تکنیک های بافت شناسی

پروسه بافت 

بافت جداشده از بدن برای تشخیص فرآیندهای بیماری در آزمایشگاه بافت شناسی جهت تولید اسلاید میکروسکوپی که توسط پاتولوژیست بررسی می‌شود، در یک پروسه تهیه می‌گردد. تکنیک مناسب برای پردازش بافت‌ها اعم از نمونه‌های بزرگ حاصل از عمل جراحی و یا نمونه بافت حاصل از کالبد شکافی (نمونه از جسد/ اتوپسی) در زیر شرح داده شده است.

الحاق نمونه

نمونه‌های بافتی یک فرم درخواست به همراه خود دارند که شامل لیستی از اطلاعات بیمار و تاریخ نمونه‌برداری همراه با شرح حال مختصر و محل نمونه‌برداری می‌باشند. هر یک از نمونه‌ها با اختصاص‌دادن یک شماره که خاص هر نمونه مربوط به هر بیمار است، شناسایی می‌شوند. در این شماره‌گذاری به‌طور معمول رقم اول نشان‌دهنده سال می‌باشد و همچنین در برخی موارد استفاده از حروف برای نشان‌دادن نوع بافت بکار می‌رود.

بررسی ماکروسکوپیک

این نوع بررسی را به‌طور معمول پاساژ می‌نامند که در آن بافت جدا شده از بدن برای تشخیص به بخش پاتولوژی وارد می‌شود و توسط پاتولوژیست، دستیار پاتولوژی، یا افراد حاضر در بخش آسیب‌شناسی مورد بررسی قرار می‌گیرد. بررسی ماکروسکوپی متشکل از توصیف نمونه و قراردادن تمام یا بخشی از آن به یک کاست پلاستیکی کوچک و سپس پردازش آن در یک بلوک پارافین می‌باشد. ابتدا کاست‌ها در فیکاستیو (ثابت‌کننده) قرار می‌گیرند.

هنگامی که نمونه مشکوک به یک بدخیمی است اغلب با جوهر رنگی به منظور مشخص‌کردن قسمت مورد نظر علامت‎گذاری می‌شود. در صورت نیاز از رنگ‌های مختلف برای مشخص‌کردن محل‌های مختلف استفاده می‌گردد و هنگامی که بررسی مربوطه به اتمام رسید، قسمت‌های مختلف با رنگ‌های متفاوت به اسلاید مربوط به آن رنگ انتقال داده می‌شود.

تثبیت و انواع تثبیت‌کننده‌ها

هدف از تثبیت این است که بافت‌های نمونه‌برداری شده را از نظر ساختاری حفظ کرد. تثبیت باید در اسرع وقت پس از جداسازی بافت‌ها (از بدن) و یا بلافاصله پس از مرگ (با کالبد شکافی) برای جلوگیری از اتولیز انجام گیرد. تثبیت‌کننده ایده‌آلی وجود ندارد و در حال حاضر بهترین آن فرمالدئید است. بنابراین تنوع زیادی از تثبیت‌کننده‌ها وجود دارد که بر حسب نوع بافت و شکل آن‌ها استفاده می‌شود.

پنج دسته از تثبیت‌کننده‌ها وجود دارند که بر حسب عملکرد تقسیم‌بندی می‌شوند.

• مواد اکسیدان
• آلدئیدها
• نمک آلی یا معدنی اسید پیکریک
• جیوه‌ای
• الکل‌ها

آلدئیدها

این دسته از تثبیت‌کننده‌ها شامل فرمالدئید (فرمالین) و گلوتالدئید می‌شوند. تثبیت بافت به خصوص بین رزیدوهای^[1] لیزین بافت در اتصال متقابل^[2] در پروتئین‌ها تشکیل می‌شود. اتصال متقابل به ساختار پروتئین‌ها آسیب نمی‌رساند. بنابراین فرمالدئید برای تکنیک‌های ایمونوپراکسیداز مناسب است. فرمالدئید به دیواره بافت به آرامی نفوذ می‌کند. محلول استاندارد مورد استفاده معمولا فرمالین 100 درصد می‌باشد. بافر از اسیدی شدن بافت که موجب اتولیز می‌شود ممانعت می‌کند و باعث رسوب رنگدانه فرمالین در بافت می‌گردد.

هرچند گلوتالدئید به علت تخریب ساختار مارپیچ آلفا در ساختار پروتئین برای رنگ‌آمیزی ایمونوپراکسیداز قابل استفاده نیست ولی سرعت رنگ‌آمیزی را بالا می‌برد و برای میکروسکوپ الکترونیکی مناسب می‌باشد. این تثبیت‌کننده نفوذ بسیار ضعیفی دارد، اما به‌طور کلی جزئیات سیتوپلاسمی و هسته‌ای را به خوبی نشان می‌دهد. محلول استاندارد گلوتالدئید بافردار 2 درصد است.

جیوه‌ای

جیوه‌ای‌ها توسط یک مکانیسم ناشناخته بافت را تثبیت می‌کنند. آن‌ها حاوی کلرید جیوه و شامل تثبیت‌کننده شناخته‌شده به عنوان B-5 و Zenker هستند. این تثبیت‌کننده‌ها نفوذ نسبتا ضعیفی داشته و باعث ایجاد سختی در بخشی و یا برخی از بافت‌ها می‌شوند، اما بافت را به سرعت و با جزئیات هسته‌ای عالی نشان می‌دهد. بهترین کاربرد آن‌ها برای تثبیت بافت‌های خونساز و رتیکولوندوتلیال است. از آنجا که این تثبیت‌کننده‌ها حاوی جیوه هستند، باید هنگام کار با آن‌ها دقت و ملاحظات لازم صورت گیرد.

الکل‌ها

الکل‌ها، از جمله الکل متیلیک (متانول) و اتیل الکل (اتانول)، دناتورکننده^[3] پروتئین هستند و به‌طور معمول برای بافت استفاده نمی‌شوند زیرا باعث شکنندگی و سختی بیش از حد بافت می‌گردند. با این حال، آن‌ها برای اسمیر سلولی مناسب می‌باشند زیرا به سرعت وارد عمل شده و جزئیات هسته‌ای را خوب نشان می‌دهند. قوطی اسپری تثبیت‌کننده الکل برای تثبیت لام بعد از انجام پاپ اسمیر به بازار عرضه شده است.

عامل اکسید کننده

عامل اکسیدکننده شامل تثبیت‌کننده‌های پرمنگنات (پرمنگنات پتاسیم)، تثبیت‌کننده‌های دی کرومات (پتاسیم دی کرومات) و تترا اکسید اوسمیوم می‌باشند. آن‌ها اتصال متقابل در پروتئین ایجاد می‌کنند، اما باعث دناتوراسیون گسترده می‌شوند. بعضی از آن‌ها برای کاربردهای خاص استفاده می‌شوند.

نمک آلی یا معدنی اسید پیکریک

نمک آلی یا معدنی اسید پیکریک شامل تثبیت‌کننده با اسید پیکریک است. در درجه نخست، محلول بوئن را می‌توان نام برد. نحوه عملکرد این تثبیت‌کننده هنوز ناشناخته است. این دسته به خوبی جیوه‌ای‌ها با جزئیات خوب هسته‌ای هستند اما در بافت ایجاد سختی نمی‌کنند. اسید پیکریک در حالت خشک خطر انفجار دارد. به صورت محلول همه چیز حتی پوست را زرد می‌کند.

عوامل موثر بر تثبیت

تعدادی از عواملی که بر روی روند تثبیت تاثیر می‌گذارد عبارت‌ است از:

• دما
• بافر
• غلظت
• نفوذ
• حجم
• فاصله زمان

تثبیت در pH نزدیک به خنثی (6 الی 8) انجام می‌شود. کمبود اکسیژن در بافت‌ها باعث کاهش pH می‌شود، بنابراین باید ظرفیت بافری در ثابت‌کننده برای جلوگیری از اسیدیته بیش از حد وجود داشته باشد. اسیدیته به نفع تشکیل رنگدانه فرمالین به صورت سیاه، قطبی شدن رسوبات در بافت می‌باشد. بافرهای شایع عبارتنداز بافر فسفات، بیکربنات، cacodylate، veronal می‌باشند. بافرتجاری فرمالین بافر فسفات در pH معادل 7 است.

نفوذ به بافت به قدرت نفوذپذیری هر یک از ثابت‌کننده‌ها که مختص خودشان است، بستگی دارد. فرمالین و الکل بهترین نفوذ، و گلوتالدئید بدترین نفوذ را دارند. جیوه‌ای‌ها و برخی دیگر در جایی میان این دو قرار دارند. یک راه حل این مشکل این است که برش بافت نازک ( 2 تا 3 میلی‌متر) گرفته شود. نفوذ به یک بخش نازک‌تر با سرعت بیشتری از بخش ضخیم رخ خواهد داد.

حجم

حجم تثبیت‌کننده بسیار مهم و تعیین کننده است. نسبت 10:1 تثبیت‌کننده به بافت باید وجود داشته باشد. بدیهی است، در صورت حجم کمتر از این مقدار تثبیت ایده‌آل صورت نگیرد. یک راه برای برطرف‌کردن این مشکل تغییر تثبیت‌کننده‌ها در فواصل زمانی ثابت است. تحرک نمونه در تثبیت‌کننده نیز تثبیت را افزایش می‌دهد.

دما

افزایش درجه حرارت، همانند افزایش دما در تمام واکنش‌های شیمیایی، سرعت تثبیت را افزایش می‌دهد، افزایش تا زمانی که بافت به حالت پختگی نرسد صورت می‌گیرد. فرمالین گرم بافت را سریعتر تثبیت می‌کند و این اغلب قدم اول در پردازشگر بافت خودکار است.

غلظت

با توجه به هزینه تعهد تهیه مواد، غلظت مواد تثبیت‌کننده باید به پایین‌ترین سطح ممکن تنظیم شود. غلظت مناسب فرمالین همانطور که گفته شد 10 درصد است و گلوتالدئید 0.25 درصد تا 4 درصد ساخته می‌شود. غلظت بیش از حد ممکن است به بافت‌های بدن همانند افزایش حرارت بیش از حد، تاثیر منفی باقی بگذارد. نکته بسیار مهم فاصله زمانی از برداشت بافت‌ها و قرارگرفتن در تثبیت‌کننده است. برای جلوگیری از ایجاد آرتیفکت در بافت و نمونه هنگام گرفتن نمونه آن را در محلول مرطوب نگه دارد. فاصله زمانی زیاد در این امر موجب از بین رفتن آرگانل‌های سلولی و هسته‌ای و تجمع آرتیفکت می‌شود.

استفاده مشترک برای تثبیت‌کننده‌ها در آزمایشگاه آسیب‌شناسی بر اساس ماهیت تثبیت‌کننده‌ها، نوع بافت و جزئیات بافت وجود دارد. فرمالین برای همه نمونه‌های پاتولوژیک حاصل از عمل جراحی و بافت‌های حاصل از کالبد شکافی در رنگ‌آمیزی H&E استفاده می‌گردد.

فرمالین بهترین تثبیت‌کننده است حتی در شرایطی که ایده‌آل نیست. به طور معمول هیچ بافتی وجود ندارد که به آن در طی تثبیت‌شدن آسیب قابل توجهی وارد شود. اکثر پرسنل می‌توانند فرمالین را تشخیص دهند زیرا به اندازه کافی بوی تند دارد که آن‌ها مراقب دست‌زدن و استنشاق آن باشند.

تثبیت‌کننده Zenker برای بافت رتیکولواندوتلیال از جمله غدد لنفاوی، طحال، تیموس، و مغز استخوان توصیه می‌شود. این تثبیت‌کننده نه تنها هسته را به خوبی نشان می‌دهد بلکه جزئیات خوبی از آن را نیز نمایان می‌سازد. با این حال ذخایر جیوه (Dezenkerized) قبل از رنگ‌آمیزی باید برداشته شود در غیر این صورت ذرات سیاه به وجود می‌آیند.

گاهی اوقات استفاده از محلول بوئن به عنوان تثبیت‌کننده، بافت‌های بیضه، دستگاه گوارش و بافت غدد درون‌ریز توضیه میشود. اما برای بافت‌های خونساز مناسب نیست و در هنگام استفاده از این محلول نیازی هم نیست که قبل از رنگ‌آمیزی جیوه برداشته شود. گلوتالدئید برای تثبیت بافت برای میکروسکوپ الکترونی توصیه میشود. گلوتالدئید باید سرد و بافردار باشد و بیش از 3 ماه نمی‌بایست استفاده شوند. بافت باید تازه باشد و ترجیحا برش در داخل گلوتالدئید با ضخامت کمتر از 1 میلی‌متر به منظور افزایش تثبیت صورت گیرد.

الکل‌ها، به‌طور خاص اتانول، در درجه اول برای اسمیر استفاده میشوند. استفاده از اتانول (95 درصد) تکنیکی سریع و ارزان است. از آنجا که اسمیر تنها یک ردیف سلول ضخامت دارد، هیچ مشکلی از نظر کوچک شدن وجود ندارد و از آنجایی که اسمیر مانند برش نیست، هیچ مشکلی ناشی از شکنندگی وجود ندارد.

برای تثبیت برش‌های منجمد، شما می‌توانید از هر نوع تثبیت‌کننده‌ای استفاده کنید، اگرچه متانول و اتانول بهترین هستند.

پردازش بافت

پس از اینکه بافت ثابت شد، باید آن را به فرمی که بتوان مقاطع نازک میکروسکوپی از آن تهیه کرد پردازش شود.

روش معمول با پارافین انجام می‌شود. بافت‌های جداسازی شده در پارافین، که در چگالی به بافت مشابه است، می‌تواند در هر نقطه از 3 تا 10 میکرون برش بخورند که به‌طور معمول 6 الی 8 میکرون می‌باشند. روشی که در آن بافت تثبیت‌شده به پارافین وارد میشود، پردازش بافت نامیده میشود. گام های اصلی در این فرآیند از دست‌دادن آب و پاکسازی است.

پارافین به بافت تثبیت‌شده مرطوب (در حلال‌های آبی) نمیتواند به‌طور مستقیم نفوذ کند. اول باید آب از بافت گرفته شود که معمولا با یک سری از الکل‌ها انجام میشود و از الکل 70 درصد شروع شده به 95 درصد تا 100 درصد ختم میشود. گاهی اوقات اولین گام ترکیبی از فرمالین و الکل است. آبگیری‌های دیگر ار میتوان مورد استفاده قرار داد، اما دارای معایب عمده‌ای هستند. استون بسیار سریع است، اما خطر آتش سوزی دارد، بنابراین از استون فقط برای پردازش مجموعه بافت‌های کوچک استفاده میشود. دی اکسان را میتوان بدون پاکسازی استفاده کرد، اما بخار ناشی از آن سمی است.

گام بعدی “پاکسازی” است و متشکل از حذف آبگیرها است که این مرحله با استفاده از ماده‌ای است که بتواند پارافین را در خود نماید. شایع‌ترین عامل پاکسازی گزیلول است. تولوئن به خوبی کار میکند و مقدار کمی از آب در بافت بافی‌مانده، اما 3 برابر گران‌تر از گزیلول است. از کلروفرم هم میتوان استفاده کرد، اما هم خطرناک است و هم آهسته عمل میکند. متیل سالیسیلات نیز به ندرت مورد استفاده قرار میگیرد، زیرا گران است اما بوی مطلوعی دارد.

عوامل جدی‌تر پاکسازی برای استفاده وجود دارد. بسیاری از آن‌ها در لیمونن، روغن‌های سبک موجود در پوست مرکبات هستند. از دیگر انواع، زنجیره‌ای طولانی هیدروکربن آلیفاتیک^[4] را میتوان نام برد. اگرچه خطر کمتری دارند اما بافت را خشک، و برش بافت را ضعیف میکنند.

در نهایت، بافت با ماده تعبیه‌شده که تقریبا همیشه پارافین است، باقی‌می‌ماند. پارافین میتواند رد نقطه ذوب تفاوت، برای سختی‌های مختلف، بسته به راه تهیه بافت و بر حسب آب‌و‌هوا (گرم در برابر سرد) خریداری شود.

یک محصول به نام پاراپلاست می‌توان اضافه کرد که بلوک پارافینی، آسان‌تر برش می‌زند. خلا می‌تواند در داخل پردازنده‌های بافت برای کمک به نفوذ عامل تعبیه اعمال شود.

فرآیندهای فوق تقریبا همیشه برای حجم زیادی از بافت‌های معمول پردازش خودکار می‌باشد. اتوماسیون متشکل از دستگاهی است که بافت‌های اطراف را از طریق عوامل مختلف در یک مقیاس زمانی از پیش ‎تعیین‎شده حرکت می‌دهد. “تکنیکان” یکی از شایع‌ترین و قابل اطمینان‌ترین پردازنده‌های بافت (مکانیکی به همراه یک الکتروموتور با درایوهای چرخ دنده‌ها است.) هرچند دیگر ساخته نمی‌شود. پردازنده‌های جدیدتر دارای هوش مصنوعی هستند که آن‌ها را کنترل می‌کنند یک خلا و یا گرما می‌تواند برای پردازش بکار رود.

بافت آماده است و هنوز در نوار کاست قرار دارد و باید توسط کارشناس مربوطه به صورت دستی به بلوک قرار داده شود. باید بافت را انتخاب کنید، از نوار کاست بیرون آورده و پارافین مذاب بر آن‌ها بریزید.

این “جاسازی” روند بسیار مهمی است، زیرا بافت باید به درستی در وسط بلوک پارافینی قرارگیرد حتی در برخی اوقات بسته به نظر پاتولوژیست نمونه باید جاسازی پارافین وجود دارد، پلاستیک‌های مختلف مقاطع نازک‌تری را می‌تواند ایجاد کند که شامل پلاستیک‌های شامل متاکریلات متیل، در متاکریلات، آرلدیت^[5]، اپون^[6] گلیکول می‌باشد.

متیل متاکریلات بسیار سخت است و به همین دلیل برای تعبیه استخوان برای حذف کلسیم استفاده می‌شود.

متاکریلات و گلیکول گسترده‌ترین استفاده از جهت سادگی کار را دارند.

آرالدیت همانند متاکریلات است، اما نیاز به یک فرآیند پیچیده‌تری جهت تعبیه دارد. از اپون به‌طور مداوم برای میکروسکوپ الکترونی که نیاز به یک برش بسیار نازک است، استفاده می‌شود. پلاستیک نیاز به معرف ویژه‌ای برای از دست دادن آب و پاکسازی دارد که گران قیمت هستند.

از آنجا که این نوع جاسازی شدن جهت پردازش به میکروتوم ویژه‌ای برای برش بلوک نیاز دارد و بلوک‌های کوچک ایجاد می‌شود، بنابراین این روش به نمونه‌های کوچک، از جمله مغز استخوان یا کبد اختصاص داده می‌شود.

برش

هنگامی که بافت‌ها جاسازی شدند، آ‌ها را باید به کمک وسیله‌ای به نام میکروتوم برش داده تا در قالب یک اسلاید قرار گیرند. میکروتووم وسیله‌ای است بیش از یک چاقو با یک مکانیسم برای برش بافت-پارافینی بلوک شده است. نکته‌ی مهمی که برای برش مناسب وجود دارد وجود تیغ بسیار تیز است.

تیغ‌ها هر کدام از انواع فلزی ضخیم و یا نازک استاندارد و انواع یک بار مصرف می‌باشند. انواع قدیمی این امکان را داشتند تا در حد مطلوب تیز شوند اما گران بودند. هزینه تیغه‌های جدید تقریبا خوب به‌نظر می‌رسد.

بلوک‌های پلاستیکی (متاکریلات، آرلدیت، یا اپون) با شیشه یا تیغ الماس برش می‌شوند. تیغ شیشه‌ای می‌تواند برشی را در حدود 1 میکرون تهیه کند. مقاطع نازک برای میکروسکوپ الکترونی (1.4 میکرون) با یک چاقو الماس بسیار گران قیمت است انجام می‌شود. معمولا این فاصله را که دامنه آن 6 تا 8 میکرون می‌باشد می‌توان تنظیم کرد. برش بافت یک هنر است و حاصل مهارت و تمرین زیادی می‌باشد.

مهم‌ترین مشکل در هنگام تهیه برش، پاره و سوراخ شدن و یا چروک خوردن و … می‌باشد. جهت کاهش چروک‌ها در برش، آن‌ها را در حمام آب گرم که به حذف چین و چروک کمک می‌کند شناور می‌کنند. سپس آن‌ها را بر روی یک اسلاید شیشه‌ای تمیز میکروسکوپی قرار می‌دهند.

قرار گرفتن لام در انکوباتور گرم به مدت حدود 15 دقیقه، صرفا جهت کمک به چسبیدن بخش برش داده شده به اسلاید است. اگر برای رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی برش تهیه می‌شود، این حرارت ممکن است به آنتی ژن‌ها آسیب برساند، پس این مرحله می‌تواند نادیده گرفته شود و با استفاده از چسب مخصوص برش را به چسب و در نهایت به اسلاید متصل کرد.

برش منجمد

گاهی اوقات در طول انجام اعمال جراحی، لازم است یک تشخیص سریع از روند پاتولوژیک بدست آید. جراح تا قبل از اتمام عمل جراحی می‌خواهد بداند که آیا حاشیه برداشت شده یک نئوپلاسم است یا خیر؟ و به هر حال ممکن است یک بیماری غیرمنتظره یافت شود و نیاز به تشخیص صحیح برای تصمیم‌گیری داشته باشد، که این از طریق برش یخ زده انجام می‌شود.

قطعه‌ها از بافت مورد مطالعه، به‌طور ناگهانی منجمد شده در یک مایع سرد و یا محیط سرد (20- تا 70- درجه سانتی‌گراد) قرار داده می‌شوند. انجماد باعث می‌شود بافت جامد به اندازه کافی با میکروتوم برش بخورد. برش بافت یخ زده با ابزاری به نام کرایواستات انجام می‌شود. این دستگاه فقط یک یخچال حاوی میکروتوم است. درجه حرارت در داخل دستگاه حدود 20- تا 30- درجه سانتی‌گراد است. مقاطع بافتی برش داده شده و بر روی یک اسلاید شیشه‌ای برداشت شده است. برش‌ها آماده برای رنگ‌آمیزی می‌شوند.

رنگ‌آمیزی

روند تعبیه به‌منظور خارج شدن موم پارافین از بافت باید معکوس شود تا رنگ محلول در آب برای نفوذ به بخش‌های آن اجازه پیدا کند. بنابراین، قبل از هرگونه رنگ‌آمیزی، پارافین موجود در اسلاید باید حذف شود و این عمل از طریق گزیلول (یا جایگزین) صورت می‌گیرد. هیچ رنگی نیست که بتواند بر روی بافت‌های حاوی پارافین قرار گیرد. فرآیند رنگ‌آمیزی با استفاده از انواع رنگ‌ها انجام می‌شود. هر کدام از این رنگ‌ها برای رنگ‌آمیزی اجزای مختلف سلولی از بافت صورت می‌گیرد. روال معمول رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و اتوزین (H&E) می‌باشد.

رنگ‌های دیگر به عنوان “رنگ ویژه” نامیده می‌شوند زیرا آن‌ها در شرایط خاص با توجه به نیاز تشخیصی استفاده می‌شوند.

برش یخ زده با روش دستی رنگ‌آمیزی می‌شود، همچنین برش باید در محفظه مرطوب نگه‌داری شود و رنگی که در آن برش استفاده می‌شود در محفظه مربوطه باقی می‌ماند تا کیفیت رنگ‌آمیزی مورد نظر بدست آید.

رنگ‌آمیزی H&E

هماتوکسیلین محصول اکسید شده از درخت بقم شناخته شده به عنوان hematein است. از آنجا که این درخت بسیار نادر است در حال حاضر، اغلب hematein به‌صورت مصنوعی به‌دست می‌آیند. به منظور استفاده از آن به عنوان یک رنگ باید “رسیده” و یا اکسید باشد. هماتوکسیلین به‌طور غیرمستقیم بافت را رنگ می‌کند و نیاز به یک لینک به بافت دارد.

این رنگ با کاتیون‌های فلزی مانند آهن، آلومینیوم، و یا تنگستن تهیه می‌شود. انواع هماتوکسیلین برای استفاده در دسترس است که تا حدی بر اساس انتخاب از یون‌های فلزی استفاده می‌شوند. آن‌ها در شدت و یا رنگ متفاوت می‌باشند. هماتوکسیلین، که رنگ پایه است، میل به ترکیب با اسیدهای نوکلئیک هسته سلول را دارد.

رنگ هماتوکسیلین یا “واپسگرا” و یا “پیشرونده” است. با رنگ واپسگرا اسلایدها را در مدت زمان تعیین شده در رنگ قرارداده و بعد از آن در اسید الکل قرار می‌دهیم تا بخشی از رنگ از بین برود. این روش بهترین راه‌حل برای تعداد زیادی اسلاید برای رنگ‌آمیزی است. با رنگ پیشرونده اسلاید در هماتوکسیلین غوطه‌ور شده تا شدت رنگ مورد نظر بدست آید. این روش برای برش منجمد نیز بکار می‌رود.

آئوزین (H&E) رنگ اسیدی با میل برای اجزا سیتوپلاسمی سلول است. انواع مختلفی از این رنگ برای استفاده ساخته شده است، که متفاوت هستند، اما همه آن‌ها همان کار را انجام می‌دهند. ائوزین (H&E) از هماتوکسیلین کم دردسرتر است و کمتر در آزمایشگاه مشکل‌ساز است. تنها مشکلی که مشاهده خواهید کرد رنگ‌گیری بیش از حد به خصوص با بافت دکسیفیه شده است.

پوشاندن لام

به زبان ساده و در اصطلاح عامیانه همان مونته‌کردن است که باید بافت رنگ شده را با یک قطعه شیشه‌ای پوشاند این کار هم برای بهتر دیدن و هم برای نگهداری لام برای مدت طولانی است.

کلسیم‌گیری/دکلسیفیه‌کردن

برخی از بافت‌ها حاوی رسوب کلسیم است و بنابراین بسیار محکم بوده به‌طوریکه با توجه به اختلاف در چگالی بین کلسیم و پارافین برش به درستی با پارافین تعبیه شده انجام نمی‌گیرد. نمونه استخوان محتمل‌ترین نوع در اینجا است، اما سایر بافت‌ها نیز ممکن است نواحی کلسیفیه داشته باشند. این کلسیم باید قبل از تعبیه برای برش برداشته شود. برای حذف کلسیم بافت انواع مواد و یا تکنیک‌های مختلف استفاده می‌شود ولی هیچ یک از آن‌ها به‌طور کامل کار نمی‌کنند. از اسیدهای معدنی، اسیدهای آلی، EDTA و الکترولیز برای این امر استفاده می‌شود. اسیدهای معدنی قوی مثل نیتریک و اسید هیدروکلریک با استخوان متراکم استفاده می‌شود زیرا آن‌ها به مقدار زیادی از کلسیم را سریع حذف می‌کنند. متاسفانه این اسیدهای قوی به مورفولوژی سلولی آسیب وارد می‌کنند. بنابراین برای بافت‌های ظریف مانند مغز استخوان توصیه نمی‌شوند. اسیدهای آلی مثل اسید استیک و اسید فرمیک برای مغز استخوان مناسب‌تر است، چراکه آن‌ها اثر شدید ندارند. با این حال، عمل آن‌ها در استخوان متراکم آهسته‌تر است. اسید فرمیک در غلظت 10 درصد، غلظت مناسب برای کلسیم‌گیری است. برخی از محلول‌های تجاری در دسترس هستند که حاوی ترکیب اسید فرمیک با فرمالین بوده و عمل تثبیت بافت و کلسیم‌گیری بافت را همزمان انجام می‌دهند.

EDTA می‌تواند کلسیم را حذف کند، اما نفوذ آن به بافت ضعیف و آرام است و در مقدار زیاد گران است. الکترولیز در شرایط تجربی کلسیم را با حداقل آسیب بافتی برداشت می‌کند چون که آهسته عمل می‌کند و برای استفاده روزمره مناسب نیست.

آرتیفکت/ناخالصی در برش بافت شناسی

موارد آرتیفکت در لام ممکن است به علل زیر باشند:

• تثبیت نامناسب
• تثبیت‌کننده نامناسب
• ازدست‌دادن ضعیف آب و نفوذ ضعیف پارافین
• معرف نامناسب
• برش ضعیف میکروتوم

حضور یک رسوب سیاه در اسلایدها، اغلب بدون هیچ رابطه‌ای به بافت (به عنوان مثال، در بافت‌های مجاور و یا در داخل عروق) ایجاد می‌شود که کمپلکس فرمالین – هِم می‌باشد. رنگدانه فرمالین – هِم اغلب در بافت سلولی یا خونی دیده می‌شود. و یا در کالبد شکافی، این کمپلکس زمانی که بافر فرمالین کهنه شده و بافت اسیدی می‌شود، تشکیل مجموعه‌ای هم ( از سلول‌های قرمز خون) و فرمالین زیاد می‌شود. در بافت‌هایی مانند طحال و غدد لنفاوی این کمپلکس به میزان زیادی ایجاد می‌شود. تهیه‌ی مقاطع نازک و استفاده کافی از بافر خنثی فرکالین (10 تا 1 نسبت تثبیت‌کننده به بافت) کمک کننده خواهد بود.

اگر محصول تثبیت‌کننده که در آن بافت‌ها قرار گرفته است به شدت قهوه‌ای مایل به قرمز رنگ باشد، باید تثبیت‌کننده جدید جایگزین شود. حضور توده بزرگ نامنظم از رسوبات سیاه و سفید بر روی اسلاید بافت تثبیت شده توسط جیوه مانند B-5 نشان می‌دهد که بافت قبل از رنگ‌آمیزی آماده نبوده است. این رسوب سیاه با میکروسکوپ نور قطبی شده (پلاریزه) سفید نیز به نظر می‌رسد. بافت‌هایی از بدن که قبل از پاکسازی و نفوذ با موم پارافین به اندازه کافی آب از دست‌داده و سخت شده‌اند، برش میکروتوم در آن به سختی انجام می‌گیرد و با آثار و سوراخ در برش موجه خواهیم شد. چرخه پردازنده بافتی باید اجازه دهد که زمان کافی برای ازدست‌دادن آب سپری شود و نهایتا آبگیر اتانول باید در غلظت 100 درصد باشد. در آب و هوای مرطوب، این مشکل برای رسیدن به نتیجه ایده‌آل وجود دارد. پوشیدن و یا بستن محلول‌ها از هوای محیط به شما کمک خواهد کرد. تهویه هوا (مبرد، با کولر تبخیری) همچنین رطوبت در آزمایشگاه را کاهش می‌دهد. تولوئن به عنوان عامل پاکسازی برای بافت‌هایی که به سختی آب از دست دهند استفاده می‌شود، اما گران‌تر می‌باشد. اگرچه الکل‌هایی مانند اتانول را تثبیت‌کننده عالی برای اسمپر سلولی می‌دانند، آن‌ها تمایل به ایجاد بافت شکننده داشته و در نتیجه آرتیفکت در برش میکروتوم دیده می‌شود. حباب زیر لام هنگام مونته‌کردن ممکن است زمانی تشکیل شود که چسب ریخته شده بیش از حد کم باشد، و آن حاصل مکیده شدن از هوای خشک زیر لام است.

مشکلات در پردازش بافت

“فلوتر” قطعه کوچکی از بافت است که بر روی اسلایدهایی که به آن‌ها تعلق ندارند وجود دارد_ آن‌ها در طول پردازش شناور شده‌اند. فلوتر ممکن است از روش درهم و برهم بر روی سینی برش بوجود آید_ حوله کثیف، ابزار و یا دستکش می‌توانند در بوجود آمدن آن موثر باشد.

بنابراین، ضروری است که شما فقط یک نمونه را در یک زمان انجام دهید و سینی را قبل از بازکردن ظرف مورد بعدی به طور کامل تمیز کنید. بهترین راه برای جلوگیری از فلوتر این است که نمونه‌های یکسان را در شماره‌های جدا از هم انجام دهید. به عنوان مثال، اگر شما سه مورد را با تراشه‌های پروستات، با نمونه‌های کاملا متفاوت مانند رحم یا معده که آن‌ها را از هم جدا می‌کند قرار دهید، در صورت استفاده مجدد از کاست‌ها باید توجه داشت که بخشی از بافت باقی نمانده باشد چون این بافت باقی‌مانده از قبل با بافت جدید اگر دقت نشود با پارافین قالب گرفته می‌شود و برش داده شده و آنگاه  در تشخیص ایجاد مشکل می‌کند. همیشه از درستی نمونه، نام و نوع آن اطمینان حاصل کنید! به این معنی که شما می‌توانید اطمینان حاصل کنید که برچسب بیمار در ظرف نمونه و شماره آن صحیح باشد و شماره مسلسل به نمونه داده شده است. این شماره باید با بافت در تمامی زمان‌ها بررسی شود. شما باید از ثبت‌کردن کاست از بافت بدون برچسب و یا یک کاست از بافت با برچسب اشتباه خودداری کنید.

ایمنی در آزمایشگاه

آزمایشگاه باید به خوبی به سیستم تهویه مجهز شده باشد. مقررات مربوط به کار با فرمالین و هیدروکربن مانند گزیلول و تولوئن وجود داشته باشد. محدودیت‌هایی توسط اداره ایمنی شغلی و سلامت (OSHA) تعیین شده است. این محدودیت اخیرا تجدید نظر شده است. هر ترکیب شیمیایی مورد استفاده در آزمایشگاه باید دارای جدول داده‌هایی باشد که مشخصات طبیعت، سمیت و اقدامات احتیاطی به هنگام دست‌زدن به ترکیب را شامل شود. آزمایشگاه باید یک روش مناسب برای دفع زباله‌های خطرناک را داشته باشد. بافت‌هایی از بدن که جمع‌آوری می‌شوند باید در فرمالین ذخیره شوند و ممکن است با سوزاندن و یا با قراردادن یک چرخ متصل به یک سینک بزرگ (شبیه به یک واحد بزرگ دفع زباله) دفع شود. هر ابزار مورد استفاده در آزمایشگاه باید از مشخصات ایمنی برق (UL تایید شده) برخوردار بوده و دستورالعمل‌های مربوط به استفاده از آن به صورت نوشته در دسترس باشد. مواد قابل‌اشتعال فقط در اتاق‌های مخصوص و تایید شده و تنها در کابینت‌های ذخیره‌سازی که برای این منظور طراحی شده است، نگهداری شوند.

تجهیزات ایمنی از جمله آتش‌خاموش‌کن، پتو آتش، و هشداردهنده باید به آسانی در دسترس باشند. دوش اضطراری نیز باید به آسانی در دسترس باشد. حوادث در آزمایشگاه را باید به صورت مستند گزارش نمود.

خطرات خاص که باید به آن توجه جدی داشت عبارتنداز:

محلول بوئن با اسید پیکریک ساخته شده است. این اسید که تنها در حالت آبی فروخته می‌شود هنگامی که خشک باشد، تبدیل به مواد منفجره می‌شود.

در بسیاری از معرف‌های موجود در کیت‌ها از آزید سدیم به عنوان یک ماده نگهدارنده استفاده می‌شود. این ماده نیز جز مواد منفجره است. بنریدین، بنزین، آنتراسن و naphthol حاوی ترکیبات سرطان‌زا است و نباید مورد استفاده قرارگیرند.

محلول حاوی جیوه (zenker یا B-5) تا هنگام دور ریختن همیشه باشد در ظروف مناسب نگهداری شوند.

https://medpip.com/video/Tissue-processing

واژه‌نامه: