آشنایی کامل با رنگ‌آمیزی تریپان بلو و ارزیابی زنده‌مانی سلول‌ها

تاریخچه رنگ‌آمیزی تریپان

رنگ‌آمیزی با تریپان بلو یک تکنیک بنیادی در زیست‌شناسی سلولی است. این روش از طرد رنگ (dye exclusion) برای ارزیابی سریع و تمایز سلول‌های زنده از سلول‌های غیرزنده یا آسیب‌دیده استفاده می‌کند. این کار معمولاً درون یک سوسپانسیون کشت سلولی انجام می‌شود.

این روش اغلب در نگهداری روتین کشت سلول، شمارش سلولی با استفاده از هموسایتومتر و مطالعات سمیت سلولی کاربرد دارد.

نخستین استفاده از رنگ تریپان بلو توسط دانشمندی به نام پاول ارلیش (Paul Ehrlich) انجام شد. به عبارت دقیق‌تر، این تکنیک یکی از کارهای پیشگامانه او بود. این رنگ در سال ۱۹۰۴ سنتز شد. هدف اصلی از ساخت آن، استفاده به عنوان یک عامل شیمی‌درمانی بالقوه (potential chemotherapeutic agent) برای درمان بیماری‌های انگلی (parasitic diseases) بود. اگرچه تریپان بلو به عنوان یک داروی درمانی به موفقیت گسترده‌ای دست نیافت، اما نقش اصلی آن در زیست‌شناسی سلولی امروزی، از درک تمایل انتخابی آن به سلول‌های آسیب‌دیده نشئت می‌گیرد.

تا اوایل قرن بیستم، دانشمندان این مشاهده را به صورت «آزمون طرد رنگ» فرموله کردند. این آزمون بر پایه توانایی رنگ در نفوذ به سلول‌هایی است که غشای آسیب‌دیده دارند. این کشف، پایه‌ای برای کاربرد مدرن و روتین آن در سنجش‌های زنده‌مانی سلولی (cell viability assays) شد. اولین توصیف رسمی و ثبت‌شده از به‌کارگیری تریپان بلو به‌طور اختصاصی برای تحلیل زنده‌مانی سلول، معمولاً به اِی. ام. پاپن‌هایمر (A. M. Pappenheimer) در اواسط قرن بیستم نسبت داده می‌شود.

مبانی و ویژگی‌های تریپان بلو

کارایی رنگ‌آمیزی با تریپان بلو به‌طور کامل بر یکپارچگی غشای سلول (cell membrane integrity) متکی است. این سازوکار با نام «اصل طرد رنگ»  شناخته می‌شود.

تریپان بلو در دسته رنگ‌های آزوی اسیدی (acid azo dye) قرار می‌گیرد. به‌طور مشخص، این ماده یک رنگ دی‌آزو (diazo dye) است، یعنی دارای دو گروه آزو (-N=N-) است و از تولوئیدین (toluidine) مشتق می‌شود. این مولکول نسبتاً بزرگ است و وزن مولکولی آن در حدود ۹۶۰٫۸ گرم بر مول (g/mol) است.

ویژگی‌های کلیدی که کاربرد تریپان بلو را در آزمون طرد رنگ توضیح می‌دهند، شامل اندازه بزرگ و قطبیت/بار زیاد آن هستند.

این مولکول دارای چهار گروه سولفونات (sulfonate SO groups) به‌صورت نمک تتراسدیم (tetrasodium salt). است. این گروه‌ها باعث می‌شوند مولکول بسیار آب‌دوست (hydrophilic) یا محلول در آب (water-soluble) باشد. همچنین در pH فیزیولوژیک (physiological pH)، بار منفی شدیدی به آن می‌دهند.

مکانیسم عملکرد و رنگ‌های جایگزین در سنجش زنده‌مانی

این ترکیبِ اندازه بزرگ و بار منفی زیاد، مانع از آن می‌شود که رنگ بتواند به‌صورت انتشار غیرفعال (passivediffusion) از غشای پلاسمایی یک سلول سالم عبور کند. این غشا یک دولایه لیپیدی (lipid bilayer) آب‌گریز (hydrophobic) با پتانسیل الکتریکی (electrical potential) است. سد انتخابیِ غشای سالم، به‌طور فعال از ورود رنگ جلوگیری می‌کند.

وقتی یک سلول می‌میرد یا زنده‌مانی (viability) آن مختل می‌شود، غشای سلولی آن یکپارچگی ساختاری و عملکردی خود را از دست می‌دهد و متخلخل (porous) یا نشت‌پذیر (leaky) می‌شود. این آسیب باعث می‌شود مولکول بزرگ و باردار تریپان بلو از غشا عبور کند و وارد سیتوپلاسم (cytoplasm) شود. پس از ورود، رنگ به‌صورت غیرکووالانسی (non-covalently) به پروتئین‌های داخل سلولی (intracellular proteins) متصل می‌شود. در نتیجه، رنگ آبی مشخصی در سلول‌های غیرزنده (non-viable cells) دیده می‌شود.

چندین رنگ وجود دارند که به‌راحتی وارد سلول‌های مرده می‌شوند، اما از سلول‌های زنده کنار گذاشته می‌شوند. تریپان بلو (Trypan blue) با غلظت ۲۰۰ تا ۴۰۰ میکروگرم بر میلی‌لیتر (μg/ml)، در pH برابر با ۷٫۲ تا ۷٫۵ توسط سلول‌های مرده جذب می‌شود.

رنگ‌های دیگری مانند TTC یعنی ۲، ۳، ۵-تری‌فنیل تترازولیوم کلرید (2, 3, 5 triphenyl tetrazolium chloride) و MTT یعنی متیل تیازول تترازولیوم (Methyl thiazole tetrazolium) نیز می‌توانند برای بررسی زنده‌مانی (viability) استفاده شوند.

پروتکل رنگ‌آمیزی با تریپان بلو

محفظه هموسایتومتر (haemocytometer chamber) را تمیز کنید. آن را با الکل خشک کنید و با یک پارچه موسلین (muslin cloth) تمیز پاک کنید. لامل‌ها را در محفظه نصب (mounting chamber) قرار دهید.

به ۰٫۹ میلی‌لیتر از سوسپانسیون سلولی (cell suspension)، ۰٫۱ میلی‌لیتر تریپان بلو ۴٪ (4% trypan blue) اضافه کنید. آن را مخلوط کنید و اجازه دهید به مدت ۵ دقیقه بماند.

در حالی که لامل در جای خود قرار دارد، مقدار کمی از سوسپانسیون سلولیِ حاوی تریپان بلو را به هر دو محفظه هموسایتومتر منتقل کنید. این کار را با تماس دادن دقیق نوک سمپلر (pipette tip) به لبه لامل انجام دهید و اجازه دهید هر محفظه به‌وسیله خاصیت موئینگی (capillary action) پر شود. اجازه ندهید محفظه بیش از حد پر شود.

هموسایتومتر را ابتدا با بزرگنمایی کم (10X) و سپس با بزرگنمایی زیاد (40X) زیر میکروسکوپ (microscope) فوکوس کنید.

تمام سلول‌ها را در ۴ محفظه WBC بشمارید. سلول‌هایی را که روی خطوط بالا و سمت چپ قرار دارند، حساب نکنید. اما سلول‌هایی را که روی خطوط پایین و سمت راست قرار دارند، در شمارش وارد کنید.

تعداد سلول در هر میلی‌لیتر (cell count/ml) را تعیین کنید. شمارش را به ۱ × ۱۰^۶ در هر میلی‌لیتر (1 × 10^6 / ml) تنظیم کنید.

تعداد سلول‌های زنده، یعنی بدون رنگ (unstained)، و سلول‌های مرده، یعنی رنگ‌گرفته (stained)، را بشمارید و درصد زنده‌مانی سلول‌ها (percent viability of cells) را محاسبه کنید.

فرمول کلی زنده‌مانی سلولی (Cell viability) به صورت زیر است:

درصد زنده‌مانی سلول = (تعداد سلول‌های زنده / تعداد کل سلول‌ها) × 100

که در آن:

تعداد سلول‌های زنده (Number of Viable Cells)، برابر است با تعداد سلول‌های بدون رنگ، یعنی زنده (unstained/live).

تعداد کل سلول‌ها (Total Number of Cells)، برابر است با مجموع سلول‌های بدون رنگ، یعنی زنده (live)، و سلول‌های رنگ‌گرفته، یعنی مرده (dead).

کاربرد تریپان بلو در کشت سلول و ارزیابی زنده‌مانی

رایج‌ترین کاربرد تریپان بلو (Trypan Blue) در نگهداری روتین و پایش سلامت کشت‌های سلولی (cell cultures) است.

پیش از شروع یک آزمایش، باید تعداد مشخصی از سلول‌های زنده کشت شوند. تریپان بلو به پژوهشگران امکان می‌دهد غلظت دقیق سلول‌های زنده را در کشت ذخیره (stock culture)، بر حسب سلول در میلی‌لیتر (cells/mL)، شمارش کنند و حجم موردنیاز را برای رسیدن به یک چگالی کشت مشخص (specific seeding density) محاسبه کنند.

سلول‌ها اغلب در طی فرایند انجماد و ذوب شدن (freezing and thawing process) دچار آسیب می‌شوند. تریپان بلو بلافاصله پس از ذوب کردن (thawing) استفاده می‌شود تا زنده‌مانی (viability) سلول‌ها تعیین شود. این کار به پژوهشگران کمک می‌کند تصمیم بگیرند که آیا جمعیت سلولی بازیابی‌شده به اندازه کافی سالم هست که استفاده شود، یا به بازیابی بیشتری نیاز دارد.

با بررسی دامنه‌ای از غلظت‌های مختلف یک ماده آزمایشی (test substance)، تریپان بلو به تعیین رابطه میان دوز (dose) و میزان مرگ سلولی (degree of cell death) کمک می‌کند.

رنگ‌آمیزی با تریپان بلو برای سنجش درصد سلول‌های غیرزنده (non-viable) یا کشته‌شده، پس از مواجهه با یک دارو (drug)، ترکیب (compound) یا سم محیطی (environmental toxin) به‌کار می‌رود. داده‌های حاصل از زنده‌مانی (viability data) برای محاسبه شاخص‌هایی مانند IC50 یعنی غلظت مهاری نیمه‌بیشینه (half-maximal inhibitory concentration) بسیار مهم هستند. این شاخص، اثربخشی یک ماده را در مهار یک عملکرد زیستی یا بیوشیمیایی (biological or biochemical function) اندازه‌گیری می‌کند.

کاربردهای تحلیلی و پژوهشی تریپان بلو

در آزمون‌هایی مانند وسترن بلات (Western blotting)، الایزا (ELISA) یا فلوسایتومتری (flow cytometry)، پژوهشگران اغلب نیاز دارند داده ورودی را بر اساس غلظت سلول‌های زنده نرمال‌سازی (normalize) کنند، نه صرفاً بر اساس جرم کل سلولی (total cell mass). تریپان بلو تعداد قابل‌اعتماد سلول‌های زنده را که برای این نرمال‌سازی لازم است، فراهم می‌کند.

در جداسازی سلول‌های اولیه (primary cells)، برای مثال از نمونه‌های بافتی (tissue samples) یا خون (blood)، سوسپانسیون سلولی اغلب حاوی مقدار قابل‌توجهی بقایا (debris) و سلول‌های مرده است. از تریپان بلو برای بررسی زنده‌مانی بخش جداشده (isolated fraction) پیش از ادامه کشت یا تحلیل‌های بیشتر استفاده می‌شود.

تریپان بلو برای رنگ‌آمیزی هیف‌های قارچی (fungal hyphae) و دیگر ساختارهای میکروبی درون بافت‌های گیاهی به‌کار می‌رود. این کار دیدن آن‌ها را زیر میکروسکوپ بهتر می‌کند و مطالعه برهم‌کنش‌های میزبان-بیمارگر (host-pathogen interactions) را آسان‌تر می‌سازد.

مزایای رنگ‌آمیزی با تریپان بلو

این آزمون بسیار سریع و ساده انجام می‌شود. به حداقل آماده‌سازی و تجهیزات پایه آزمایشگاهی نیاز دارد: یک میکروسکوپ نوری (light microscope) و یک هموسایتومتر (hemacytometer). به همین دلیل، این روش برای بررسی‌های روتین و پرتعداد در کار روزانه کشت سلول، که در آن صرفه‌جویی در زمان بسیار مهم است، یک روش ایده‌آل به شمار می‌آید.

در مقایسه با روش‌های جایگزین مدرن، این آزمون از نظر هزینه بسیار مقرون‌به‌صرفه است. رنگ‌های فلورسنت (fluorescent dyes) مانند پروپیدیوم یدید (Propidium Iodide) یا کلسئین AM (Calcein AM) و همچنین شمارشگرهای خودکار سلولی (automated cell counters)، به معرف‌های گران‌قیمت و تجهیزات تخصصی با هزینه سرمایه‌گذاری بالا نیاز دارند.

این آزمون یک شمارش مستقیم و کمی (direct, quantitative count) از هر دو نوع سلول زنده، یعنی بدون رنگ (unstained)، و سلول غیرزنده، یعنی رنگ‌گرفته (stained)، ارائه می‌دهد. در نتیجه، درصد زنده‌مانی مطلق (absolute viability percentage) به دست می‌آید.

معایب رنگ‌آمیزی با تریپان بلو

این روش نمی‌تواند سلامت متابولیکی سلول (metabolic health) را ارزیابی کند؛ یعنی توانایی سلول برای انجام عملکردهای پایه یا تکثیر شدن (proliferate) را نشان نمی‌دهد. سلولی که به‌آرامی در حال مرگ است یا از نظر متابولیکی دچار اختلال شده، ممکن است هنوز رنگ را دفع کند و به اشتباه «زنده» در نظر گرفته شود.

این آزمون به‌طور کلی نکروز (necrosis) را تشخیص می‌دهد؛ یعنی مرگ تصادفی سلول که با پارگی غشا (membrane rupture) همراه است. اما در شناسایی مراحل اولیه آپوپتوز (apoptosis)، یعنی مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول (programmed cell death)، ضعیف عمل می‌کند، زیرا در این فرایند معمولاً یکپارچگی غشا تا مراحل بسیار پایانی حفظ می‌شود.

اگر سلول‌ها به‌صورت توده‌ای یا کلوخه‌شده (clumped together) باشند، تشخیص سلول‌های زنده و مرده از یکدیگر تقریباً غیرممکن می‌شود و این مسئله به شمارش‌های غیردقیق (imprecise counts) منجر خواهد شد.

سخن پایانی

رنگ‌آمیزی با تریپان بلو یک روش کلاسیک، سریع و قابل‌اعتماد برای تشخیص سلول‌های زنده و مرده است که بر اساس یکپارچگی غشای سلولی عمل می‌کند. این تکنیک به‌ویژه در کشت سلول، شمارش سلولی، سنجش سمیت سلولی و بررسی کیفیت نمونه‌های سلولی اهمیت زیادی دارد. مزیت اصلی آن، سادگی اجرا، هزینه کم و امکان به‌دست‌آوردن شمارش مستقیم سلول‌های زنده و مرده است. با این حال، این روش نمی‌تواند وضعیت متابولیکی سلول یا مراحل ابتدایی مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول را به‌خوبی نشان دهد. بنابراین، تریپان بلو بیشتر به‌عنوان یک روش پایه و اولیه برای ارزیابی زنده‌مانی سلول‌ها استفاده می‌شود و در صورت نیاز، می‌توان آن را با روش‌های دقیق‌تر تکمیل کرد.