باسیل‌های گرم مثبت: کورینه‌ باکتریوم و آرکانوباکتریوم‌ها

تهیه و تنظیم: دکتر محمد قهری

کورینه باکتریوم ها ، باکتری‌هایی به قطر 1-0/5 میکرومتر و طول چند میکرومتر می‌باشند. در یک انتهای این باکتری‌ها  برجستگی نامنظمی دیده می‌شود و لذا واژه گرزمانند یا چماق^[1] برای این ارگانیسم‌ها استفاده می‌گردد. به‌طورکلی کورینه باکتریوم ها باسیل‌های گرزی‌شکل مستقیم یا کمی خمیده هستند که به‌طور یکنواخت رنگ نمی‌شوند و بدون اسپور، بدون حرکت، کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی می‌باشند. بیش از 46 گونه از کورینه باکتریوم ها شناسایی شده‌اند که اکثر آن‌ها بندرت در انسان‌ها بیماری‌زا هستند. در بین اعضای جنس کورینه باکتریوم‌ ،کورینه‌باکتریوم دیفتریه^[2] مسبب بیماری دیفتری است. هم‌چنین کورینه باکتریوم اولسرانس^[3] و کورینه باکتریوم سودوتوبرکلوزیس^[4] نیز در انسان بیماری‌زا هستند. سایر کورینه باکتریوم که به آن‌ها دیفتروئید^[5] می‌گویند، به‌صورت کومنسال بر روی پوست، دهان و حلق افراد زندگی می‌کنند. از این دسته باکتری‌ها که از نظر بالینی هم اهمیت دارند می‌توان به کورینه باکتریوم آمیکولاتوم^[6]، کورینه باکتریوم مینوتیسیموم^[7]، کورینه باکتریوم جی‌کیوم^[8]، کورینه باکتریوم سودودیفتریتیکوم^[9]، کورینه باکتریوم گزروزیس^[10]، آرکانوباکتریوم اوره‌الیتیکوم و پروپیونی‌باکتریوم اکنه‌ای اشاره كرد.

تشخیص آزمایشگاهی:

نمونه‌های ارسالی به آزمایشگاه جهت شناسایی کورینه باکتریوم‌ها ، ترشحات گلو، بینی (بخصوص در نوزادان)، مجاری گوش خارجی و ملتحمه چشم است. نمونه‌برداری از گلو و بینی یا توسط سواب (بهتر است از سواب سرکتانی یا پلی‌استر باشد) صورت می‌گیرد يا بايستی تكه كوچكي از غشاء كاذب برداشت شود و در محیط انتقالی نیمه‌جامد Amies به آزمایشگاه ارسال گردد. چون کورینه باکتریوم دیفتریه معمولا وارد خون نمی‌شود، لذا خون، نمونه ارسالی به آزمایشگاه نمی‌تواند باشد. چنانچه ضایعات پوستی مشکوک به وجود کورینه باکتریوم دیفتریه باشند، نمونه مناسب در این حالت آسپیره ضایعه است.

نکته: سوآب از بینی، حلق یا دیگر ضایعات مشکوک قبل از تجویز داروی ضدمیکروبی باید گرفته شود.

1- آزمایش مستقیم

الف- رنگ‌آمیزی گرم: باسیل‌های گرم مثبت با اندازه‌های متغیر که اندازه آنها بین 1/5 تا 8 میکرومتر است و بصورت اشکالی شبیه حروف الفبای چینی یا لاتین X.M.Y.W که به‌طور نامنظم رنگ گرفته‌اند، مشاهده می‌شوند (شکل1). پلی‌مورفیسم در اسمیر مستقیم از حلق چندان مشهود نیست، اما در کلنی‌های رشدکرده در محیط لوفلر به‌وضوح مشاهده می‌گردد.

ب- رنگ‌آمیزی بلودومتلین: بعد از رنگ‌آمیزی اسمیر با محلول کهنه بلودومتیلن، دانه‌هایی به رنگ بنفش مایل به قرمز در انتهای باسیل مشاهده می‌شود که به آنها دانه‌های متاکروماتیک یا دانه‌های قطبی می‌گویند.

ج- رنگ‌آمیزی آلبرت یا نیسر: در رنگ‌آمیزی آلبرت، باسیل دیفتری با سیتوپلاسم سبز که گرانول‌های قطبی رنگ ارغوانی تیره دارد، مشاهده می‌گردد (شکل 2) و در رنگ‌آمیزی نیسر دانه‌های متاکروماتیک به رنگ آبی و باسیل به رنگ قهوه‌ای دیده می‌شود. لازم به ذکر است که دیدن این گرانول‌ها تشخیص دیفتری را محرز می‌کند، اما ندیدن آنها موجب رد تشخیص دیفتری نمی‌گردد.

2- کشت

موارد مشکوک به دیفتری را باید طبق نمای زیر کشت داده و تعیین هویت نمود:

کورینه باکتریوم دیفتریه در بیشتر محیط‌های کشت روتین و معمول به‌خوبی رشد می‌کند، ولی برای رشد بهتر، آن را روی محیط‌هایی مانند محیط سرم منعقده لوفلر، بلادآگار، سیستئین- تلوریت آگار (CT) و غیره کشت می‌دهند. افزودن تلوریت پتاسیم به میزان 0/4-0/3 درصد باعث مهار بیشتر باکتری‌های دیگر شده و محیط کشت انتخابی برای باسیل دیفتری و سایر کورینه باکتریوم ها را فراهم می‌سازد. البته ممکن است این ترکیب رشد خود کورینه باکتریوم ها را به تأخیر اندازد و بعد از 48-24 ساعت اندازه کلنی خیلی ریز و سیاه رنگ تشکیل گردد. لازم به ذکر است که اگر یک آزمایشگاه فاقد محیط‌های تینسدال و CT بود و یک درخواست مبنی بر تشخیص کورینه باکتریوم دیفتریه داشته باشد، می‌تواند از محیط کلمبیا کلستین- نالیدیکسیک اسید (CAN) آگار استفاده کند، اگرچه شناسایی سویه‌های کورینه باکتریوم دیفتریه بر روی این محیط مشکل است.

مشخصات کلنی:

محیط حاوی تلوریت پتاسیم: استافیلوکوک‌ها و استرپتوکوک‌ها عمدتاً روی آن رشد نمی‌کنند و باسیل دیفتری  کلنی‌های خاکستری مایل به سیاه ایجاد می‌نماید. کلنی‌های تیپ‌های چهارگانه میکروب دیفتری روی این محیط به‌خوبی از یکدیگر قابل تمیز می‌باشند. در آزمایش میکروسکوپی، باسیل‌ها عمدتاً کوتاه‌تر و چماقی شکل بوده و در هنگام رنگ‌آمیزی یکنواخت رنگ می‌گیرند و کمتر دارای فرم دوقطبی می‌باشند. برای مشاهده فرم دوقطبی می‌باید کلنی مشکوک را به محیط لوفلر منتقل و پس از رشد، از آن اسمیر تهیه نمود. روی این محیط کورینه‌ باکتریوم های دیفتریه ، اولسرانس و سودوتوبرکلوزیس ایجاد کلنی‌های سیاه با حاشیه قهوه‌ای می‌کنند که برای جداسازی کورینه باکتریوم دیفتریه از این گونه‌ها از تست اوره استفاده می‌شود (شکل 4). کورینه باکتریوم دیفتریه برخلاف دو گونه دیگر اوره‌آز منفی است.

محیط لوفلر: فرم تیپیک کورینه باکتریوم دیفتری تنها در این محیط مشاهده می‌شود. بعد از انکوباسیون 18-10 ساعت در 37 درجه سانتیگراد، ابتدا کلنی‌ها کوچک، مدور، سفید مایل به خاکستری با محیط منظم تشکیل می‌گردد و سپس بزرگ می‌شود و وسط کلنی ضخیم و اطراف آن دندانه‌دار می‌گردد. این کلنی‌ها به‌راحتی در آب قابل امولسیفیه شدن هستند. دانه‌های متاکروماتیک در گسترش هائی که از این محیط تهیه شده به‌خوبی نمایان است. لازم به ذکر است که کلنی‌های تیپ‌های چهارگانه باسیل دیفتری یعنی گراویس (gravis)، میتیس (Mites)، انترمدیوس (intermedius) و بلفانتی (belfanti) را نمی‌توان روی این محیط از یکدیگر تشخیص داد.

محیط بلادآگار: کورینه باکتریوم دیفتری کلنی‌های کوچک با ظاهر مات ایجاد می‌کند. بیشتر سوش‌های میتیس و بعضی سوش‌های گراویس همولیز بتای ضعیف دارند.

تیپ‌های مختلف باسیل دیفتری:

گراویس: کلنی‌های آن روی تلوریت پتاسیم بعد از 24 ساعت به اندازه 2 تا 3 میلی‌متر است. ظاهر گل مینا دارد و محدب است و مرکز آن سیاه خاکستری بوده و روی بلادآگار بعضی سوش‌های آن همولیز بتا می‌دهد. این تیپ برخلاف سه تیپ دیگر قدرت تخمیر نشاسته را دارد. در محیط آبگوشت به‌صورت گرانولار رشد می‌کند و منظره کشت شفاف است.

انترمدیوس: کلنی‌های آن از گراویس کوچک‌تر (کمتر از mm1)، مسطح (Flat)، کرم رنگ، مرکز سیاه و شبیه تخم قورباغه است. روی بلادآگار همولیز نمی‌دهد و در محیط آبگوشت دانه‌ریز در ته لوله و منظره کشت، کدر است.

میتیس: کلنی‌های بزرگ (2-1 میلی‌متر) خاکستری مایل به سیاه ایجاد می‌کند و بیشتر سوش‌های آن همولیز بتای ضعیف می‌دهد و در محیط آبگوشت ایجاد کدورت یکنواخت می‌نماید.

درصورتی‌که باسیل دیفتری در محیط لوفلر رشد کرده و با متیلن بلو رنگ شود، هر تیپ آن مشخصات میکروسکوپی ویژه‌ای به شرح ذیل دارد:

گراویس: باسیل‌های کوتاه و هم‌شکل که یکنواخت رنگ نمی‌شوند و دارای دانه‌های متاکروماتیک کم هستند.

انترمدیوس: باسیل‌های بلند، مستقیم و شدیداً پلی‌مورف که یکنواخت رنگ نمی‌شوند و دارای دانه‌های متاکروماتیک کمتر از میتیس است.

میتیس: باسیل‌های بلند، خمیده و پلی‌مورف که یکنواخت رنگ شده و دارای دانه‌های متاکروماتیک می‌باشند.

3- خصوصیات بیوشیمیایی باسیل دیفتری

کاتالاز مثبت، نیترات معمولاً مثبت، اکسیداز و اوره‌آز منفی، متیل‌رد مثبت است. قدرت هیدرولیز هیپورات، اسکولین و ژلاتین را ندارد. این باکتری‌ها از گلوکز، مالتوز، رامنوز، آرابینوز و دکستران بدون گاز ایجاد اسید می‌نمایند.

4- توکسین‌زائی

باکتری‌های جداشده بایستی از نظر توکسین‌زائی بررسی شوند. بعضی از این آزمایش‌ها معمولاً فقط در آزمایشگاه‌های رفرانس انجام می‌شوند. این آزمایش‌ها می‌توانند به یکی از 5 صورت زیر انجام گیرند:

1- یک کشت از محیط لوفلر در آب حل شده، 4 میلی‌لیتر به‌صورت زیرجلدی به دو خوکچه هندی تزریق می‌شود که یکی از آنها 2 ساعت قبل، 2000-1000 واحد آنتی‌توکسین دیفتری به‌صورت داخل پریتوئین دریافت کرده است. حیوانی که آنتی‌توکسین نگرفته طی 3-2 روز باید بمیرد، درصورتی‌که حیوان دیگر زنده می‌ماند.

2- نواری از یک کاغذ فیلتر که با آنتی‌توکسین آغشته شده است، روی محیط آگار حاوی 20 درصد سرم اسبی قرار داده می‌شود. باکتری‌هایی که باید برای سم‌زایی آزمایش شوند به‌صورت خطی در فاصله 9-7 میلی‌متری نوار کاغذی با زاویة قائمه نسبت به کاغذ فیلتر کشت داده می‌شوند. پس از 48 ساعت از تلقیح، آنتی‌توکسینی که از نوار کاغذ آزاد می‌شود، سمی را که از کشت‌های سم‌زا رها می‌شود، ته‌نشین می‌کند و خطوطی سفید رنگ را که بین نوار کاغذی و باکتری‌های رشدیافته، پدید می‌آورد. این روش بنام روش اصلاح‌شده الک (Elek) که به‌وسیله مرکز رفرانس سازمان بهداشت جهانی (WHO) (واحد دیفتری) پیشنهاد شده است، نامیده می‌شود (شکل 5).

3- سم‌زایی کورینه باکتریوم دیفتریه را می‌توان با اتصال باکتری‌ها به آگار پوشیده از یک لایه کشت سلولی نشان داد. سمی که تولید می‌شود به داخل سلول‌های زیرین نفوذ پیدا می‌کند و آنها را می‌کشد.

4- از روش PCR نیز می‌توان برای ردیابی ژن تولیدکننده توکسین (Tox) استفاده کرد. از این روش حتی بر روی نمونه‌های مستقیم بیماران، قبل از گزارش نتایج کشت می‌توان استفاده نمود. وجود کشت مثبت می‌تواند تأییدی بر آزمایش PCR باشد. کشت منفی بدنبال مصرف آنتی‌بیوتیک همراه با تست PCR مثبت می‌تواند نشانگر بیماری دیفتری باشد.

5- امروزه از روش الیزا (ELISA) و لاتکس آگلوتیناسیون غیرفعال معکوس برای ردیابی توکسین در نمونه‌های بالینی استفاده می‌شود.

5- روش‌های تایپینگ:

روش‌های مولکولی و غیرمولکولی برای تایپینگ کورینه باکتریوم دیفتریه توکسیژنیک و غیرتوکسیژنیک در اپیدمی‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش‌ها شامل فاژ تایپینگ، باکتریوسین تایپینگ، ریبوتایپینگ، پالس فیلد ژل الکتروفورز (PFGE) و RAPD می‌باشند.

مقاومت و ایمنی

از آنجایی که بیماری دیفتری در نتیجة سم تولیدشده توسط ارگانیسم است تا تهاجم آن، مقاومت به آن عمدتاً به تولید آنتی‌توکسین خنثی‌کننده در گردش خون و بافت وابسته است. این موضوع معمولاً درست است که دیفتری فقط در افرادی ایجاد می‌شود که هیچ آنتی‌توکسینی ندارند (یا کمتر از 1 درصد واحد LF در میلی‌لیتر). بهترین روش‌های ارزیابی ایمنی فرد، انجام تست شیک، بررسی مدارک ایمن‌سازی با توکسوئید دیفتری و ایمن‌سازی اولیه یا یادآور در صورت لزوم، است.

سایر كورینه‌باكتریوم‌های بیماری‌زا

كورینه‌باكتریوم جی‌كیوم ، باسیل گرم مثبت ، بی‌حرکت و بدون اسپور، نیترات، اوره‌آز و فسفولیپاز منفی و کاتالاز و پیرازین‌امیداز مثبت است (جدول 2). این باکتری اغلب بروی سطح پلیت‌های بلادآگار ایجاد جلای فلزی می‌کند. كورینه‌باكتریوم جی‌كیوم باكتری تازه شناخته‌شده‌ای است كه قسمتی از فلور طبیعی پوست، خصوصاً در زیر بغل، كشاله ران و نواحی مقعد است. این باكتری تهدیدی برای بیماران مبتلا به لوسمی و نوتروپنی بستری در بیمارستان است، خصوصاً در مواقعی كه بیمار مقدار زیادی آنتی‌بیوتیك وسیع‌الطیف دریافت كرده باشد. هم‌چنین به‌طور آشکار مرتبط با عفونت‌های اجسام خارجی مانند ایمپلنت‌ها می‌باشند. بیشترین عفونت‌های حاصل از این باكتری‌ها شامل پنومونی، باكتریمی، زخم‌های پوستی در محل‌های ورود كاتتر و اندوكاردیت دریچه‌های مصنوعی می‌باشند. اغلب به آنتی‌بیوتیک‌های گروه بتالاکتام مقاوم بوده ولی وانكومایسین داروی انتخابی بوده و از سیپروفلوكسازین نیز می‌توان برای درمان استفاده كرد.

كورینه‌باكتریوم مینوتیسیموم، به‌صورت فلور طبیعی در بین انگشتان پا و کشاله ران یافت می‌شود، عامل عفونت پوستی بنام اریتراسما هست و همچنین ممکن است موجب عفونت های منتشره در افراد دچار نقص ایمنی گردد. اریتراسما معمولاً در نواحی مغبنی به‌صورت لكه‌های قرمز یا قرمز- قهوه‌ای دیده می‌شود كه تمایل کمی به پوسته‌پوسته شدن دارد. اریتراسما گاهی بین انگشتان پا، ‌زیر بغل و زیر چین سینه ایجاد می‌شود. ضایعات معمولاً ملتهب نیستند و خارش كمی دارند.  درگسترش های تهیه شده ازضایعات اریتراسما مخلوطی از كوكسی ها و باسیل‌های رشته‌ای به طول تا 7 میكرومتر مشاهده می‌شوند. از آنجا که كورینه‌باكتریوم مینوتیسیموم ایجاد متابولیت‌های پورفیرینی می‌نماید، ضایعات اریتراسما در زیر نور فلورسانس (چراغ وود) رنگ قرمز مرجانی ایجاد می‌كند. اریتراسما با اریترومایسین درمان می‌گردد. ویژگی‌های بیوشیمیایی آن در جدول 2 آمده است.

کورینه باکتریوم اوره‌آلیتیکوم گونه کند رشدی است که دارای مقاومت چندگانه به آنتی‌بیوتیک‌ها است. این باکتری برخلاف کورینه باکتریوم دیفتریه، اوره‌آز مثبت است و در ارتباط با عفونت‌های حاد و مزمن دستگاه ادراری است که با قلیائی شدن pH ادرار و تشکیل کریستال مشخص می‌شود، هم‌چنین سبب باکتریمی، اندوکاردیت و عفونت‌های زخم است (جدول 2).

آركانوباكتریوم همولیتیكوم یك دیفتروئید است كه قبلاً كورینه‌باكتریوم همولیتیكوم نامیده می‌شد. بر روی پوست و در نازوفارنكس افراد سالم یافت می‌شود‌ كه به‌عنوان عامل فارنژیت و عفونت‌های زخم و بافت نرم نیز گزارش شده است. فارنژیت حاصل از آركانوباكتریوم همولیتیكوم شبیه به فارنژیت حاصل از استرپتوكوك گروه A (گلودرد استرپتوکوکی) است، اما از نظر سن، معمولاً بیماران عفونی با آركانوباكتریوم همولیتیكوم، بزرگ‌تر از مبتلایان به گلودرد استرپتوکوکی‌اند و معمولاً راش‌های قرمز یا صورتی دارند كه راش‌های شبیه مخملك نامیده می‌شوند. این باکتری با توجه به تست‌های بیوشیمیایی و رنگ‌آمیزی گرم (باسیل بجای کوکسی) از استرپتوکوک‌ها افتراق داده می‌شود (جدول 2). لازم به ذکر است که هر دوی آنها کاتالاز منفی می‌باشند. گونه‌های آرکانوباکتریوم روی محیط بلاد آگار حاوی خون گوسفندی بتاهمولیتیک هستند. کلنی‌های آنها روی این محیط پس از 48 ساعت انکوباسیون کوچک هستند و همولیز ممکن است نادیده گرفته شود. رشد کافی و همولیز قابل مشاهده در شرایط محیطی دارای CO2 به‌خوبی فراهم می‌گردد. در بین آرکانوباکتریوم‌ها ارکانوباکتریوم پیوژنز^[11] و آرکانوباکتریوم برناردی^[12] سبب آبسه‌هایی در انسان می‌گردند. این باکتری‌ها به پنی‌سیلین، دیگر بتالاکتامها، ریفامپین، تتراسایکلین و ماکرولیدها حساس هستند. رشد ارگانیسم‌ها می‌تواند توسط فلورکینولون‌ها و امینوگلیکوزیدها مهار گردد. روش‌های قابل اجرا جهت انجام تست‌های تعیین حساسیت میکروبی روی گونه‌های آرکانوباکتریوم و هم‌چنین معیارهای تفسیری در سند M45-M2 از CLSI2011 یافت می‌گردد.

پروپیونی‌باکتریوم اکنه ای باسیل‌ پلی‌مورف مستقیم یا کمی خمیده و شبیه به دیفتروئیدها است. آنها بدون حرکت و اسپور، کاتالاز، اندل، نیترات و هیدرولیز ژلاتین مثبت و هیدرولیز اسکولین منفی و از تخمیر قندها مقدار زیادی اسید پیروویک و اسید استیک و به مقدار کمتر اسیدهای دیگر تولید می‌کنند. این باکتری هوازی ساکن طبیعی پوست است و با تولید لیپاز که قادر است از لیپیدهای پوست، اسیدهای چرب آزاد تولید کند، موجب ایجاد آکنه می‌شود. اسیدهای چرب آزادشده موجب ایجاد التهاب بافتی و در نتیجه تولید آکنه می‌شوند. با توجه به این‌که این باکتری قسمتی از فلور پوست است، می‌بایست آلودگی محیط‌های کشت را از عفونت واقعی تشخیص داد. در برخی مواد، پروپیونی‌باکتریوم آکنه ای موجب عفونت دریچه‌های قلب و شانت‌های مایع مغزی- نخاعی نیز شده است.

واژه‌نامه