اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی (بخش هفتم)

ترجمه و تنظیم: دکتر محمد قهری

9/2- روش‌های میکروسکپی

9/2/1- نمونه‌های قابل قبول برای آزمایش مستقیم میکروسکوپی

بافت و آسپیره‌های بدست آمده از نواحی که در حالت نرمال باید استریل باشند عالی‌ترین نمونه‌ها هستند. موها، تراشه‌های پوست و خرده‌های ناخن که عفونی شده‌اند نمونه‌های مفیدی برای آزمایش مستقیم میکروسکپی به منظور جداسازی درماتوفیت‌ها و سایر قارچ‌هایی که عامل عفونت در این نواحی هستند می‌باشند. همچنین لازم است میکروبیوتای قارچی و باکتریایی که با ارگان‌های معینی مرتبط هستند را در نظر داشت، زیرا این عوامل به‌صورت نامطلوبی جداسازی و بدست آوردن پاتوژن‌ها از این نواحی را تحت تاثیر قرار می‌دهند و ممکن است بر پیچیدگی تفسیر آزمایش مستقیم و کشت بیفزایند. به‌عنوان مثال نمونه‌های خلط و BAL ممکن است حاوی میکروبیوتای نرمال از ناحیه‌ی اوروفارنکس باشد که ممکن است روی پاتوژن‌های کند رشد را بپوشاند و تفسیر آزمایش مستقیم و کشت را با مشکل مواجه سازند. نمونه‌ی وسط ادرار و نمونه ادراری که از کاتتر مستقیم (سوند سوپراپوبیک) و بدنبال رعایت استانداردها بدست می‌آید قابل قبول هستند اگرچه ادرار بدست آمده از کاتترهای کار گذاشته شده در مجاری ادراری غیر قابل قبول می‌باشند. آزمایش مستقیم CSF ممکن است برای آزمایشگاه‌هایی که روی گروه‌های جمعیتی خاصی از بیماران (به‌عنوان مثال گروه‌هایی که در آن‌ها شیوع بالای HIV وجود دارد) کار می‌کنند مفید باشد. به استثنای آزمایشات مربوط به واژن، آزمایش مستقیم برای سایر نمونه‌ها نباید با سواب انجام گیرد (ضمیمه A را مشاهده فرمایید).

9/2/2- تهیه‌ی اسلاید

اسلایدها باید تمیز بوده و اثرات باند و تنزیب روی آن نباشد. آماده‌سازی اختصاصی اضافی لزوم ندارد.

9/2/3- روش‌های رنگ آمیزی

9/2/3/1- هیدروکسید پتاسیم/ کلرآزول بلک Chlorazol Black

قارچ‌هایی که در نمونه‌های کلینیکال حضور دارند اغلب به‌وسیله‌ی آزمایش مسقیم با استفاده از میکروسکوپ نوری معمولی قابل مشاهده هستند. متاسفانه سلول‌ها، دبری‌های سلولار و پروتئینی و سایر موادی که حضور دارند (مانند موکوس) ممکن است عناصر قارچی را در خود پنهان کنند و روی آن‌ها را بپوشانند. این مسئله ممکن است موجب نقص در نشان دادن قارچ موجود در نمونه گردد (مثلا سلول‌های قارچ کاملا پوشانده شود) و حساسیت تست کاهش یابد. از طرف دیگر عناصر قارچی ممکن است مشاهده شوند اما به‌ علت مبهم ماندن (یا کدر ماندن) توسط مواد به‌دقت تشخیص داده نشوند. این مسئله روی اختصاصیت روش آزمایش مستقیم اثر می‌گذارد، بنابراین استفاده از رنگ‌های فلئورسانت توصیه می‌شود.

معمولا از غلظت 10 درصد محلول هیدروکسید پتاسیم استفاده می‌شود. نمونه و هیدروکسید پتاسیم باید توسط لامل پوشانده شود و بعد از 15 الی 30 دقیقه (بسته به غلظت اولیه‌ی نمونه) آزمایش شود. گرم کردن آهسته‌ی نمونه تا دمای 35 الی 37 درجه می‌تواند مفید باشد. باید مراقب بود که اسلاید خشک نشود. تاثیر و کارآمدی هیدروکسید پتاسیم را می‌توان به‌وسیله‌ی حضور یا عدم حضور سلول‌های اپی تلیال انسانی که باید هضم شده باشند مورد ارزیابی قرار داد (تصویر شماره 1). برای اجتناب از گزارش نتایج منفی کاذب به‌ دلیل شفاف سازی با تاخیر، نمونه‌های منفی باید نگهداری شده و روز بعد مجددا آزمایش شوند.

محلول 20% با دی متیل سولفوکساید نیز می‌تواند مورد استفاده قرار بگیرد. دی متیل سولفوکساید تجزیه‌ی سریع بافت‌های کراتینیزه را تسهیل می‌کند در حالی که کلرازول بلک یک رنگ sulfonated acid tris-azo است که عناصر قارچی را رنگ می‌کند.

در ارتباط با درصد بالای موارد منفی یا مثبت کاذب با تست‌های KOH توسط افراد کم تجربه رنگ Chlorazol Black E برای بهبود عملکرد KOH معرفی شده است. این رنگ لیپوفیلیک است و بنابراین نسبت به سایر عناصری که در میکروسکوپ مشاهده می‌شوند (و پتانسیل اشتباه گرفتن با سلول‌های قارچی را دارند) به دیواره سلولی قارچی جذب می‌شود. هنگامی‌که جذب دیواره سلولی قارچ شدند عناصر قارچی با آرایش رنگین کمانی به رنگ سبز – سیاه درآمده و به آسانی از ماتریکس بافتی اطراف تشخیص داده می‌شوند. (تصویرشماره 2).

روش تهیه محلول هیدروکسید پتاسیم/ کلرآزول بلک:

هیدروکسید پتاسیم: 10 گرم

گلیسرول: 10 میلی لیتر

Chlorazol Black E %0.1:ء10میلی لیتر

آب مقطر: 80 میلی لیتر

ابتدا هیدروکسید پتاسیم را در آب مقطر حل کنید. سپس گلیسرول و کلرازول بلک را به آن اضافه کنید. گلیسرول از کریستالیزاسیون پتاس و نیز از خشک شدن نمونه جلوگیری می‌نماید.

9/2/3/2- هیدروکسید پتاسیم / سفید کالکوفلور

ترکیب KOH با سفید کالکوفلور عموما برای نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکال استفاده می‌شود به‌علاوه سفید کالکوفلور اجازه می‌دهد که قارچ‌ها در محیطی که حاوی سلول‌های انسانی هضم شده و یا سایر مواد هستند بسیار راحت‌تر خود را نشان دهند. سفید کالکوفلور یک عامل درخشان کننده‌ی منسوجات است و به کیتین موجود در دیواره‌ی سلولی قارچ‌ها باند می‌شود، هرچند که باند شدن غیراختصاصی نیز رخ می‌دهد (رجوع شود به ضمیمه‌ی B). با استفاده از میکروسکوپ فلئورسنت عناصر قارچی را می‌توان با بزرگنمایی نسبتا پایین میکروسکوپ به آسانی مشاهده کرد. استفاده از سفید کالکوفلور مشاهده‌ی مقادیر بزرگ‌تری از نمونه‌ی کلینیکی را در یک زمان کوتاه تسهیل می‌کند و حساسیت تست را افزایش داده، زمان پاسخ‌دهی آن را کاهش می‌دهد.

پیگمانتاسیون دیواره‌های سلولی اگرچه در اسلاید KOH/CFW دیده نمی‌شود، بنابراین موقعی که عناصر قارچی آشکار گردیده و به لحاظ مرفولوژیکال مشخص شد ارزیابی آن با کمک میکروسکوپ نوری برای تعیین دیماتیاسئوس بودن قارچ باید انجام گیرد (تصاویر شماره 3 و 4).

معرف‌های CFW از سازنده (کارخانه) به سازنده‌ی دیگر فرق می‌کند و بنابراین آزمایشگاه باید در این رابطه محتاط باشد و دستورات اختصاصی هر سازنده را پیگیری نماید. برای کسب اطلاعات بیشتر در مورد مواد درخشان کننده‌ی فلئورسنت به ضمیمه‌ی B رجوع فرمایید.

9/2/3/3- آنتی بادی فلئورسنت مستقیم (DFA)

کیت‌های DFA برای جستجوی سریع پنموسیستیس جیرووسی در نمونه‌های فیکس نشده به‌صورت تجارتی در دسترس است. تست DFA برای آشکار کردن پنموسیستیس جیرووسی در نمونه‌های خلط القاء شده، BAL، و نمونه‌ی بافت می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد. آنتی بادی‌های منوکلونال ضد پنموسیستیس جیرووسی با ایزوتیوسیانات فلئورسین چسبیده شده (tagged) است و درصورتی‌که ارگانیسم در نمونه حضور داشته باشد به معرف متصل می‌شود، سپس کمپلکس ارگانیسم و آنتی بادی – FITC در زیر نور ماوراء بنفش قابل مشاهده می‌گردد و در این‌ صورت این کمپلکس (organism-ab-FITC) فلئورسانس به رنگ سیب سبز نشان می‌دهد. هر دو مرحله‌ی کیست و تروفوزوئیت پنموسیستیس جیرووسی در این روش قابل آشکارسازی است (تصویر شماره 5).

از روش‌های مولکولی (مانند PCR) نیز می‌توان برای آشکار کردن پنموسیستیس جیرووسی در نمونه استفاده کرد.

9/2/3/4- آکریدین نارنجی (AO) یا Basic Orange 14

به‌صورت یک محلول 0.01% وزنی حجمی مورد استفاده قرار می‌گیرد. آکریدین نارنجی در بافر استات سدیم (pH: 3.5-4.0) قارچ‌ها را اعم از قارچ‌های رشته‌ای و مخمری رنگ می‌کند و فلئورسانس نارنجی/قرمز روشن در طول موج 440 الی 510 نانومتر نشان می‌دهد.

اسمیرهایی که در مجاورت هوا خشک شده‌اند به مدت یک دقیقه با متانول فیکس شده و سپس با آکریدین نارنجی با pH پایین به‌مدت 2 دقیقه رنگ آمیزی می‌شوند. رنگ اضافی به‌کمک آب شسته شده و سپس با قرار دادن یک لامل بر روی آب اضافی باقیمانده بر روی اسلاید و یا یک ماده‌ی مونت کننده‌ی دیگر، و یا با کمک روغن ایمرسیون مورد بررسی میکروسکپی قرار می‌دهند. مقاطع بافتی را به‌ کمک آب رهیدره کرده و با همین روش می‌توان رنگ آمیزی نمود. به طور تیپیک قارچ‌ها رنگ نارنجی/ قرمز روشن در یک زمینه‌ی تاریک یا سبز رنگ – برحسب اینکه چه مواد دیگری در نمونه حضور داشته باشد – نشان می‌دهند. برخلاف قارچ‌ها که با رنگ‌های فلئورسنت رنگ آمیزی می‌شوند، هایفی‌های رنگ آمیزی شده با آکریدین نارنجی ساختمان‌های دیواره‌ای (شامل دیواره‌های هایفی و یا تیغه‌های عرضی) را به‌خوبی نشان نمی‌دهند. حضور دیواره‌های عرضی را با مشاهده‌ی باندهای نازک شده یا تیره که رنگ نشده‌اند و در فواصل متناوبی در عرض هایفی‌ها دیده می‌شوند می‌توان استنباط کرد. اختلاف بین انشعاب حقیقی و انشعاب کاذب معمولا آشکار است (تصویر شماره 6).

9/2/3/5- مرکب هندی

نمایش حضور کپسول با استفاده از مرکب هندی می‌تواند به‌عنوان یک روش سریع و مستقیم برای شناسایی احتمالی عنصر مخمری به‌عنوان گونه‌های کریپتوکوکوس مطرح باشد هرچند که روش‌های بسیار حساس دیگری مانند سنجش آنتی ژن وجود دارند.

در این روش یک قطره از رسوب سانتریفیوژ شده را در کنار یک قطره مرکب هندی قرار داده با لامل روی آن را پوشانده سپس با بزرگنمایی ضعیف و قوی میکروسکپی بررسی می‌نمایند.

توجه: نتایج منفی کاذب هنگامی حاصل می‌شود که نواحی با غلظت بالا و متراکم مرکب هندی بررسی شده باشد. سلول‌های کریپتوکوکوس نئوفرمنس و کریپتوکوکوس گتی در اندازه متنوع هستند و جوانه‌ها با اتصال باریک به سلول مادری متصل است و اغلب این سلول‌ها کاملا گرد می‌باشند. حضور یک هاله در اطراف سلول‌های مخمری گواه و شاهدی از وجود کپسول می‌باشد (کپسول از نزدیک شدن ذرات مرکب هندی به دیواره‌ی سلول مخمر جلوگیری می‌کند). مخمرهای کپسول‌دار که در نمونه‌ی مایع مغزی نخاعی نشان داده می‌شوند به احتمال زیاد بیانگر حضور کریپتوکوکوس نئوفرمنس یا کریپتوکوکوس گتی هستند. البته سایر گونه‌های کریپتوکوکوس، رودوترولا، و سایر مخمرها نیز ممکن است کپسول داشته باشند. بنابراین با این روش تنها یک شناسایی فرضی و احتمالی صورت می‌گیرد. برای اجتناب از تفسیر نادرست در اثر انکسار نور که ممکن است در اطراف سلول‌های مخمری یا لنفوسیت‌ها پدید آید و منظره‌ی کاذب کپسول را نشان دهد لازم است نهایت دقت و احتیاط به‌عمل آید (تصویر شماره 7). همچنین برای جلوگیری از این‌گونه خطاها باید از کنترل‌های مثبت و منفی استفاده کرد. برخی آزمایشگاه‌ها از کاندیدا آلبیکنس به‌عنوان کنترل منفی و کریپتوکوکوس نئوفرمنس به‌عنوان کنترل مثبت استفاده می‌کنند. هرچند که حضور کپسول یک شاهد احتمالی برای کریپتوکوکوس است غیاب کپسول نمی‌تواند به‌طور قطعی احتمال وجود کریپتوکوکوس در نمونه را رد کند. واریانت‌هایی از کریپتوکوکوس وجود دارند که ممکن است دارای کپسول کوچک و نازکی (diminutive) باشند که با این روش قابل نشان دادن نیست. بنابراین حتی در مواردی که نتیجه‌ی تست مرکب هندی منفی است احتمال حضور کریپتوکوکوس وجود دارد. همچنین باید درنظر داشت که سایر مخمرها نظیر گونه‌های رودوترولا نیز دارای کپسول می‌باشند.

9/2/3/6- رنگ آمیزی گرم

به‌ دلیل اینکه مخمرها و کپک‌ها بصورت متنوع می‌توانند با تکنیک رنگ آمیزی گرم رنگ شوند، برای قارچ‌ها یک رنگ بسیار اختصاصی توصیه می‌شود. هرچند که رنگ آمیزی گرم برای نشان دادن سریع حضور یک ارگانیسم در نمونه می‌تواند کمک موثری بنماید (تصویر شماره 8).

9/2/3/7- رنگ‌های هیستوپاتولوژیکال

یکی از درخواست‌هایی که از آزمایشگاه‌های قارچ‌شناسی می‌شود از نظر رنگ آمیزی‌های هیستولوژیکال است که اغلب برای نمونه‌هایی که کشت نشده‌اند و یا برای بررسی همبستگی بین نتایج کشت و هیستوپاتولوژی از آن‌ها استفاده می‌شود. برای کسب اطلاعات در رابطه با رنگ‌های هیستولوژیکال به ضمیمه C مراجعه شود.

9/3- روش‌های ملکولار

روش‌های ملکولار متنوعی وجود دارد که از آن‌ها برای آشکار ساختن عناصر قارچی در نمونه‌های بالینی استفاده می‌شود. این روش‌ها اغلب شامل روش‌های آمپلیفیکاسیون اسیدهای نوکلئیک – که در برخی از آن‌ها نیاز به استخراج اسیدهای نوکلئیک است – می‌باشند. دستورالعمل‌های راهنما برای سنجش‌های خاص ممکن است با یکدیگر تفاوت داشته باشند اما باید اختلاف‌های مربوط به انواع نمونه‌ها را مورد ملاحظه قرار داد. به‌عنوان مثال برای تهیه نمونه‌های مخاطی تنفسی ممکن است به موکولایزین و یا برای آماده‌سازی بافت ممکن است به هضم پروتئولیتیکی نیاز باشد. هر آزمایشگاه قبل از انجام تست باید موارد خاص اجرایی را مشخص و معتبر نماید.