پروتکل رنگ آمیزی تری‌کروم (ماسون و گوموری)

اغلب تکنیک‌های رنگ آمیزی افتراقی که برای بافت‌های پیوندی به کار برده می‌شود، در دسته رنگ‌آمیزی به روش تری کروم قرار می‌گیرند.

رنگ آمیزی به روش تری کروم، یک تکنیک رنگ آمیزی در آزمایشگاه است که در آن از دو یا چند رنگ اسیدی به همراه پلی اسید استفاده می‌شود تا دو ماده به روش افتراقی و در دو رنگ متضاد رنگ آمیزی شوند. رایج‌ترین کاربرد این روش، رنگ آمیزی فیبر عضلات به رنگ قرمز و رشته کلاژن به رنگ سبز یا آبی است. از آنجایی که ممکن است افتراق فیبرهای عضلات صاف از رشته کلاژن دشوار باشد، رنگ‌آمیزیِ تری کروم اهمیت زیادی دارد. رنگ آمیزی تری کروم به شناسایی افزایش بافت کلاژن (به عنوان مثال تغییرات فیبروتیک مانند سیروز کبدی) و همچنین تشخیص تومورهای ناشی از سلول‌های عضلانی و فیبروبلاست کمک می‌کند.

ماسون تری کروم ^[۱] و گوموری تری کروم ^[۲] دو مورد از تکنیک‌های رایجِ رنگ‌آمیزی‌های تری کروم در آزمایشگاه هستند. در این مقاله قصد داریم مواد مورد استفاده در این تکنیک‌ها، روش و نتایج حاصل از آن‌ها‌ را بیان کنیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

 ۱. رنگ‌آمیزی به روش ماسون تری کروم

۱-۱. آماده‌سازی محلول‌ها

همانطور که در قسمت مقدمه نیز گفته شد در تکنیک رنگ‌آمیزی ماسون تری کروم از دو یا چند رنگ اسیدی به همراه پلی اسید استفاده می‌شود. در ادامه به بررسی مواد و محلول‌هایی که در این تکنیک استفاده می‌شود و نحوه آماده‌سازی هریک خواهیم پرداخت. توجه داشته باشید که توصیه می‌شود در مرحله‌ی پردازش بافت از محلول تثبیت فرمالین ۱۰% یا محلول بوئن ^[۳] استفاده کرده و برش ۵ میکرومتری از بافت پارافین‌گیری شده را روی لام رنگ‌آمیزی کنید.

۱-۱-۱.محلول بوئن: استفاده از محلول بوئن کیفیت رنگ‌آمیزی به روش ماسون تری‌کروم را بهبود می‌بخشد.

آماده‌سازی محلول بوئن:

• اسید پیکریک (اشباع شده) ——————- ۷۵میلی‌لیتر
• فرمالین غلیظ ۴۰%-۳۷%  ——————-۲۵ میـلی‌لیتر
• استیک اسید گلاسیال ^[۴] ——————- ۵ میـلی‌لیـتـر

این سه ماده را به خوبی با یکدیگر مخلوط کنید.

۲-۱-۱. محلول هماتوکسیلین آهن Weigert

• آماده‌سازی استوک محلول A:
  • هماتوکسیلین——————- ۱ گـــــــرم
  • الکل ۹۵٪  ——————- ۱۰۰ میلی‌لیتر

• آماده‌سازی استوک محلول B:
  • کلرید فریک محلول در آب ۲۹%——————- ۴ میـلی‌لیتر
  • آب مقطر ——————————-  ۹۵ میلی‌لیتر
  • اسید هیدروکلریک غلیظ ———————— ۱ میـلی‌لـیتر

قسمت‌های مساوی محلول استوک A و B را مخلوط کنید. این محلول برای ۳ ماه پایدار است و استفاده از آن بعد از گذشت ۴ ماه از زمان آماده‌سازی توصیه نمی‌شود.

۳-۱-۱. محلول بیبریچ اسکارلت- اسید فوشین ^[۵]

• • بیبریچ اسکارلت محلول در آب ۱% ——————- ۹۰ میلی‌لیتر
  • اسید فوشین محلول در آب ۱% ———————- ۱۰ میلی‌لیتر
  • استیک اسید گلاسیال —————————— ۱ میلی‌لیتر

۴-۱-۱. محلول اسید فسفومولیبدیک-فسفو تنگستیک ^[۶]

• • اسید فسفومولیبدیک ۵٪ ————- ۲۵ میلی‌لیتر
  • اسید فسفوتنگستیک ۵٪ ———— ۲۵ میلی‌لیتر

۵-۱-۱. محلول آنیلین بلو ^[۷]

• • • آنیلین بلو ——————————- ۲/۵ گــــرم
    • استیک اسید گلاسیال ——————— ۲ میــلی‌لیـتر
    • آب مقطر ——————————- ۱۰۰میلی‌لیتر

۱-۱-۶. محلول اسید استیک 1٪:

• • • • استیک اسید گلاسیال —————— ۱ میـلی‌لیتر
      • آب مقطر —————————- ۹۹ میلی‌لیتر

۲-۱. مراحل رنگ‌آمیزی به روش ماسون تری‌کروم

۱. ابتدا مراحل پارافین‌زدایی و هیدراسیون را با استفاده از الکل ۱۰۰% ، ۹۰% و ۷۰% انجام دهید.

۲. بافت را به کمک آب مقطر بشویید.

۳. چنانچه بافت در فرمالین تثبیت شده است، جهت بهبود کیفیت رنگ‌آمیزی، بافت را به مدت ۱ ساعت در دمای ۵۶ درجه سانتی‌گراد و به کمک محلول بوئن مجددا فیکس کنید. البته این مرحله ضروری نیست و تنها جهت بهبود کیفیت رنگ‌آمیزی پیشنهاد می‌شود.

۴. آب لوله‌کشی را به مدت ۵ الی ۱۰ دقیقه باز کنید تا آب زرد رنگ باقی مانده در لوله رد شود.

۵. لام را به مدت ۱۰ دقیقه در محلول کاربردی هماتوکسیلین آهن Weigert قرار دهید.

۶. سپس لام را به مدت ۱۰ دقیقه با آب بشویید.

۷. لام را با آب مقطر آبکشی کنید.

۸. لام را به مدت ۱۰ الی ۱۵ دقیقه در محلول بیبریچ اسکارلت- اسید فوشین قرار دهید. محلول را می‌توان برای استفاده در آینده نگهداری کرد.

۹. لام را با آب مقطر بشویید.

۱۰. جهت افتراق (Differentiate) از محلول اسید فسفومولیبدیک-فسفو تنگستیک استفاده کنید. لام را به مدت ۱۰ الی ۱۵دقیقه (تا زمانی که کلاژن قرمز نشود) در این محلول قرار دهید.

۱۱. لام را مستقیماً (بدون آبکشی) به محلول آنیلین بلو منتقل کرده و اجازه دهید به مدت ۵ الی ۱۰ دقیقه در محلول باقی بماند. سپس برای مدتی کوتاه لام را با استفاده از آب مقطر آبکشی کنید.

۱۲. مجددا جهت افتراق، لام را به مدت ۲ الی ۵ دقیقه در محلول اسید استیک ۱٪ قرار دهید و سپس با آب مقطر بشویید.

۱۳. لام را با استفاده از اتیل الکل ۹۵% و اتیل الکل ۱۰۰% دهیدراسیون کنید. این مرحله باعث از بین رفتن بیبریچ اسکارلت- اسید فوشین می‌شود.

۱۴. در انتها لام را با استفاده از زایلین شفاف (clear) کنید.

۳-۱  نتایج

• کلاژن ———————————آبـی
• هسته‌ها —————————— سیاه
• عضله‌، سیتوپلاسم‌، کراتین —————- قرمز

۲. رنگ‌آمیزی به روش گوموری تری کروم

رنگ‌آمیزی به روش ماسون تری کروم عمدتاً برای رنگ‌آمیزیِ نمونه‌ی برداشته شده از  کلیه صورت می‌گیرد و برای رنگ‌آمیزی سایر بافت‌ها معمولاٌ  از روش گوموری تری کروم استفاده می‌شود. انجام این روش آسان‌تر است و رنگ‌آمیزی کلاژن و عضله با آن به خوبیِ روش ماسون تری کروم است. در ادامه ابتدا به بررسی مواد و محلول‌های مورد استفاده در تکنیک رنگ‌آمیزی گوموری تری کروم خواهیم پرداخت و سپس روش انجام رنگ‌آمیزی و نتایج حاصل از آن را بررسی خواهیم کرد. توصیه می‌شود بافت در بافر فرمالین خنثی ۱۰%  ^[۸] فیکس شود و برش 5 میکرومتری از بافت پارافین‌گیری شده را روی لام رنگ‌آمیزی کنید.

۱-۲. آماده‌سازی محلول‌ها

۱-۱-۲. محلول بوئن:

• اسید پیکریک (اشباع شده) ——————- ۷۵ میلی‌لیتر
• فرمالین غلیظ ۴۰%-۳۷% ——————-۲۵ میـلی‌لیتر
• استیک اسید گلاسیال——————- ۵ میـلی‌لیـتـر

۲-۱-۲. محلول هماتوکسیلین آهن Weigert اصلاح شده

• آماده‌سازی استوک محلول A:
  • هماتوکسیلین کریستال C.I. 75290 ——-ء ۲ گـــــــرم
  • اتیل الکل ۹۰٪ ———————— ۱۰۰ میلی‌لیتر

• آماده‌سازی استوک محلول B:
  • فریک کلرید محلول در آب ۶۲%——————- ۴ میـلی‌لیتر
  • آب مقطر ———————————— ۹۵ میلی‌لیتر
  • اسید هیدروکلریک غلیظ ———————— ۱ میـلی‌لـیتر

قسمت‌های مساوی محلول استوک A و B را مخلوط کنید.

۳-۱-۲. آماده‌سازی رنگ تری کروم

• Chromotrope 2R, C.I. 16570——————-ء ۰/۶گــرم
• آنیلین بلو C.I. 42755ء————————— ۰/۳ گــرم
• اسید استیک گلاسیال—————————- ۱میلی‌لیـتر
• اسید فسفوتنگستیک —————————- ۰/۸ گـــرم
• آب مقطر ————————————-۱۰۰ میلی‌لیتر

در صورتی که تمایل دارید کلاژن به رنگ سبز مشاهده شود، می‌توانید فست گرین اف.سی.اف ^[۹] یا سبز روشن SF ^[۱۰] جایگزین آنیلین بلو نمایید.

۴-۱-۲. اسید استیک ۰/۵ %

• اسید استیک گلاسیال ———-۰/۵ میلی‌لیتر
• آب مقطر ——————–۹۹/۵ میلی‌لیتر

۲-۲. مراحل رنگ‌آمیزی به روش گوموری تری‌کروم

۱. مراحل پارافین‌زدایی و هیدراسیون بافت را انجام دهید.

۲. محلول بوئن را در دمای ۵۸ درجه سانتی‌گراد گرم کنید. لام را به مدت ۱۰ دقیقه درون محلول بوئن گرم قرار دهید.

۳. لام را زیر آب بشویید تا زمانی که رنگِ زرد از بین برود و سپس لام را با استفاده از آب مقطر آبکشی کنید.

۴. لام را به مدت ۵ دقیقه درون رنگ محلول هماتوکسیلین آهن Weigert اصلاح شده قرار دهید.

۵. لام را به مدت کوتاهی زیر آب شسته و دو مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.

۶. سپس لام را به مدت ۵ ثانیه در اسید کلریدریک ۰/۵ % که با الکل۷۰% مخلوط شده است قرار دهید.

۷. لام را به مدت ۳۰ ثانیه زیر آب شسته و دو مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.

۸. لام را به مدت ۱۵ دقیقه در رنگ تری کروم قرار دهید.

۹. سپس آن‌را به مدت ۱۰ ثانیه در اسید استیک ۰/۵ % محلول در آب قرار داده و سپس دو مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.

۱۰. به منظور دهیدراسیون، لام را به ترتیب در الکل با خلوص‌های مختلف قرار دهید.

۱۱. در انتها لام را به کمک زایلین شفاف (clear) نمایید.

۳-۲. نتایج

• الیاف عضلانی ————————- قرمز
• کلاژن‌ها —————————— آبی
• هسته‌ها —————————-آبی متمایل به سیاه
• گلبول‎‌های قرمز ——————— قرمز

توجه داشته باشید که استفاده از محلول گرم بوئن (در دمای ۵۸ درجه سانتی گراد) برای بهبود رنگ آمیزی عضلات و کلاژن لازم است و بدون این کار تمایز رنگی عضلات و کلاژن بسیار ضعیف خواهد بود. همچنین ممکن است بافت با استفاده از مواد پلاستیکی قالب‌گیری شده باشد. اما در این صورت کیفیت رنگ‌آمیزی نسبت به قالب‌گیری با پارافین ضعیف‌تر خواهد بود.

مروری بر زندگی پیر ماسون  

تا به اینجای مطلب با دو مورد از کاربردی‌ترین رنگ‌آمیزی‌های تری کروم آشنا شدید. در این قسمت از مقاله قصد داریم مروری کوتاه بر زندگی دکتر ماسون، ابداع‌کننده‌ی روش رنگ‌آمیزی ماسون تری کروم داشته باشیم.

دکتر کلود ال. پیر ماسون  (Claude L. Pierre Masson) متولد سال ۱۸۸۰میلادی یک پزشک کانادایی بود. وی یکی از برجسته‌ترین هیستوپاتولوژیست‌های عصر خود محسوب می‌شد. دکتر پیر ماسون در دیژون (Dijon) متولد شد و در دانشگاه پاریس و انستیتو پاستور در رشته پزشکی تحصیل کرد.

در ابتدا، ماسون قصد داشت در حوزه‌ی پزشکی بالینی فعالیت کند، اما به دلیل وضعیت سلامتی ضعیفی که داشت، تصمیم گرفت رشته‌ی خود را به زیست شناسی تغییر دهد.

تدریس در دانشگاه استراسبورگ نیز به ماسون پیشنهاد شد. در سال ۱۹۲۷ استراسبورگ را ترک کرد و به عنوان رئیس بخش آسیب شناسی در دانشگاه مونترئال انتخاب گردید. دکتر پیر ماسون علاوه بر ایجاد تکنیک رنگ آمیزی اسون تری کروم، به دلیل تحقیقات درمورد تومورهای مغزی نیز شهرت یافت. وی در سن ۷۹ سالگی درگذشت و در قبرستان نوتردام ^[11] به خاک سپرده شد.