولید اسید در نتیجه تخمیر لاکتوز را نشان می‌دهد.

۶. مانیتول سالت آگار Mannitol Salt Agar

• نوع: انتخابی و افتراقی
• هدف: برای استافیلوکوک انتخاب می‌شود که در غلظت های زیاد نمک رشد می‌کند. استافیلوکوکوس اورئوس را از سایر گونه‌های استافیلوکوک‌ متمایز می‌کند.
• تفسیر: استافیلوکوکوس اورئوس زرد است (مانیتول را تخمیر می‌کند)، سایر استافیلوکوک‌ها سفید هستند.

نمونه:

اشریشیا کلی

استرپتوکوک‌ها روی مانیتول سالت آگار رشد نمی‌کنند.

استافیلوکوکوس اورئوس

رنگ زرد در اثر تولید اسید حاصل از تخمیر مانیتول است.

استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس ^[۱۳]

باکتری رشد کرده اما تخمیر مانیتول اتفاق نیفتاده است.

۷. بلاد آگار از خون گوسفندی Sheep Blood Agar

• نوع: افتراقی و غنی شده
• هدف: انواع همولیز را تعیین می‌کند (به عنوان مثال ، α ، β ، γ)
• تفسیر:
  • α: حلقه سبز یا قهوه‌ای
  • β: منطقه وسیع
  • γ: غیر همولیتیک

نمونه:

اشریشیا کلی، γ همولیتیک

استرپتوکوک پیوژنز ^[۱۵]،   β  همولیتیک

استرپتوکوک پنومونیه ^[۱۴]، α همولیتیک

نمونه‌های استفاده از محیط کشت در میکروبیولوژی

در انتهای این مطلب قصد داریم مثال‌هایی را از کاربرد محیط کشت بیان کنیم.

مثال ۱

یک بیمار ۲۸ ساله در محل جراحی روی پای خود دچار قرمزی و درد شده و به اورژانس مراجعه نموده است. همچنین بیمار تب داشته و محل جراحی نیز عفونت کرده است. از محل عفونت نمونه‌برداری شده و نمونه برای کشت به آزمایشگاه میکروبیولوژی ارسال می‌شود. نمونه در بلاد آگار (تریپتیکاز سویا آگار غنی شده با ۵٪ خون گوسفند) کشت داده شد و پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون‌، کلنی‌های کوچک با منطقه وسیع همولیز در پلیت مشاهده گردید. بلاد آگار یک محیط کشت افتراقی است.

پس از بررسی پلیت پزشکان متوجه شدند که نمونه‌ی بیمار حاوی استرپتوکوک پیوژنز ^[۱۶] (استرپتوکوک گروه A) است. اگرچه برای تأیید شناسایی به آزمایشات اضافی نیاز بود اما وجود کلنی‌های کوچک مشخص با منطقه وسیع همولیز بتا از وجود S. pyogenes حکایت دارند و دانستن این امر به میکروبیولوژیست کمک می‌کند تا مراحل بعدی در شناسایی ارگانیسم را به بهترین شکل طی نماید.

مثال ۲

آزمایشگاه میکروبیولوژی کشت خون یک بیمار ۵۰ ساله با انواع بیماری‌های زمینه‌ای را دریافت می‌کند. نمونه خون روی محیط کشت‌های حاوی بلاد آگار ، مکانکی آگار  و  چاکلت آگار قرار گرفته و به مدت ۲۴ ساعت انکوباسیون می‌شود. در حالی که پلیت‌ها در دستگاه انکوباتور قرار دارند، پزشک با آزمایشگاه تماس گرفته و می‌گوید که تیم پزشکی در حال انتخاب مواد ضد میکروبی مناسب برای این بیمار هستند و مایلند در اسرع وقت بدانند که این ارگانیسم سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomonas aeruginosa) است یا خیر.

روز بعد، کلنی‌های صورتی رنگ در مکانکی آگار مشاهده ‌شدند. مکانکی آگار نمونه‌ای از محیط کشت افتراقی-انتخابی است. وقتی ارگانیسم‌ها لاکتوز را در محیط متابولیزه می‌کنند، آگار اطراف ارگانیسم اسیدی می‌شود کلنی‌هایی به رنگ صورتی قابل مشاهده خواهند بود. اگر ارگانیسم لاکتوز را تخمیر نکند، کلنی‌ها بی‌رنگ می‌مانند. دانستن اینکه یک ارگانیسم تخمیر کننده لاکتوز است یا نه، در تعیین راه درمانی فوق العاده مفید است. سودوموناس آئروژینوزا لاکتوز را تخمیر نمی‌کند. به همین دلیل در مورد بالا، می‌توان به پزشک گفت که باکتری سودوموناس آئروژینوزا نیست زیرا یک تخمیر کننده لاکتوز بر روی آگار مکانکی وجود دارد. این اطلاعات به پزشک بالینی کمک می کند تا بهترین دوره درمان ضد میکروبی را تعیین کند زیرا سودوموناس منتفی است و استفاده از یک آنتی بیوتیک با طیف گسترده ضروری نیست.

مثال ۳

یک بیمار ۱۲ ساله با گرفتگی شدید شکم و چندین روز اسهال آبکی به اورژانس مراجعه می‌کند. یک نمونه مدفوع جمع آوری شده و برای آزمایش به آزمایشگاه میکروبیولوژی ارسال می‌شود.

محیط استفاده شده برای کشت مدفوع بین آزمایشگاه‌ها متفاوت است اما آزمایش مدفوع جایی است که سودمندی محیط افتراقی کاملا مشخص می‌شود. به‌طور معمول، مدفوع انسان حاوی طیف وسیعی از باکتری‌ها است و شناسایی عوامل بیماری‌زا در میان فلور طبیعی دستگاه گوارش می‌تواند چالش برانگیز باشد. هکتون آگار  یک محیط انتخابی- افتراقی است که به جداسازی و تمایز سالمونلا و شیگلا از ارگانیسم‌های گرم منفی روده کمک کرده و همچنین از رشد اکثر باکتری‌های گرم مثبت جلوگیری می‌کند. فلور دستگاه گوارش غیر بیماری‌زا، کربوهیدرات‌ها را تخمیر کرده و کلنی‌هایی به رنگ مرجانی روشن (bright salmon-colored) تولید می‌کند. باکتری‌های گرم منفی غیر تخمیری ، مانند شیگلا، به صورت کلنی‌های سبز آبی ظاهر می‌شوند و ارگانیسم‌هایی مانند سالمونلا که گوگرد را به سولفید هیدروژن تبدیل می‌کنند، کلنی های سیاه تولید می‌نمایند. در مورد بالا، استفاده از هکتون آگار به میکروب‌شناس اجازه می‌دهد تا به سرعت عوامل بیماری‌زا را در میان توده‌ای از فلور طبیعی شناسایی کند.

جمع‌بندی

همانطور که در این مطلب گفته شد، محیط کشت‌ها جزء ابزارهای بسیار کاربردی در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی هستند که از مزایای زیادی برای تشخیص ارگانیسم‌های مختلف برخوردار می‌باشند. در این مطلب سعی کردیم سه نوع اصلی از محیط کشت‌ها را توضیح داده و مثال‌هایی از آن‌ها را بیان کنیم. لازم به ذکر است که کاربرد محیط کشت در علم میکروبیولوژی بسیار گسترده است و شناخت ارگانیسم‌های مختلف به کمک محیط کشت‌ها تنها از طریق تجربه‌ی زیاد میسر خواهد بود. به همین دلیل اگر علاقه‌مند به این حوزه هستید نیاز دارید تا مطالب زیادی خوانده، محیط کشت‌های مختلفی دیده و آزمایش‌های بسیاری انجام دهید.

امیدواریم این مطلب، به عنوان گوشه‌ای از علم میکروبیولوژی و کاربرد محیط کشت، مورد توجه شما قرار گرفته باشد.