راهنمای جامع آزمایشگاهی جداسازی، شناسایی و ارزیابی بیماری‌زایی گونه‌های یرسینیا

جنس Yersinia (یرسینیا) به دلیل توانایی منحصربه‌فرد در رشد و تکثیر در دماهای پایین، حتی در دمای یخچال، و همچنین نقش مهم گونه‌های بیماری‌زای آن در بروز عفونت‌های منتقله از طریق مواد غذایی، یکی از مهم‌ترین باکتری‌های مورد توجه در میکروب‌شناسی مواد غذایی و آزمایشگاه‌های تشخیص طبی محسوب می‌شود.

پیچیدگی ویژگی‌های بیوشیمیایی، تنوع سروگروه‌ها (Serogroups) و وجود عوامل متعدد بیماری‌زایی  (Virulence Factors)  که بخشی از آن‌ها روی کروموزوم و بخشی دیگر روی پلاسمید قرار دارند، شناسایی دقیق این باکتری‌ها را به فرایندی تخصصی و چندمرحله‌ای تبدیل کرده است.

در این مقاله، تمامی مراحل استاندارد جداسازی، غنی‌سازی، شناسایی و ارزیابی بیماری‌زایی گونه‌های یرسینیا بر اساس دستورالعمل FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) به‌صورت گام‌به‌گام گردآوری شده است تا به‌عنوان یک مرجع کاربردی برای کارشناسان آزمایشگاه، پژوهشگران و دانشجویان علوم آزمایشگاهی مورد استفاده قرار گیرد.

یرسینیا انتروکولیتیکا (Yersinia enterocolitica)

گونه Yersinia enterocolitica و باکتری‌های نزدیک به آن تقریباً در همه محیط‌های طبیعی یافت می‌شوند. این میکروارگانیسم‌ها بارها از منابع مختلفی مانند خاک، آب، حیوانات و طیف گسترده‌ای از مواد غذایی جداسازی شده‌اند.

این گروه از نظر ویژگی‌های بیوشیمیایی ناهمگون است و یکی از مهم‌ترین خصوصیات آن، توانایی رشد در دمای یخچال است. همین ویژگی، استفاده از روش غنی‌سازی در سرما (Cold Enrichment) را به یکی از مؤثرترین روش‌های جداسازی یرسینیا تبدیل کرده است.

بررسی‌های بیوشیمیایی و مطالعات مربوط به میزان شباهت DNA در ابتدا این گروه را به چهار گونه تقسیم کردند:

• Yersinia enterocolitica
• Yersinia intermedia
• Yersinia frederiksenii
• Yersinia kristensenii

با پیشرفت مطالعات تاکسونومی، جنس Yersinia گسترش یافت و امروزه شامل یازده گونه شناخته‌شده است. با این حال، تنها سه گونه از این جنس به‌عنوان عوامل بالقوه بیماری‌زا برای انسان شناخته می‌شوند:

• Yersinia pestis
• Yersinia pseudotuberculosis
• Yersinia enterocolitica

در میان این سه گونه، Yersinia enterocolitica  مهم‌ترین عامل ایجاد بیماری‌های منتقله از طریق غذا به شمار می‌رود.

سروگروه‌های یرسینیا انتروکولیتیکا

سویه‌های یرسینیا انتروکولیتیکا و گونه‌های نزدیک به آن از نظر سرولوژیک، بر اساس آنتی‌ژن‌های سوماتیک مقاوم به حرارت (Heat-stable Somatic Antigens)، در گروه‌های مختلفی طبقه‌بندی می‌شوند.

در نخستین طبقه‌بندی،شخصی به نام Wauters تعداد ۵۴ سروگروه را برای این باکتری‌ها معرفی کرد. بعدها محققینی به نام Aleksic  و Bockemühl پیشنهاد کردند که این تقسیم‌بندی برای گونه Y. enterocolitica به ۱۸ سروگروه ساده‌سازی شود.

بر اساس مطالعات انجام‌شده، سویه‌های بیماری‌زا در سروگروه‌های زیر شناسایی شده‌اند:

• O:1,2a,3
• O:2a,3
• O:3
• O:8
• O:9
• O:4,32
• O:5,27
• O:12,25
• O:13a,13b
• O:19
• O:20
• O:21

بنابراین، سویه‌های بیماری‌زای Y. enterocolitica می‌توانند به سروگروه‌های متنوعی تعلق داشته باشند؛ با این حال، سروگروه‌هایی که بیشترین ارتباط را با بیماری‌های انسانی دارند عبارت‌اند از:

• O:3
• O:8
• O:9
• O:5,27

منابع انتقال و اهمیت بهداشت مواد غذایی

ارتباط میان ابتلای انسان به یرسینیوز و مصرف مواد غذایی آلوده به Y. enterocolitica، تماس با فضولات حیوانی و مصرف آب آشامیدنی کلرزنی‌نشده، در مطالعات متعدد به اثبات رسیده است.

از آنجا که این باکتری قادر است در دمای یخچال زنده بماند و حتی تکثیر شود، نگهداری مواد غذایی در یخچال لزوماً مانع رشد آن نخواهد شد.

آلودگی مواد غذایی ممکن است در محل تولید، طی فرایند فرآوری، هنگام توزیع یا حتی در محیط منزل ایجاد شود؛ بنابراین، انواع مواد غذایی نگهداری‌شده در یخچال می‌توانند به‌عنوان ناقل این باکتری عمل کنند.

مکانیسم‌های بیماری‌زایی در یرسینیا

مکانیسم بیماری‌زایی در گونه‌های انتروپاتوژن یرسینیا بسیار پیچیده است. این مکانیسم‌ها سال‌هاست به‌عنوان یکی از مهم‌ترین مدل‌های پژوهشی برای مطالعه فرایند عفونت در باکتری‌های بیماری‌زای روده‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرند.

عوامل بیماری‌زایی یرسینیا توسط دو منبع ژنتیکی اصلی کنترل می‌شوند:

• ژن‌های کروموزومی
• ژن‌های پلاسمیدی

عوامل ویرولانس وابسته به کروموزوم

مهم‌ترین عوامل بیماری‌زایی کدشده روی کروموزوم عبارت‌اند از:

ژن ail  در Y. enterocolitica و ژن inv در Y. pseudotuberculosis که مسئول تهاجم باکتری به سلول‌های میزبان هستند.

پروتئین‌های دخیل در اتصال، جذب و انتقال آهن (Irps).

ژن ystA که انتروتوکسین مقاوم به حرارت (Heat-stable Enterotoxin) را کد می‌کند.

عوامل ویرولانس وابسته به پلاسمید

بخش دیگری از عوامل بیماری‌زایی روی پلاسمید ویرولانس ۷۰ کیلوبازی قرار دارند. این پلاسمید در Y. enterocolitica  با نام pYV  و در Y. pseudotuberculosis با نام pIB1 شناخته می‌شود.

ژن‌های مهم موجود روی این پلاسمید عبارت‌اند از:

Yops (پروتئین‌های خارجی یرسینیا)

lcr (پاسخ به غلظت پایین کلسیم)

yadA (پروتئین چسبندگی یرسینیا)

virF (تنظیم‌کننده رونویسی وابسته به دما که بیان بسیاری از ژن‌های پلاسمیدی را کنترل می‌کند)

عوامل ویرولانس یرسینیا انتروکولیتیکا،  انتروتوکسین و پلاسمید ۷۰ کیلوبازی

برای شناسایی سویه‌های بالقوه بیماری‌زای Yersinia enterocolitica، آزمون‌های مختلفی به‌منظور ارزیابی عوامل ویرولانس طراحی شده‌اند.

یکی از مهم‌ترین این عوامل، انتروتوکسین مقاوم به حرارت (Heat-stable Enterotoxin; ST) است که برخی از سویه‌های Y. enterocolitica و گونه‌های نزدیک به آن، در شرایط آزمایشگاهی تولید می‌کنند. وجود این سم را می‌توان با تزریق داخل‌معده‌ای صاف‌شده کشت باکتری به موش‌های شیرخوار شناسایی کرد. این انتروتوکسین از نظر عملکرد شباهت زیادی به انتروتوکسین مقاوم به حرارت تولیدشده توسط Escherichia coli دارد.

با این حال، تولید این سم در گونه‌های Yersinia تنها در دماهای کمتر از ۳۰ درجه سانتی‌گراد و در شرایط آزمایشگاهی رخ می‌دهد.

نکته قابل توجه این است که بسیاری از سویه‌های محیطی یرسینیا قادر به تولید این پروتئین هستند، در حالی که برخی سویه‌های Y. enterocolitica که از سایر جنبه‌ها کاملاً بیماری‌زا محسوب می‌شوند، این سم را تولید نمی‌کنند.

مطالعات جدید نشان داده‌اند که یکی از زیرگونه‌های ژن تولیدکننده ST، با نام ystA، ارتباط بسیار نزدیک‌تری با سویه‌های بیماری‌زای Y. enterocolitica دارد. با وجود این، نقش دقیق انتروتوکسین ST در فرایند بیماری‌زایی یرسینیا هنوز به‌طور کامل مشخص نشده است.

پلاسمید ۷۰ کیلوبازی؛ مهم‌ترین شاخص ویرولانس

گونه‌های Yersinia که عامل یرسینیوز انسانی هستند، معمولاً دارای پلاسمیدی با اندازه تقریبی ۷۰ کیلوباز هستند. وجود این پلاسمید با مجموعه‌ای از ویژگی‌های مرتبط با بیماری‌زایی ارتباط مستقیم دارد، از جمله:

• خودآگلوتیناسیون (Autoagglutination) در برخی محیط‌های کشت در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد؛
• مهار رشد در محیط‌های فاقد کلسیم (Low Calcium Response)؛
• توانایی اتصال رنگ Crystal Violet در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد؛
• افزایش مقاومت در برابر اثر باکتری‌کشی سرم طبیعی انسان؛
• تولید مجموعه‌ای از پروتئین‌های غشای خارجی یرسینیا (Yops) در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد؛
• ایجاد کراتوکنژنکتیویت (آزمون Sereny) در خوکچه هندی یا موش؛
• ایجاد مرگ در موش‌های بالغ و شیرخوار پس از تزریق داخل‌صفاقی (Intraperitoneal; i.p.) با باکتری زنده.

وجود این پلاسمید را می‌توان با استفاده از الکتروفورز ژل یا هیبریداسیون کلنی DNA شناسایی کرد.

با این حال، یافته‌های جدید نشان می‌دهند که وجود پلاسمید به‌تنهایی برای ایجاد ویرولانس کامل در گونه‌های Yersinia کافی نیست. شدت برخی از ویژگی‌های وابسته به این پلاسمید، مانند کشندگی در موش یا توانایی ایجاد کراتوکنژنکتیویت، در سویه‌های مختلف یکسان نیست و علاوه بر پلاسمید، به ژن‌های کروموزومی و حتی سروگروه باکتری نیز وابسته است.

این موضوع نشان می‌دهد که ژن‌های کروموزومی نیز نقش اساسی در بیماری‌زایی یرسینیا ایفا می‌کنند.

نقش ژن‌های کروموزومی در تهاجم سلولی

سویه‌های ویرولانت Yersinia علاوه بر داشتن پلاسمید بیماری‌زایی، قادرند به سلول‌های پستانداران نیز تهاجم کنند. این ویژگی را می‌توان در کشت سلول‌هایی مانند  HeLa به‌خوبی مشاهده کرد.

جالب آن‌که حتی برخی سویه‌هایی که سایر ویژگی‌های ویرولانس خود را از دست داده‌اند، همچنان توانایی ورود به سلول‌های HeLa را حفظ می‌کنند. این موضوع نشان می‌دهد که توانایی تهاجم سلولی، برخلاف بسیاری از عوامل ویرولانس، تحت کنترل ژن‌های کروموزومی قرار دارد.

در  یرسینیا انتروکولیتیکا دو ژن کروموزومی مهم با نام‌های inv و  ail شناسایی شده‌اند که مسئول ایجاد فنوتیپ تهاجمی هستند.

انتقال هر یک از این ژن‌ها به Escherichia coli موجب می‌شود این باکتری نیز توانایی تهاجم به سلول‌های پستانداران را به دست آورد.

ژن inv  امکان تهاجم مؤثر یرسینیا به چندین رده مختلف سلول‌های کشت بافت را فراهم می‌کند. با این وجود، مطالعات Southern blot نشان داده‌اند که توالی‌های این ژن هم در جدایه‌های تهاجمی و هم در جدایه‌های غیرتهاجمی وجود دارد.

این یافته نشان می‌دهد که صرف وجود ژن  inv برای ایجاد تهاجم کافی نیست. مطالعات ژنتیکی بعدی نیز مشخص کردند که نسخه‌های موجود در جدایه‌های غیرتهاجمی معمولاً عملکرد طبیعی ندارند و در نتیجه توانایی ایجاد تهاجم را از دست داده‌اند.

در مقابل، ژن  ailاختصاصیت بیشتری نسبت به سلول‌های میزبان دارد و به نظر می‌رسد فقط در سویه‌های بیماری‌زای  Y. enterocolitica وجود داشته باشد.

بررسی‌ها نشان داده‌اند که تمامی جدایه‌های ویرولانت این گونه هم دارای ژن  ail بوده‌اند و هم توانایی تهاجم به سلول‌های کشت بافت را داشته‌اند. ازاین‌رو، این ژن به‌عنوان یکی از مهم‌ترین عوامل ویرولانس کروموزومی یرسینیا انتروکولیتیکا شناخته می‌شود.

برای بررسی وجود این ژن‌ها در جدایه‌های به‌دست‌آمده از مواد غذایی، می‌توان از روش‌های هیبریداسیون کلنی DNA یا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) استفاده کرد.

ویژگی‌های ویرولانس و شناسایی یرسینیا سودوتوبرکلوزیس (Yersinia pseudotuberculosis)

یرسینیا سودوتوبرکلوزیس در مقایسه با یرسینیا انتروکولیتیکا شیوع کمتری دارد. این گونه بیشتر با حیوانات در ارتباط است و تنها به‌ندرت از نمونه‌های خاک، آب یا مواد غذایی جداسازی می‌شود.

برخلاف یرسینیا انتروکولیتیکا ، سویه‌های Y. pseudotuberculosis از نظر ویژگی‌های بیوشیمیایی تا حد زیادی یکنواخت هستند و اختلاف آن‌ها عمدتاً به توانایی تخمیر سه قند ملی‌بیوز (Melibiose)، رافینوز (Raffinose) و سالیسین (Salicin) محدود می‌شود.

از دیدگاه سرولوژیک، این گونه بر اساس آنتی‌ژن‌های سوماتیک مقاوم به حرارت به شش سروگروه تقسیم می‌شود و تمامی این سروگروه‌ها می‌توانند شامل سویه‌های بیماری‌زا باشند.

مطالعات  Gemski و همکاران نشان داد که سویه‌های متعلق به سروگروه III و همچنین برخی سویه‌های سروگروه II که برای موش بالغ کشنده هستند، دارای پلاسمیدی با اندازه تقریبی ۷۰ کیلوباز هستند.

امروزه ارتباط میان وجود این پلاسمید و بروز یرسینیوز انسانی در  یرسینیا سودوتوبرکلوزیس به‌خوبی اثبات شده است.

علاوه بر پلاسمید، چندین ژن ویرولانس کروموزومی نیز در این گونه شناسایی شده‌اند.

ژن  inv در یرسینیا سودوتوبرکلوزیس همولوگ ژن inv در  Y. enterocolitica است و پروتئینی را کد می‌کند که ورود باکتری به سلول‌های پستانداران را امکان‌پذیر می‌سازد.

انتقال این ژن به E. coli K-12 موجب ایجاد فنوتیپ تهاجمی در این باکتری می‌شود.

بیان ژنinv  به دما وابسته است و محصول آن، پروتئینی با وزن مولکولی حدود ۱۰۳ کیلو دالتون به نام Invasin است. این پروتئین با اتصال به گیرنده‌های اختصاصی روی سلول‌های پستانداران، ورود Y. pseudotuberculosis به بافت‌های میزبان را تسهیل می‌کند.

برخلاف یرسینیا انتروکولیتیکا ، آزمون‌های اختصاصی ارزیابی ویرولانس برای یرسینیا سودوتوبرکلوزیس محدودتر هستند. با این وجود، شناسایی جدایه‌های دارای پلاسمید و توانایی تهاجم سلولی با استفاده از هیبریداسیون کلنی DNA یا  PCR امکان‌پذیر است.

آزمون‌های آزمایشگاهی و مدل‌های حیوانی برای ارزیابی ویرولانس

یکی از مناسب‌ترین آزمون‌های درون‌آزمایشگاهی (In vitro) برای ارزیابی بیماری‌زایی بالقوه سویه‌های Yersinia enterocolitica  و Yersinia pseudotuberculosis، بررسی شکل کلنی‌ها روی محیط‌های اختصاصی است.

سویه‌های ویرولانت در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد کلنی‌هایی کوچک، کاملاً محدب و دارای قابلیت جذب رنگ Congo  Red ایجاد می‌کنند؛ در حالی که همین ویژگی‌ها در دمای ۲۶ درجه سانتی‌گراد مشاهده نمی‌شود.

علاوه بر آزمون‌های آزمایشگاهی، مدل‌های حیوانی مختلفی نیز برای ارزیابی بیماری‌زایی گونه‌های یرسینیا در انسان توسعه یافته‌اند که مهم‌ترین آن‌ها عبارت‌اند از:

• ایجاد کراتوکنژنکتیویت در خوکچه هندی (آزمون Sereny)؛
• ایجاد انتروکولیت در خرگوش؛
• بررسی کشندگی در جربیل (Gerbil)؛
• بررسی کشندگی در موش‌های شیرخوار و موش‌های بالغ.

همچنین مشخص شده است که اگر موش‌های بالغ پیش از آلودگی داخل‌صفاقی (Intraperitoneal) با Iron dextran  و عامل شلاته‌کننده آهن  Desferrioxamine B تیمار شوند، حساسیت آن‌ها نسبت به عفونت ناشی از یرسینیا به‌طور قابل‌توجهی افزایش می‌یابد.

الف) تجهیزات آزمایشگاهی

برای جداسازی و شناسایی گونه‌های Yersinia تجهیزات زیر مورد نیاز است:

1. انکوباتور با قابلیت تنظیم دما در ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد و همچنین ۱۰±۱ درجه سانتی‌گراد.
2. هموژنایزر (مخلوط‌کن) با سرعت حدود ۸۰۰۰ دور در دقیقه (rpm) و ظرفیت ۵۰۰ میلی‌لیتر تا یک لیتر.
3. پلیت‌های استریل پتری‌دیش با ابعاد ۱۵ × ۱۰۰ میلی‌متر.
4. میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی حدود ۹۰۰ برابر به همراه منبع نور مناسب.
5. لوله‌های آزمایش یک‌بارمصرف بوروسیلیکاتی در ابعاد ۱۰ × ۷۵ میلی‌متر و ۱۳ × ۱۰۰ میلی‌متر.
6. رک مناسب برای لوله‌های ۱۳ × ۱۰۰ میلی‌متری.
7. دستگاه ورتکس (Vortex Mixer).

ب) محیط‌های کشت

برای جداسازی، شناسایی و تعیین ویژگی‌های بیوشیمیایی یرسینیا از محیط‌های کشت زیر استفاده می‌شود.

محیط‌های اصلی

• Peptone Sorbitol Bile Broth (PSBB)
• MacConkey Agar

در تهیه محیط مک‌کانکی باید از مخلوط نمک‌های صفراوی استفاده شود. محیط‌های BBL MacConkey Agar و Difco MacConkey CS Agar نیز قابل قبول هستند.

Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin (CIN) Agar محیط انتخابی اصلی برای جداسازی گونه‌های یرسینیا محسوب می‌شود.

محیط‌های مورد استفاده در آزمون‌های بیوشیمیایی

محیط  Bromcresol Purple Broth باید به‌صورت جداگانه با هر یک از کربوهیدرات‌های زیر و با غلظت ۰٫۵ درصد تهیه شود:

• Mannitol
• Sorbitol
• Cellobiose
• Adonitol
• Inositol
• Sucrose
• Rhamnose
• Raffinose
• Melibiose
• Salicin
• Xylose
• Trehalose

سایر محیط‌های مورد استفاده عبارت‌اند از:

• به‌صورت پلیت یا شیب آگار)
• Phenylalanine Deaminase Agar
• Motility Test Medium
• Tryptone Broth (1%)
• MR-VP Broth
• Simmons Citrate Agar
• Veal Infusion Broth
• Bile Esculin Agar
• Anaerobic Egg Yolk Agar
• API 20E یا Vitek GNI
• Tryptic Soy Agar with Yeast Extract (TSAYE)
• Lysine Arginine Iron Agar (LAIA)
• Falkow Decarboxylase Basal Medium حاوی ۰٫۵ درصد اورنیتین
• Congo Red–Brain Heart Infusion Agarose (CRBHO)
• Pyrazinamidase Agar
• PMP Broth
• محیط اختصاصی آزمون β-D-Glucosidase

ج) معرف‌های مورد نیاز

برای انجام آزمون‌های شناسایی، معرف‌های زیر مورد نیاز هستند:

• معرف‌های رنگ‌آمیزی گرم
• معرف آزمون Voges–Proskauer (VP)
• محلول فریک کلرید ۱۰ درصد
• معرف آزمون اکسیداز
• سرم فیزیولوژی استریل ۰٫۵ درصد
• معرف کواکس (Kovacs)
• محلول تازه تهیه‌شده ۰٫۵ درصد پتاسیم هیدروکسید (KOH) در ۰٫۵ درصد کلرید سدیم
• روغن معدنی استریل (نوع سنگین)
• سیستم API 20E یا Vitek GNI
• محلول ۱ درصد فروس آمونیوم سولفات

د) غنی‌سازی (Enrichment)

برای جداسازی یرسینیا از نمونه‌های مواد غذایی، آب و نمونه‌های محیطی، استفاده از روش زیر توصیه می‌شود.

مرحله ۱: آماده‌سازی نمونه

نمونه‌ها باید بلافاصله پس از دریافت مورد آزمایش قرار گیرند. در صورتی که انجام آزمایش بلافاصله امکان‌پذیر نباشد، نمونه را در ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید.

هرچند یرسینیا از مواد غذایی منجمد نیز قابل بازیابی است، اما انجماد نمونه پیش از انجام آزمون توصیه نمی‌شود.

در شرایط کاملاً آسپتیک:

• ۲۵ گرم نمونه را به ۲۲۵ میلی‌لیتر محیط PSBB اضافه کنید.
• نمونه را به مدت ۳۰ ثانیه همگن (Homogenize) کنید.
• سپس محیط را به مدت ۱۰ روز در ۱۰ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

مرحله ۲: کشت مستقیم در صورت احتمال آلودگی زیاد

اگر احتمال می‌دهید تعداد باکتری‌های یرسینیا در نمونه زیاد باشد، قبل از شروع دوره غنی‌سازی اقدامات زیر را انجام دهید:

• ۰٫۱ میلی‌لیتر از همگن‌شده را به روش Spread Plate روی محیط MacConkey Agar کشت دهید.
• ۰٫۱ میلی‌لیتر دیگر را روی محیط CIN Agar کشت دهید.

سپس:

• ۱ میلی‌لیتر از همگن‌شده را به ۹ میلی‌لیتر محلول ۰٫۵ درصد KOH در ۰٫۵ درصد سرم فیزیولوژی منتقل کنید.
• نمونه را فقط ۲ تا ۳ ثانیه مخلوط کنید.
• بلافاصله ۰٫۱ میلی‌لیتر از این مخلوط را روی محیط‌های MacConkey و CIN به روش Spread Plate کشت دهید.
• پلیت‌ها را به مدت ۱ تا ۲ روز در ۳۰ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

مرحله ۳: کشت پس از پایان غنی‌سازی

پس از ۱۰ روز انکوباسیون:

• محیط غنی‌سازی را به‌خوبی مخلوط کنید.
• یک لوپ کامل از محیط را به ۰٫۱ میلی‌لیتر محلول ۰٫۵ درصد KOH در ۰٫۵ درصد سرم فیزیولوژی منتقل کنید.
• مخلوط را ۲ تا ۳ ثانیه ورتکس کنید.
• سپس یک لوپ از آن را روی MacConkey Agar و یک لوپ دیگر را روی CIN Agar به روش کشت خطی (Streak Plate) تلقیح کنید.

در ادامه:

• ۰٫۱ میلی‌لیتر دیگر از محیط غنی‌سازی را به ۱ میلی‌لیتر سرم فیزیولوژی ۰٫۵ درصد منتقل کنید.
• به مدت ۵ تا ۱۰ ثانیه مخلوط نمایید.
• مجدداً روی محیط‌های MacConkey و CIN کشت خطی انجام دهید.
• در نهایت، پلیت‌ها را به مدت ۱ تا ۲ روز در ۳۰ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

هـ) جداسازی (Isolation) گونه‌های یرسینیا

پس از پایان دوره انکوباسیون، پلیت‌های کشت را از نظر وجود کلنی‌های مشکوک به یرسینیا بررسی کنید.

بررسی کلنی‌ها روی محیط CIN Agar

پلیت‌های CIN Agar را پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون بررسی کنید.

کلنی‌هایی را انتخاب کنید که دارای ویژگی‌های زیر باشند:

• قطر ۱ تا ۲ میلی‌متر
• مرکز قرمز تیره (Bull’s-eye)
• حاشیه کاملاً مشخص
• وجود یک هاله شفاف و بی‌رنگ در اطراف کلنی

این ظاهر کلنی، یکی از مشخصه‌های کلاسیک Yersinia enterocolitica روی محیط CIN است و به آن اصطلاحاً ظاهر «چشم گاوی» (Bull’s-eye appearance) گفته می‌شود.

بررسی کلنی‌ها روی محیط MacConkey Agar

پلیت‌های MacConkey Agar را پس از ۲۴ تا ۴۸ ساعت انکوباسیون بررسی کنید.

در این مرحله:

• کلنی‌های قرمز یا موکوئیدی را کنار بگذارید.
• فقط کلنی‌هایی را انتخاب کنید که ویژگی‌های زیر را داشته باشند:
• لاکتوز منفی (Lactose-negative)
• کوچک و مسطح
• بی‌رنگ یا صورتی بسیار کم‌رنگ
• قطر حدود ۱ تا ۲ میلی‌متر

این ویژگی‌ها احتمال تعلق کلنی به جنس یرسینیا را افزایش می‌دهند.

آزمون‌های غربالگری اولیه

هر کلنی مشکوک را با استفاده از سوزن تلقیح، روی محیط‌های زیر کشت دهید:

• Lysine Arginine Iron Agar (LAIA)
• Christensen’s Urea Agar
• Bile Esculin Agar

تمام محیط‌ها را به مدت ۴۸ ساعت در دمای اتاق (Room Temperature; RT) انکوبه کنید.

تفسیر نتایج آزمون‌های غربالگری

جدایه‌هایی که ویژگی‌های زیر را نشان دهند، به‌عنوان یرسینیا احتمالی در نظر گرفته می‌شوند:

در محیط LAIA

• سطح قلیایی (Alkaline Slant)
• عمق اسیدی (Acid Butt)
• بدون تولید گاز
• بدون تولید سولفید هیدروژن (H₂S)

این الگو به‌صورت زیر گزارش می‌شود:

K/A، بدون گاز، بدون H₂S

در محیط اوره

جدایه باید اوره‌آز مثبت (Urease Positive) باشد.

در محیط Bile Esculin

جدایه‌هایی که اسکولین را هیدرولیز نمی‌کنند (عدم ایجاد رنگ سیاه)، نسبت به سایر جدایه‌ها اولویت بیشتری برای ادامه بررسی دارند.

حذف جدایه‌های نامناسب

جدایه‌هایی که هر یک از ویژگی‌های زیر را داشته باشند، از ادامه بررسی حذف می‌شوند:

• تولید H₂S در محیط LAIA
• تولید گاز در LAIA
• واکنش Urease منفی
• الگوی بیوشیمیایی ناسازگار با یرسینیا

الگوی تیپیک کلنی‌های یرسینیا

روی محیط CIN

ویژگی‌های تیپیک عبارت‌اند از:

• قطر ۱ تا ۲ میلی‌متر
• مرکز قرمز تیره
• هاله شفاف اطراف کلنی

حاشیه کاملاً مشخص

واکنش در محیط LAIA

Yersinia enterocolitica

• K/A
• بدون گاز
• بدون H₂S

در مقابل،

Salmonella spp.

• K/K
• تولید گاز
• بدون H₂S یا با تولید H₂S (بسته به گونه)

بنابراین LAIA یکی از بهترین آزمون‌های افتراقی اولیه میان یرسینیا و سالمونلا محسوب می‌شود.

واکنش در Christensen’s Urea Agar

Yersinia enterocolitica

• اوره‌آز مثبت
• تغییر رنگ محیط به صورتی

Escherichia coli

• اوره‌آز منفی
• بدون تغییر رنگ

واکنش در Bile Esculin Agar

اکثر سویه‌های بیماری‌زای Yersinia enterocolitica (به‌جز بیوتیپ 1A)، اسکولین را هیدرولیز نمی‌کنند؛ بنابراین محیط سیاه نمی‌شود.

در مقابل،

Enterococcus faecalis

• اسکولین مثبت
• ایجاد رنگ سیاه در محیط

و) شناسایی (Identification)

پس از انتخاب جدایه‌های مشکوک، مرحله شناسایی نهایی آغاز می‌شود.

ابتدا از رشد موجود روی LAIA یک کشت خطی روی محیط Tryptic Soy Agar with Yeast Extract (TSAYE) تهیه کنید.

پلیت را در دمای اتاق انکوبه کنید.

هدف از این مرحله، دستیابی به یک کشت خالص برای انجام آزمون‌های تکمیلی است.

بررسی خلوص کشت

پس از رشد روی TSAYE، موارد زیر را بررسی کنید:

• خلوص کلنی‌ها
• رنگ‌آمیزی گرم
• آزمون اکسیداز

گونه‌های یرسینیا باید دارای ویژگی‌های زیر باشند:

• باسیل گرم منفی
• اکسیداز منفی

بررسی فعالیت لیپاز

از کلنی‌های رشدکرده روی  TSAYE، یک کشت روی محیط حاوی زرده تخم‌مرغ، مانند Anaerobic Egg Yolk (AEY) Agar، تهیه کنید.

این محیط باید:

• به‌صورت هوازی
• در دمای اتاق
• به مدت ۲ تا ۵ روز

انکوبه شود.

هدف از این مرحله، بررسی فعالیت آنزیم Lipase است.

آزمون‌های بیوشیمیایی تکمیلی

برای هر جدایه، آزمون‌های زیر را انجام دهید.

تمام محیط‌ها به مدت سه روز در دمای اتاق انکوبه می‌شوند، مگر در مواردی که زمان یا دمای دیگری ذکر شده باشد.

1. محیط دکربوکسیلاز فالکو (Falkow Decarboxylase Medium)

این محیط باید به‌صورت جداگانه با یکی از ترکیبات زیر تهیه شود:

• لیزین
• آرژنین
• اورنیتین

(هر کدام با غلظت ۰٫۵ درصد)

پس از تلقیح، سطح محیط را با روغن معدنی استریل بپوشانید تا شرایط بی‌هوازی لازم برای انجام واکنش فراهم شود.

۲. آزمون Phenylalanine Deaminase

جدایه را روی محیط Phenylalanine Deaminase Agar کشت دهید.

۳. آزمون تحرک (Motility)

تحرک را در دو دمای مختلف بررسی کنید:

• ۲۲ تا ۲۶ درجه سانتی‌گراد
• ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد

یکی از ویژگی‌های مهم Yersinia enterocolitica  این است که:

• در ۲۵ درجه سانتی‌گراد متحرک است.
• در ۳۷ درجه سانتی‌گراد غیرمتحرک می‌شود.

این ویژگی یکی از آزمون‌های افتراقی ارزشمند برای شناسایی گونه است.

۴. آزمون تریپتون و ایندول (Tryptone Broth & Indole Test)

جدایه را در Tryptone Broth تلقیح کنید.

پس از پایان انکوباسیون، آزمون ایندول (Indole Test) را مطابق دستورالعمل انتهای این فصل انجام دهید.

این آزمون توانایی باکتری در تولید آنزیم تریپتوفاناز (Tryptophanase) و تجزیه اسیدآمینه تریپتوفان را بررسی می‌کند.

۵. محیط MR-VP

آزمون خودآگلوتیناسیون یکی از ساده‌ترین روش‌های آزمایشگاهی برای بررسی وجود پلاسمید ویرولانس در گونه‌های یرسینیا  است.

برای انجام این آزمون، از محیط MR-VP Broth استفاده کنید.

محیط MR-VP Broth  علاوه بر آزمون وگس–پروسکائر (VP)، برای بررسی پدیده خودآگلوتیناسیون (Autoagglutination) نیز استفاده می‌شود.

برای این منظور:

• یک لوله را به مدت ۲۴ ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید تا آزمون خودآگلوتیناسیون انجام شود.
• سپس همین محیط را پس از ۴۸ ساعت برای انجام آزمون Voges–Proskauer (VP) بررسی کنید.
• یک لوله دیگر را نیز به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید تا خودآگلوتیناسیون وابسته به دما ارزیابی شود.

۶. آزمون تخمیر کربوهیدرات‌ها

برای تعیین ویژگی‌های بیوشیمیایی جدایه، از محیط Bromcresol Purple Broth استفاده کنید.

هر لوله باید به‌طور جداگانه با ۰٫۵ درصد یکی از کربوهیدرات‌های زیر مکمل شود:

• Mannitol
• Sorbitol
• Cellobiose
• Adonitol
• Inositol
• Sucrose
• Rhamnose
• Raffinose
• Melibiose
• Salicin
• Trehalose
• Xylose

نتایج این آزمون‌ها نقش مهمی در تعیین گونه و بیوتیپ یرسینیا دارند.

۷. آزمون مصرف سیترات

جدایه را روی Simmons Citrate Agar تلقیح کنید تا توانایی استفاده از سیترات به‌عنوان تنها منبع کربن بررسی شود.

۸. محیط Veal Infusion Broth

این محیط در مراحل بعدی، به‌ویژه برای نگهداری و انجماد سویه‌های مشکوک به بیماری‌زایی، مورد استفاده قرار می‌گیرد.

۹. استفاده از سیستم‌های شناسایی تجاری

برای شناسایی اولیه گونه‌های یرسینیا می‌توان از سیستم‌های تجاری زیر استفاده کرد:

• API 20E
• Vitek GNI

در استفاده از این سیستم‌ها، دستورالعمل شرکت سازنده باید به‌طور کامل رعایت شود.

اگرچه این سامانه‌ها معمولاً در تشخیص جنس یرسینیا عملکرد قابل قبولی دارند، اما در شناسایی گونه‌ها و تعیین بیوتیپ، دقت آن‌ها محدود است. بنابراین، برای تعیین گونه و بیوتیپ جدایه‌های مشکوک به بیماری‌زایی، همچنان انجام آزمون‌های بیوشیمیایی متداول ضروری است.

آزمون‌های کلیدی برای تعیین گونه

مهم‌ترین آزمون‌های افتراقی برای تعیین گونه در جنس Yersinia عبارت‌اند از:

• تخمیر ساکاروز (Sucrose)
• تخمیر رامنوز (Rhamnose)
• تخمیر رافینوز (Raffinose)
• تخمیر ملی‌بیوز (Melibiose)
• توانایی مصرف سیترات (Citrate Utilization)

نتایج این آزمون‌ها امکان افتراق گونه‌های مختلف یرسینیا را فراهم می‌کنند.

آزمون‌های کلیدی برای تعیین بیوتیپ

برای تعیین بیوتیپ (Biotype)، آزمون‌های زیر اهمیت ویژه‌ای دارند:

• تخمیر سالیسین (Salicin)
• تخمیر زایلوز (Xylose)
• تخمیر ترهالوز (Trehalose)
• آزمون وگس–پروسکائر (VP)
• آزمون لیپاز (Lipase)
• آزمون اسکولیناز (Esculinase)
• آزمون β-D-گلوکوزیداز
• آزمون پیرازین‌آمیداز (Pyrazinamidase)

ترکیب نتایج این آزمون‌ها امکان تعیین دقیق بیوتیپ جدایه را فراهم می‌کند.

آزمون پیرازین‌آمیداز

جدایه را روی Pyrazinamidase Agar Slant تلقیح کنید.

پس از ۴۸ ساعت انکوباسیون، آزمون را مطابق دستورالعمل انتهای فصل تفسیر کنید.

آزمون β-D-گلوکوزیداز

این آزمون در دمای ۳۰ درجه سانتی‌گراد و به مدت ۲۴ ساعت انجام می‌شود.

روش انجام و تفسیر نتایج در بخش پایانی این فصل ارائه شده است.

آزمون لیپاز (Lipase Test)

برای بررسی فعالیت آنزیم لیپاز، جدایه را روی محیط حاوی زرده تخم‌مرغ، مانند Anaerobic Egg Yolk Agar (AEY)، کشت دهید.

اگر جدایه دارای فعالیت لیپاز باشد، کلنی‌ها ویژگی‌های زیر را نشان خواهند داد:

• سطحی براق و چرب
• ظاهر مرواریدی و رنگین‌تاب
• وجود یک حلقه رسوبی در اطراف کلنی
• تشکیل یک هاله شفاف در خارجی‌ترین قسمت کلنی

این الگوی رشد، بیانگر فعالیت مثبت آنزیم لیپاز است.

تفسیر نتایج شناسایی

گونه‌های یرسینیا دارای ویژگی‌های عمومی زیر هستند:

• باسیل گرم منفی
• اکسیداز منفی

پس از تکمیل آزمون‌های بیوشیمیایی، برای تعیین گونه و بیوتیپ باید از جداول شناسایی استاندارد  استفاده شود.

شناسایی سویه‌های بیماری‌زا

بر اساس شواهد موجود، تنها سویه‌های Yersinia enterocolitica متعلق به بیوتیپ‌های زیر بیماری‌زا شناخته می‌شوند:

• 1B
• 2
• 3
• 4
• 5

ویژگی مشترک بیوتیپ‌های بیماری‌زا

بیوتیپ‌های 1B، 2، 3، 4 و 5، همچنین بیوتیپ 6 و گونه Yersinia kristensenii، دارای دو ویژگی مشترک هستند:

• طی ۲۴ ساعت نخست اسکولین را هیدرولیز نمی‌کنند.
• سالیسین را تخمیر نمی‌کنند.

افتراق از گونه‌های مشابه

از آنجا که Yersinia enterocolitica بیوتیپ 6 و Yersinia kristensenii نسبتاً نادر هستند، باید آن‌ها را از بیوتیپ‌های بیماری‌زا افتراق داد.

این افتراق بر اساس دو ویژگی انجام می‌شود:

• عدم توانایی در تخمیر ساکاروز
• مثبت بودن آزمون پیرازین‌آمیداز

نگهداری جدایه‌های مشکوک

تمام جدایه‌های Yersinia enterocolitica که در بیوتیپ‌های 1B، 2، 3، 4 یا 5 قرار می‌گیرند، باید برای انجام آزمون‌های تکمیلی بیماری‌زایی نگهداری شوند؛ زیرا این بیوتیپ‌ها از مهم‌ترین سویه‌های مرتبط با بیماری در انسان محسوب می‌شوند.

ح) آزمون‌های بیماری‌زایی (Virulence Tests)

پس از شناسایی بیوشیمیایی جدایه‌ها، لازم است سویه‌های مشکوک از نظر فاکتورهای ویرولانس نیز ارزیابی شوند. این مرحله به افتراق سویه‌های بیماری‌زا از سویه‌های غیر بیماری‌زا کمک می‌کند.

۱. آزمون خودآگلوتیناسیون (Autoagglutination Test)

تفسیر نتایج

لوله‌ای که به مدت ۲۴ ساعت در دمای اتاق انکوبه شده است، باید به دلیل رشد طبیعی باکتری، حالت کدر داشته باشد.

در مقابل، لوله‌ای که به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه شده است، در صورت وجود پلاسمید ویرولانس، الگوی متفاوتی نشان می‌دهد:

• تجمع یا کلوخه شدن سلول‌های باکتری در امتداد دیواره لوله یا در ته لوله
• شفاف باقی ماندن مایع رویی

وجود این الگو، نشانه احتمالی حضور پلاسمید ویرولانس در جدایه است.

هر نوع الگوی دیگر رشد در این دو دما، نتیجه منفی تلقی می‌شود.

الگوی تیپیک آزمون

در سویه‌های بیماری‌زای Yersinia enterocolitica:

• در ۲۵ درجه سانتی‌گراد رشد باکتری به‌صورت یکنواخت در تمام محیط پخش می‌شود.
• در ۳۵ درجه سانتی‌گراد سلول‌ها به یکدیگر چسبیده و در ته لوله رسوب می‌کنند، در حالی که محیط کشت در قسمت فوقانی شفاف باقی می‌ماند.

این تغییر وابسته به دما، یکی از مشخصه‌های وجود پلاسمید ویرولانس است.

۲. نگهداری و انجماد سویه‌ها

پلاسمیدهای مسئول بیماری‌زایی در Yersinia ممکن است هنگام کشت‌های مکرر یا نگهداری طولانی‌مدت، به‌ویژه در شرایط نامناسب، از بین بروند.

از دست رفتن پلاسمید معمولاً در شرایط زیر رخ می‌دهد:

• کشت در دماهای بالاتر از ۳۰ درجه سانتی‌گراد
• پاساژهای مکرر حتی در دماهای پایین‌تر از ۳۰ درجه سانتی‌گراد

بنابراین، به محض شناسایی یک جدایه مشکوک به بیماری‌زایی، باید آن را برای حفظ پلاسمید و ویژگی‌های ویرولانس منجمد کرد.

روش نگهداری

ابتدا جدایه را در Veal Infusion Broth تلقیح کنید.

کشت را به مدت ۴۸ ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید.

سپس گلیسرول استریل را تا غلظت نهایی ۱۰ درصد به محیط اضافه کنید.

به عنوان مثال:

۰٫۳ میلی‌لیتر گلیسرول به ۳ میلی‌لیتر Veal Infusion Broth

پس از مخلوط کردن، نمونه را بلافاصله منجمد کنید.

نگهداری در دمای ۷۰- درجه سانتی‌گراد توصیه می‌شود.

۳. آزمون ویرولانس روی محیط Congo Red Agarose

یکی از آزمون‌های مهم برای ارزیابی وجود پلاسمید ویرولانس، بررسی پاسخ به غلظت پایین کلسیم (Low Calcium Response) روی محیط Congo Red–Brain Heart Infusion Agarose (CRBHO) است.

روش انجام آزمون

جدایه مورد بررسی را در Brain Heart Infusion Broth (BHI Broth) تلقیح کنید.

کشت را یک شب در ۲۵ تا ۲۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

سپس در سرم فیزیولوژی، رقت‌های ده‌دهی تهیه کنید تا غلظت نهایی تقریباً ۱۰۰۰ سلول در هر میلی‌لیتر به دست آید.

از رقت مناسب:

• ۰٫۱ میلی‌لیتر روی یک پلیت CRBHO کشت کنید.
• ۰٫۱ میلی‌لیتر دیگر روی پلیت دوم کشت دهید.

یکی از پلیت‌ها را در ۲۵ درجه سانتی‌گراد و دیگری را در ۳۵ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

نتایج را پس از ۲۴ و ۴۸ ساعت بررسی کنید.

تفسیر نتایج

1.سویه‌های دارای پلاسمید ویرولانس

کلنی‌ها دارای ویژگی‌های زیر هستند:

• بسیار کوچک
• گرد
• کاملاً محدب
• قرمز
• کدر

2. سویه‌های فاقد پلاسمید

کلنی‌ها معمولاً دارای ویژگی‌های زیر هستند:

• بزرگ
• نامنظم
• مسطح
• نیمه‌شفاف

این تفاوت ظاهری یکی از شاخص‌ترین معیارهای تشخیص وجود پلاسمید ویرولانس است

۴. آزمون عفونت داخل‌صفاقی در موش بالغ

اگر هر یک از آزمون‌های درون‌آزمایشگاهی (In vitro) ذکرشده در بخش‌های قبل نتیجه مثبت داشته باشند، شواهد محکمی مبنی بر بیماری‌زا بودن سویه به دست می‌آید.

برای تأیید نهایی، می‌توان از آزمون زیستی (Bioassay) استفاده کرد.

در این روش:

• موش بالغ ابتدا با Iron Dextran و Desferrioxamine B تیمار می‌شود.
• سپس باکتری از طریق تزریق داخل‌صفاقی (Intraperitoneal) به حیوان تزریق می‌شود.

این روش در منابع تخصصی به‌طور کامل شرح داده شده است.

از آنجا که انجام این آزمون نیازمند امکانات حیوان‌خانه و مجوزهای اخلاقی است و تنها در تعداد محدودی از آزمایشگاه‌ها انجام می‌شود، جزئیات عملی آن در این دستورالعمل ارائه نشده است.

۵. آزمون تهاجم به سلول‌های HeLa

یکی دیگر از روش‌های بررسی بیماری‌زایی، ارزیابی توانایی باکتری در تهاجم به سلول‌های اپیتلیال HeLa است.

این آزمون به‌صورت درون‌آزمایشگاهی (In vitro) انجام می‌شود و برای غربالگری جدایه‌های Yersinia کاربرد دارد.

روش انجام

در این روش، تک‌لایه سلول‌های HeLa با جدایه مورد نظر آلوده می‌شود.

پس از پایان دوره انکوباسیون، سلول‌ها با رنگ Acridine Orange رنگ‌آمیزی می‌شوند.

در ادامه، نمونه‌ها با میکروسکوپ فلورسنس بررسی می‌شوند تا وجود باکتری‌های داخل سلولی مشخص شود.

این آزمون برای هر دو گونه زیر قابل استفاده است:

• Yersinia enterocolitica
• Yersinia pseudotuberculosis

وجود باکتری در داخل سلول‌های HeLa نشان‌دهنده توانایی تهاجم سلولی و یکی از شاخص‌های مهم ویرولانس است.

ط) تفسیر نتایج آزمون‌های بیماری‌زایی

اگر هر یک از آزمون‌های ویرولانس معرفی‌شده در بخش قبل (موارد ۱ تا ۴) نتیجه مثبت داشته باشد، می‌توان آن را شاهدی بر بیماری‌زایی بالقوه سویه‌های جداشده از Yersinia enterocolitica یا Yersinia pseudotuberculosis در نظر گرفت.

البته باید توجه داشت که تفسیر نهایی همواره باید بر اساس مجموعه نتایج حاصل از آزمون‌های کشت، ویژگی‌های بیوشیمیایی، آزمون‌های ویرولانس و در صورت لزوم روش‌های مولکولی انجام شود و نباید تنها به یک آزمون منفرد اتکا کرد.

ی) شناسایی و بررسی Yersinia pseudotuberculosis

به‌طور کلی، سویه‌های Yersinia pseudotuberculosis از نظر ویژگی‌های بیوشیمیایی یکنواخت‌تر از Y. enterocolitica هستند. مهم‌ترین تفاوت‌های بیوشیمیایی میان سویه‌های این گونه، به توانایی آن‌ها در تخمیر سه قند زیر مربوط می‌شود:

• Melibiose
• Raffinose
• Salicin

مانند Y. enterocolitica، آنتی‌ژن‌های سوماتیک مقاوم به حرارت (O Antigen) نیز برای سروتیپ‌بندی این گونه استفاده می‌شوند.

در حال حاضر، Y. pseudotuberculosis به شش سروگروه تقسیم می‌شود که با اعداد رومی I تا VI مشخص می‌شوند.

سروگروه‌های I، II، III و IV دارای زیرگروه (Subtype) هستند، اما باید توجه داشت که آنتی‌سرم هر سروگروه می‌تواند با زیرگروه‌های همان سروگروه نیز واکنش متقاطع (Cross-reaction) نشان دهد.

مطالعات نشان داده‌اند که سویه‌های متعلق به سروگروه‌های II و III در صورت تجویز خوراکی به موش‌های بالغ، بیماری‌زا و کشنده هستند؛ هرچند برخلاف برخی سویه‌های Y. enterocolitica، این باکتری‌ها آنزیم لیپاز تولید نمی‌کنند.

از سوی دیگر، سویه‌هایی که قادر به تهاجم به سلول‌های HeLa هستند، معمولاً Esculin مثبت هستند؛ ویژگی‌ای که آن‌ها را از Y. enterocolitica متمایز می‌کند.

همچنین این گونه دارای پلاسمیدی با اندازه تقریبی ۴۱ تا ۴۸ مگادالتون (Mdal) است و در ۳۷ درجه سانتی‌گراد پدیده خودآگلوتیناسیون را نشان می‌دهد. وجود این پلاسمید ارتباط مستقیمی با بروز یرسینیوز انسانی دارد.

۱. غنی‌سازی (Enrichment)

برای جداسازی Yersinia pseudotuberculosis، روش زیر توصیه می‌شود.

در شرایط کاملاً آسپتیک:

• ۲۵ گرم از نمونه را به ۲۲۵ میلی‌لیتر محیط PMP Broth اضافه کنید.
• نمونه را به مدت ۳۰ ثانیه همگن کنید.
• سپس محیط را به مدت سه هفته در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

در پایان هفته‌های اول، دوم و سوم مراحل زیر را انجام دهید:

• محیط غنی‌سازی را کاملاً مخلوط کنید.
• ۰٫۱ میلی‌لیتر از آن را به ۱ میلی‌لیتر محلول ۰٫۵ درصد KOH در ۰٫۵ درصد NaCl منتقل کنید.
• نمونه را به مدت ۵ تا ۱۰ ثانیه مخلوط کنید.

سپس:

• یک لوپ از سوسپانسیون را روی MacConkey Agar کشت خطی دهید.
• یک لوپ دیگر را روی CIN Agar کشت دهید.

علاوه بر این، یک لوپ نیز مستقیماً از محیط غنی‌سازی روی هر یک از دو محیط MacConkey Agar و CIN Agar کشت دهید.

تمام پلیت‌ها را در دمای اتاق انکوبه کنید.

۲. جداسازی و شناسایی

ادامه مراحل جداسازی و شناسایی مشابه روش توضیح داده‌شده برای Yersinia enterocolitica است و باید مطابق بخش‌های «جداسازی» تا «آزمون‌های بیماری‌زایی» انجام شود.

با این حال، هنگام تفسیر نتایج باید به تفاوت‌های بیوشیمیایی این گونه توجه ویژه داشت.

مهم‌ترین ویژگی افتراقی Yersinia pseudotuberculosis عبارت است از:

• اورنیتین منفی
• سوربیتول منفی
• ساکاروز منفی

این سه آزمون در کنار سایر ویژگی‌های بیوشیمیایی، نقش مهمی در افتراق این گونه از سایر اعضای جنس Yersinia دارند.

3. آزمون‌های تکمیلی

آزمون فنیل‌آلانین دآمیناز (Phenylalanine Deaminase Test)

پس از رشد باکتری روی محیط Phenylalanine Deaminase Agar، دو تا سه قطره محلول فریک کلرید ۱۰ درصد روی سطح محیط اضافه کنید.

تفسیر

ایجاد رنگ سبز نشان‌دهنده نتیجه مثبت است.

آزمون ایندول (Indole Test)

پس از پایان انکوباسیون محیط Tryptone Broth، مقدار ۰٫۲ تا ۰٫۳ میلی‌لیتر معرف کواکس (Kovacs Reagent) به محیط اضافه کنید.

تفسیر

تشکیل حلقه قرمز تیره در سطح محیط، بیانگر واکنش مثبت است.

آزمون وگس–پروسکائر (Voges–Proskauer)

به محیط کشت:

• ۰٫۶ میلی‌لیتر آلفا-نفتول اضافه کنید و به‌خوبی مخلوط نمایید.
• سپس ۰٫۲ میلی‌لیتر محلول ۴۰ درصد KOH حاوی کراتین را اضافه کرده و مجدداً مخلوط کنید.

نتیجه آزمون را پس از چهار ساعت بررسی کنید.

تفسیر

تشکیل رنگ صورتی تا قرمز یاقوتی نشان‌دهنده نتیجه مثبت است.

آزمون پیرازین‌آمیداز (Pyrazinamidase Test)

پس از رشد باکتری روی محیط Pyrazinamidase Agar، مقدار یک میلی‌لیتر محلول تازه تهیه‌شده فروس آمونیوم سولفات یک درصد روی سطح آگار بریزید.

تفسیر

اگر طی ۱۵ دقیقه رنگ صورتی ایجاد شود، آزمون مثبت است.

این واکنش نشان‌دهنده تولید اسید پیرازینوئیک در اثر فعالیت آنزیم پیرازین‌آمیداز است.

آزمون β-D-گلوکوزیداز

برای تهیه محلول آزمون:

• ۰٫۱ گرم 4-Nitrophenyl-β-D-Glucopyranoside را در ۱۰۰ میلی‌لیتر محلول ۰٫۶۶۶ مولار سدیم دی‌هیدروژن فسفات (NaH₂PO₄) با pH برابر ۶ حل کنید.

پس از حل شدن کامل:

• محلول را با فیلتراسیون استریل کنید.

سپس:

• کشت باکتری را در سرم فیزیولوژی استریل سوسپانسیون کنید.
• کدورت سوسپانسیون را به استاندارد مک‌فارلند شماره ۳ برسانید.
• ۰٫۷۵ میلی‌لیتر از سوسپانسیون را با ۰٫۲۵ میلی‌لیتر از محلول آزمون مخلوط کنید.
• مخلوط را به مدت یک شب در ۳۰ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

تفسیر

ایجاد رنگ زرد واضح نشان‌دهنده فعالیت آنزیم β-D-گلوکوزیداز و نتیجه مثبت آزمون است.

جمع‌بندی

تشخیص دقیق گونه‌های بیماری‌زای Yersinia تنها بر پایه مشاهده رشد باکتری در محیط کشت امکان‌پذیر نیست. شناسایی صحیح این باکتری‌ها مستلزم تلفیق نتایج حاصل از ویژگی‌های کلنی، آزمون‌های بیوشیمیایی، بررسی بیوتیپ، ارزیابی فاکتورهای ویرولانس و در صورت نیاز آزمون‌های مولکولی است.

در میان گونه‌های این جنس، Yersinia enterocolitica مهم‌ترین عامل یرسینیوز منتقله از غذا در انسان محسوب می‌شود. ازاین‌رو، شناسایی سویه‌های بیماری‌زا و افتراق آن‌ها از سویه‌های غیر بیماری‌زا اهمیت ویژه‌ای در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی، میکروب‌شناسی مواد غذایی و مراکز کنترل کیفی دارد.

اجرای دقیق مراحل غنی‌سازی، جداسازی، شناسایی و ارزیابی ویرولانس که در این راهنما ارائه شد، می‌تواند دقت تشخیص را افزایش داده و به شناسایی مطمئن سویه‌های بیماری‌زا کمک کند. همچنین استفاده از آزمون‌های مولکولی برای بررسی ژن‌های ویرولانس و پلاسمیدهای مرتبط، در کنار روش‌های کلاسیک کشت، امکان ارزیابی دقیق‌تر خطر سویه‌های جداشده را فراهم می‌کند و نقش مهمی در پایش، کنترل و پیشگیری از بیماری‌های ناشی از Yersinia خواهد داشت.