آزمون میکروبی محصولات آرایشی؛ روش‌ها، مراحل و حدود قابل‌قبول آلودگی

توانایی میکروارگانیسم‌ها برای رشد و تکثیر در فرآورده‌های آرایشی، موضوعی شناخته‌شده است. رشد این میکروارگانیسم‌ها می‌تواند باعث فساد محصول یا ایجاد تغییرات شیمیایی در آن شود. در برخی موارد نیز آلودگی میکروبی می‌تواند سلامت مصرف‌کننده را به خطر بیندازد. به همین دلیل، آزمون میکروبی محصولات آرایشی یکی از مراحل مهم در بررسی وضعیت میکروبی این فرآورده‌هاست.

برای جداسازی میکروارگانیسم‌ها از محصولات آرایشی، دو رویکرد اصلی استفاده می‌شود. شمارش مستقیم کلنی‌ها و کشت غنی‌سازی. در ادامه قصد داریم به بررسی این فرایند بپردازیم. پس با ما همراه باشید.

 آماده‌سازی و رقیق‌سازی نمونه‌های نامحلول در آب

محصولاتی که در آب حل نمی‌شوند، پیش از انجام فرایند جداسازی باید به‌گونه‌ای آماده شوند که با آب امتزاج‌پذیر شوند. یعنی با آب مخلوط شوند و یک محلول یا مخلوط یکنواخت تشکیل دهند. در این فرایند از رقیق‌کننده‌ها و محیط‌های کشت استفاده می‌شود که می‌توانند سیستم‌های نگهدارنده رایج در محصولات آرایشی را تا حدی غیرفعال کنند. میکروارگانیسم‌های جداشده نیز با روش‌های معمول میکروبیولوژی یا با استفاده از کیت‌های تجاری شناسایی می‌شوند.

تجهیزات و ملزومات موردنیاز برای آزمون میکروبی محصولات آرایشی

تجهیزات و مواد

1. پیپت‌های استریل و مدرج در حجم‌های ۱، ۵ و ۱۰ میلی‌لیتر
2. پدهای گاز استریل در ابعاد ۴ × ۴ اینچ
3. ابزارهای استریل شامل پنس، قیچی، اسکالپل و تیغ، اسپاتول و میکرو‌اسپاتول
4. لوله‌های آزمایش درب‌پیچ‌دار با ابعاد ۱۳ × ۱۰۰، ۱۶ × ۱۲۵ و ۲۰ × ۱۵۰ میلی‌متر
5. بطری‌های رقیق‌سازی درب‌پیچ‌دار
6. ترازویی با حساسیت ۰٫۰۱ گرم
7. پتری دیش پلاستیکی استریل با ابعاد ۱۵ × ۱۰۰ میلی‌متر
8. میله‌های شیشه‌ای خمیده استریل
9. انکوباتور با دمای 2 ± 30 درجه سانتی‌گراد و 2 ± 35 درجه سانتی‌گراد
10. پاکت‌های تولیدکننده اتمسفر بی‌هوازی، نوارهای شناساگر و جارهای بی‌هوازی، مانند محصولات BBL، Oxoid یا معادل آن‌ها؛ یا انکوباتور بی‌هوازی با دمای 2 ± 35 درجه سانتی‌گراد؛ یا گلاوباکس بی‌هوازی با همین دما
11. جار شمعی یا انکوباتور CO₂ با دمای 2 ± 35 درجه سانتی‌گراد
12. هود جریان آرام مجهز به فیلتر HEPA، در صورت وجود
13. سیستم شناسایی خودکار و رایانه‌ای Vitek یا سیستم معادل
14. هموژنایزر، مانند دستگاه Stomacher
15. کیسه‌های استریل مخصوص هموژنایزر؛ نوع دارای فیلتر ترجیح داده می‌شود.
16. لوله‌های مخروطی استریل با حجم بالا و درب‌پیچ‌دار

محیط‌های کشت برای شمارش و شناسایی باکتری‌های گرم‌مثبت و قارچ‌ها

برای آزمون میکروبی محصولات آرایشی و شناسایی میکروارگانیسم‌ها، محیط‌ها و معرف‌های زیر مورد استفاده قرار می‌گیرند:

1. آگار بی‌هوازی (Anaerobe agar، M11)
2. آگار بایل اسکولین (Bile esculin agar، M18)
3. آگار و براث Brain Heart Infusion یا BHI (M24)
4. آگار عصاره مالت (Malt Extract Agar، MEA، M93)
5. آگار سیب‌زمینی دکستروز (Potato Dextrose Agar، PDA، M127)
6. آگار مانیتول سالت (Mannitol Salt Agar، M97)
7. آگار لیتین اصلاح‌شده (Modified Letheen Agar، MLA، M78) و براث لیتین اصلاح‌شده (MLB، M79)
8. محیط آزمون اکسیداتیو-تخمیری (Oxidative-Fermentative، OF، M117)
9. براث سابورود دکستروز (Sabouraud’s Dextrose Broth، M133)
10. پایه آگار خون (Blood Agar Base، M20a)
11. آگار نشاسته (Starch Agar، M143)
12. آگار سویا تریپتیکاز یا تریپتیک (Trypticase/Tryptic Soy Agar، TSA، M152) و براث آن (TSB، M154)
13. آگار بیرد-پارکر (Baird-Parker Agar، BP، M17)
14. آزمون کاتالاز (Catalase Test، R12)
15. آگار Vogel-Johnson (VJ، M176)، به‌صورت اختیاری
16. کیت تجاری شناسایی باکتری‌ها، مانند API یا معادل آن

محیط‌های شناسایی انتروباکتریاسه در آزمون میکروبی محصولات آرایشی

1. براث کربوهیدرات آندراده و شناساگر (M13) برای بررسی متابولیسم رامنوز، مانیتول، سوربیتول و آرابینوز
2. آگار لیزین آهن (Lysine Iron Agar، M89)
3. براث مالونات (M92) یا براث فنیل‌آلانین مالونات (Difco)
4. محیط موتیلیتی-ایندول-اورنیتین (Motility-Indole-Ornithine، M99)
5. براث MR-VP (M104)
6. آگار سیترات سیمونز (Simmons Citrate Agar، M138)
7. آگار سه قندی آهن (Triple Sugar Iron، TSI، M149)
8. آگار اوره کریستنسن (Christensen’s Urea Agar، M40)
9. آگار مک‌کانکی (MacConkey Agar، M91)
10. محیط دکربوکسیلاز لیزین برای باکتری‌های گرم‌منفی غیرتخمیری (M88)
11. آگار فنیل‌آلانین دآمیناز (M123)
12. کیت‌های شناسایی API 20E، Roche Enterotube یا سایر کیت‌های معادل

تمام آزمون‌های بیوشیمیایی با استفاده از محیط‌های بخش‌های B و C باید در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد و به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت انکوبه شوند. استثنا شامل براث مالونات با زمان انکوباسیون ۴۸ ساعت و براث MR-VP با زمان انکوباسیون ۴۸ ساعت یا بیشتر است.

محیط‌ها و معرف‌های شناسایی باسیل‌های گرم‌منفی غیرتخمیری

1. محیط استامید (M2)
2. رنگ‌آمیزی تاژک کلارک (Clark’s Flagellar Stain، R14)
3. آگار اسکولین اصلاح‌شده CDC (M53)
4. ژلاتین مغذی CDC (M115)
5. محیط ایندول (M64) و محیط ایندول CDC (M65)
6. محیط کینگ B (King’s B، M69)
7. محیط لیزین دکربوکسیلاز (LDC) برای باکتری‌های گرم‌منفی غیرتخمیری (M88)
8. محیط تحرک-نیترات (Motility Nitrate Medium، M101)
9. براث نیترات غنی‌شده CDC (M109)
10. محیط پایه OF کینگ (King’s OF Basal Medium، M70) برای بررسی متابولیسم ساکاروز، لاکتوز، فروکتوز، اسکولین، زایلوز، گلوکز یا دکستروز، مانیتول، سالیسین، سوربیتول و مالتوز
11. نوارهای آزمون اکسیداز
12. آگار اوره کریستنسن (M40)
13. محیط پایه دکربوکسیلاز برای بررسی آرژینین دکربوکسیلاز (M44)
14. آگار عصاره مخمر (Yeast Extract Agar، YE، M181)
15. آگارهای Pseudomonas نوع F (M128) و P (M129) شرکت Difco
16. آگار ستریماید (Cetrimide Agar؛ Pseudosel™، BBL؛ Difco) یا معادل آن (M37)
17. گلیسرول استریل (Difco) یا معادل آن
18. سیستم‌های شناسایی تجاری API، NFT یا معادل آن‌ها
19. براث سیترات کوزر (Koser’s Citrate Broth، M72)

سایر محیط‌ها و معرف‌های موردنیاز

1. محلول آبی حاوی ۷۰٪ اتانول و ۱٪ اسید هیدروکلریک (HCl) به‌صورت حجمی، یا محلول ۴٪ ید در اتانول ۷۰٪، یا محلول ۲٪ گلوتارآلدئید
2. Tween 80 یا Polysorb 80
3. اتانول ۹۵٪ حجمی
4. پلاسمای کواگولاز خرگوش لیوفیلیزه حاوی EDTA
5. محلول آبی ۳٪ پراکسید هیدروژن
6. رنگ‌آمیزی گرم (R32) و رنگ‌آمیزی اندوسپور (R32a)
7. محیط گوشت پخته (Cooked Meat Medium، M42)

نحوه نگهداری و آماده‌سازی نمونه‌های آرایشی

در ادامه به بررسی نکات مهم در نگهداری نمونه برای آزمون میکروبی محصولات آرایشی خواهیم پرداخت.

نمونه‌ها باید تا حد امکان بلافاصله پس از دریافت مورد آزمایش قرار گیرند. در صورت نیاز، نمونه‌ها را در دمای اتاق نگهداری کنید.

نمونه‌ها را قبل یا بعد از آزمون انکوبه، در یخچال نگهداری یا منجمد نکنید.

پیش از باز کردن ظرف نمونه، آن را با دقت بررسی کنید و هرگونه بی‌نظمی یا آسیب در ظرف را ثبت کنید.

سطح ظرف نمونه باید پیش از باز کردن و خارج کردن محتویات، با محلول آبی حاوی ۷۰٪ اتانول و ۱٪ HCl یا سایر مواد ضدعفونی‌کننده ذکرشده در بخش E ضدعفونی شود.

در صورت امکان، این کار در هود جریان آرام انجام شود. پیش از باز کردن ظرف، سطح آن را با گاز استریل خشک کنید.

برای آزمون میکروبی محصولات آرایشی باید از بخش نماینده‌ای از محتویات نمونه استفاده شود.

اگر وزن یا حجم محصول کمتر از ۱ گرم یا ۱ میلی‌لیتر باشد، تمام محتویات باید مورد آزمایش قرار گیرد.

اگر تنها یک واحد نمونه در دسترس باشد و انجام چند نوع آزمون، مانند آزمون میکروبی، سم‌شناسی و شیمیایی، درخواست شده باشد، ابتدا زیرنمونه موردنیاز برای آزمایش میکروبی را بردارید.

در این شرایط، مقدار زیرنمونه مورد استفاده برای آزمون میکروبی به سایر آزمایش‌هایی که قرار است انجام شوند، بستگی دارد. برای مثال، اگر حجم کل نمونه ۵ میلی‌لیتر باشد، می‌توان ۱ یا ۲ میلی‌لیتر از آن را برای آزمون میکروبی اختصاص داد.

آماده‌سازی اولیه نمونه برای آزمون میکروبی محصولات آرایشی

مقادیر نمونه و رقیق‌کننده ذکرشده در این بخش را می‌توان بر اساس مقدار نمونه موجود تنظیم کرد.

اگر نمونه شامل تعداد زیادی زیرنمونه باشد، می‌توان با ترکیب آن‌ها مقدار ماده مورد آزمایش را افزایش داد و حجم کار را کاهش داد. زمان و مقدار ترکیب زیرنمونه‌ها باید بر اساس تشخیص و قضاوت کارشناس تعیین شود.

۱. نمونه‌های مایع

برای تهیه رقت ¹⁻۱۰، مقدار ۱ میلی‌لیتر از نمونه مایع را مستقیماً به ۹ میلی‌لیتر براث لیتین اصلاح‌شده (MLB) در یک لوله آزمایش درب‌پیچ‌دار ۲۰ × ۱۵۰ میلی‌متری منتقل کنید.

۲. نمونه‌های جامد و پودری

به‌صورت آسپتیک، ۱ گرم از نمونه را بردارید و وزن کنید.

نمونه را داخل لوله آزمایش درب‌پیچ‌دار ۲۰ × ۱۵۰ میلی‌متری که حاوی ۱ میلی‌لیتر Tween 80 است، قرار دهید.

محصول را با استفاده از اسپاتول استریل در Tween 80 پراکنده کنید.

سپس ۸ میلی‌لیتر MLB استریل اضافه کرده و محتویات را به‌خوبی مخلوط کنید.

این مخلوط، رقت¹-۱۰ خواهد بود.

۳. محصولات کرمی و روغنی

به‌صورت آسپتیک، ۱ گرم از نمونه را بردارید و وزن کنید.

نمونه را در یک لوله ۲۰ × ۱۵۰ میلی‌متری درب‌پیچ‌دار قرار دهید که حاوی ۱ میلی‌لیتر Tween 80 است.

سپس پنج تا هفت مهره شیشه‌ای ۵ میلی‌متری یا ۱۰ تا ۱۵ مهره شیشه‌ای ۳ میلی‌متری اضافه کنید.

تمام محتویات را با دستگاه Vortex مخلوط کنید.

حجم نهایی را با MLB استریل به ۱۰ میلی‌لیتر برسانید. برای این کار، ۸ میلی‌لیتر MLB اضافه کنید.

این مخلوط، رقت¹-۱۰ خواهد بود.

۴. آئروسل‌های پودری، صابون‌ها، مایعات و سایر مواد

نازل قوطی اسپری را تا حد امکان با استفاده از پد گاز مرطوب‌شده با اتانول آبی ۷۰٪ ضدعفونی کنید.

مقداری از محصول را خارج کنید تا نازل شست‌وشو داده شود.

سپس مقدار مناسبی از محصول را در بطری رقیق‌سازی از پیش وزن‌شده اسپری کنید. برای مثال، ۱ گرم محصول را به ۹ میلی‌لیتر MLB استریل اضافه کنید.

محصول و براث را کاملاً مخلوط کنید و دوباره وزن کنید.

اگر دقیقاً ۱ گرم نمونه به دست آمده باشد، این مخلوط، رقت¹-۱۰ خواهد بود.

۵. مواد بدون آب

مواد بدون آب را، بر اساس نوع نمونه، مطابق روش 2 یا 3 آماده کنید.

۶. دستمال‌های مرطوب

یک برگ دستمال مرطوب را به‌صورت آسپتیک از بسته‌بندی تجاری خارج کنید. این برگ به‌عنوان یک زیرنمونه در نظر گرفته می‌شود.

محل قرارگیری برگ انتخاب‌شده درون بسته باید مطابق توضیحات بخش «نکته» ثبت شود.

ابتدا یک کیسه استریل را وزن اولیه یا Tare کنید.

سپس برگ دستمال را داخل کیسه قرار داده و وزن کنید.

به کیسه، مقداری Tween 80 استریل معادل وزن دستمال و مقداری MLB استریل معادل هشت برابر وزن آن اضافه کنید تا رقت ¹⁻۱۰ به دست آید.

برای مثال، برای یک دستمال ۵ گرمی، ۵ میلی‌لیتر Tween 80 و ۴۰ میلی‌لیتر MLB اضافه کنید.

کیسه را داخل دستگاه Stomacher قرار دهید و محتویات را با سرعت ۲۳۰ دور در دقیقه به مدت ۱ دقیقه همگن کنید.

روش جایگزین برای دستمال‌های مرطوب

یک لوله مخروطی استریل را وزن اولیه کنید.

برگ دستمال را داخل لوله قرار دهید و وزن کنید.

سپس ۱۰ مهره شیشه‌ای ۴ میلی‌متری، یا پنج تا هفت مهره شیشه‌ای ۵ میلی‌متری، یا ۱۰ تا ۱۵ مهره شیشه‌ای ۳ میلی‌متری اضافه کنید.

به آن مقدار Tween 80 استریل معادل وزن دستمال و مقدار MLB استریل معادل هشت برابر وزن دستمال اضافه کنید تا رقت ¹⁻۱۰ ایجاد شود.

محتویات را با دستگاه Vortex و با حداکثر سرعت، به مدت ۳۰ ثانیه مخلوط کنید.

نکته مهم درباره نمونه‌برداری از دستمال‌های مرطوب

مقدار و نوع میکروارگانیسم‌های موجود در دستمال‌ها ممکن است در نقاط مختلف یک بسته متفاوت باشد.

بنابراین، هنگام بررسی چند زیرنمونه، توصیه می‌شود برگ‌های دستمال از موقعیت‌های مختلف داخل بسته انتخاب شوند.

برای مثال، در یک بسته شامل دستمال‌های روی‌هم‌چیده:

• برای زیرنمونه‌های شماره ۱ و ۲، یک برگ از یک‌سوم بالایی بسته بردارید.
• برای زیرنمونه‌های شماره ۳ و ۴، یک برگ از یک‌سوم میانی بردارید.
• برای زیرنمونه شماره ۵، یک برگ از یک‌سوم پایینی بسته انتخاب کنید.

شمارش و رشد میکروبی

۱. شمارش کلی باکتری‌های هوازی (APC)

برای تسهیل تشخیص انواع مختلف کلنی‌ها، از روش کشت سطحی (Spread Plate) استفاده کنید.

محلول آماده‌شده نمونه را با استفاده از MLB به‌صورت ده‌دهی رقیق کنید تا رقت‌های ¹- ۱۰ تا ³- ۱۰ به دست آید. برای تهیه هر رقت، ۱ میلی‌لیتر از رقت قبلی را با استفاده از پیپت استریل به ۹ میلی‌لیتر MLB تازه منتقل و کاملاً مخلوط کنید.

تمام کشت‌ها باید در دو تکرار انجام شوند. از هر رقت ¹- ۱۰ تا ³- ۱۰ ، مقدار ۰٫۱ میلی‌لیتر روی پلیت حاوی آگار لیتین اصلاح‌شده (MLA) کشت دهید. ضریب رقت در این مراحل به‌ترتیب ۱۰۰، ۱۰۰۰ و ۱۰٬۰۰۰ است.

همچنین، ۱ میلی‌لیتر از رقت¹- ۱۰  را روی مجموعه‌ای از پلیت‌های MLA کشت دهید. این حجم را می‌توان بین دو یا سه پلیت تقسیم کرد، مشروط بر اینکه حجم نهایی دقیقاً ۱ میلی‌لیتر باشد. این کار برای مجموعه دوم پلیت‌ها نیز به‌عنوان تکرار انجام شود.

در صورت نیاز، شمارش قارچ‌ها و میکروارگانیسم‌های بی‌هوازی نیز با همین روش انجام می‌شود. تمام رقت‌های تهیه‌شده را برای مرحله غنی‌سازی نگه دارید.

مایه تلقیح را با پخش‌کننده استریل روی سطح محیط پخش کنید و اجازه دهید جذب شود. سپس پلیت‌ها را به‌صورت وارونه، در دمای ۳۰ ± ۲ درجه سانتی‌گراد به مدت ۴۸ ساعت انکوبه کنید.

برای تسریع جذب مایه تلقیح، می‌توان پلیت‌های MLA را پیش از استفاده به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۳۰ درجه سانتی‌گراد خشک کرد.

پس از انکوباسیون، تعداد کلنی‌ها را شمارش و ثبت کنید. در پلیت‌هایی که مجموعاً ۱ میلی‌لیتر از رقت ¹- ۱۰ روی آن‌ها کشت داده شده است، تعداد کلنی‌ها را با یکدیگر جمع کنید. همین محاسبه برای تکرار دوم نیز انجام شود.

شمارش باکتری‌های هوازی مطابق دستورالعمل فصل ۳ کتاب BAM محاسبه و به صورت **APC/g (mL)** گزارش شود. در صورت مشاهده‌نشدن کلنی، نتیجه به صورت **کمتر از ۱۰ CFU/g (mL)** گزارش شود.

مرحله غنی‌سازی

رقت‌های باقی‌مانده ¹⁻۱۰، ²⁻۱۰ و ³⁻۱۰ را در MLB در دمای 2± 30 درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

هر روز نمونه‌های غنی‌شده در MLB را از نظر رشد بررسی کنید.

محیط‌های غنی‌سازی را به مدت ۷ روز انکوبه کنید؛ در صورتی که رشد مشکوک زودتر مشاهده شد، می‌توان انکوباسیون را زودتر متوقف کرد.

تمام محیط‌های غنی‌شده را روی هر دو محیط MLA و مک‌کانکی آگار کشت دهید.

پلیت‌ها را به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۳۰ ± ۲ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

۲. شمارش قارچ، مخمر و کپک (YMPC)

برای کشت از آگار عصاره مالت (MEA) یا آگار سیب‌زمینی دکستروز (PDA) استفاده کنید.

هر دو محیط باید حاوی ۴۰ ppm کلرتتراسایکلین باشند.

پس از جذب مایه تلقیح توسط محیط، پلیت‌ها را در دمای ۳۰ ± ۲ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

پلیت‌ها را وارونه نکنید و بیش از سه پلیت را روی یکدیگر قرار ندهید.

دستورالعمل شمارش پلیت در این بخش بر اساس فصل ۱۸ BAM، یعنی روش رقیق‌سازی و کشت پلیت برای شمارش مخمرها و کپک‌ها در مواد غذایی، تنظیم شده است.

کلنی‌ها را پس از ۵ روز انکوباسیون شمارش کنید.

اگر پس از ۵ روز هیچ رشدی مشاهده نشد، انکوباسیون را ۴۸ ساعت دیگر ادامه دهید.

پلیت‌ها را پیش از پایان دوره انکوباسیون برای شمارش خارج نکنید. دستکاری پلیت می‌تواند باعث آزاد شدن اسپورها و ایجاد رشد ثانویه شود. در این صورت، شمارش نهایی معتبر نخواهد بود.

کلنی‌های روی پلیت‌ها را شمارش و تعداد آن‌ها را مطابق بخش H-1 محاسبه کنید.

محدوده پیشنهادی شمارش در این روش ۱۰ تا ۱۵۰ کلنی است.

نتایج را به صورت تعداد در گرم یا میلی‌لیتر برای مخمر و کپک گزارش کنید.

اگر هیچ کلنی‌ای در هیچ‌یک از رقت‌ها مشاهده نشد، نتیجه YMPC را به صورت:

کمتر از ۱۰ CFU/g (mL) گزارش کنید.

روش اختیاری: غنی‌سازی قارچ‌ها

برای غنی‌سازی قارچ‌ها می‌توان نمونه آماده‌شده را به‌صورت ده‌دهی در براث سابورود دکستروز رقیق کرد.

سپس نمونه‌ها را مطابق روش انکوباسیون رقت‌های MLB انکوبه کنید.

در صورت مشاهده رشد، روی آگار سابورود دکستروز، MEA یا PDA کشت خطی انجام دهید.

محیط‌های MEA و PDA باید هر دو حاوی ۴۰ ppm کلرتتراسایکلین باشند.

۳. شمارش پلیت بی‌هوازی

برای کشت، از MLA، آگار بی‌هوازی پیش‌کاهش‌یافته و آگار خون گوسفند دفبریله‌شده ۵٪ استفاده کنید. پلیت‌های آگار خون را در اتمسفر حاوی ۵ تا ۱۰٪ دی‌اکسیدکربن، با استفاده از جار شمعی یا انکوباتور CO₂، و پلیت‌های آگار بی‌هوازی را در شرایط بی‌هوازی انکوبه کنید.

پلیت‌های آگار بی‌هوازی را پیش از تلقیح، به مدت ۱۲ تا ۱۶ ساعت در شرایط بی‌هوازی پیش‌کاهش دهید. سپس پلیت‌های آگار بی‌هوازی را در شرایط بی‌هوازی و پلیت‌های MLA را به‌صورت هوازی، هر دو در دمای ۳۵ ± ۲ درجه سانتی‌گراد به مدت ۴۸ ساعت انکوبه کنید. اگر پس از ۴۸ ساعت رشدی مشاهده نشد، انکوباسیون را ۲ روز دیگر ادامه دهید.

برای کاهش انتشار رشد ناشی از رطوبت، استفاده از حدود ۰٫۱ میلی‌لیتر مایه تلقیح توصیه می‌شود. پلیت‌های تلقیح‌شده باید حداکثر طی چند دقیقه در شرایط بی‌هوازی قرار گیرند تا تماس با اکسیژن به حداقل برسد.

میکروارگانیسم‌های مشکوک به بی‌هوازی بودن را در هر دو شرایط هوازی و بی‌هوازی کشت مجدد دهید تا وابستگی آن‌ها به اکسیژن مشخص شود.

برای بررسی اسپورزایی، رشد را در براث گوشت پخته پس از ۲ روز انکوباسیون در دمای ۳۵ درجه سانتی‌گراد بررسی کنید. استفاده از رنگ‌آمیزی افتراقی اسپور برای تأیید وجود اسپور الزامی است. روش‌های دیگر ممکن است آرتیفکت‌های غیر اسپور را نیز به‌عنوان اسپور شناسایی کنند.

شناسایی میکروارگانیسم‌ها: خالص‌سازی و شناسایی اولیه

کپک‌ها و مخمرها باید خالص‌سازی شوند.

مخمرها نیز تا حد امکان باید با استفاده از کیت‌هایی مانند کارت مخمر Vitek و نوار جذب مخمر API شناسایی شوند.

برای باکتری‌ها، تمام پلیت‌ها را بررسی کنید.

انواع کلنی‌هایی را که از نظر مورفولوژی با یکدیگر متفاوت هستند، روی محیط‌های مک‌کانکی و MLA کشت خطی دهید.

از تمام انواع کلنی‌های متفاوت از نظر مورفولوژی که در کشت خالص به دست آمده‌اند، رنگ‌آمیزی گرم تهیه کنید.

با روش‌های ارائه‌شده در این فصل، معمولاً می‌توان جدایه‌ها را تا سطح جنس شناسایی کرد.

در صورت نیاز، آزمون‌های مربوط به شناسایی در سطح گونه نیز ارائه شده‌اند.

نتایج آزمون‌ها باید با استفاده از Bergey’s Manual یا روش‌های Madden ارزیابی شوند.

در صورت امکان، تمام جدایه‌ها باید تا سطح گونه شناسایی شوند.

برای شناسایی گونه‌ای میکروارگانیسم‌های به‌دست‌آمده از پلیت‌های شمارش و براث غنی‌سازی، استفاده از کیت‌های تجاری مانند API، Roche، Vitek و Hewlett-Packard توصیه می‌شود

شناسایی باسیل‌های گرم‌مثبت

برای افزایش اسپورزایی، جدایه را روی پلیت آگار نشاسته تلقیح کنید و به مدت ۴۸ ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید.

از کلنی جداشده، رنگ‌آمیزی گرم یا رنگ‌آمیزی اندوسپور تهیه کنید.

سپس موارد زیر را بررسی و ثبت کنید:

• محل قرارگیری اندوسپور در سلول رویشی؛ مرکزی، انتهایی یا زیرانتهایی
• شکل اندوسپور؛ گرد یا بیضوی
• مورفولوژی اسپورانژیوم سلول در حال اسپورزایی؛ متورم یا غیرمتورم

تمام باسیل‌های هوازی اسپورساز را از نظر تحرک با یکی از دو روش زیر آزمایش کنید.

الف) روش کشت

لوله حاوی محیط آزمون تحرک یا محیط موتیلیتی-ایندول-اورنیتین را با جدایه تلقیح کنید.

تلقیح را با فروبردن مستقیم ابزار تلقیح در محیط انجام دهید.

لوله را به‌صورت هوازی به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید.

اگر رشد از خط تلقیح فراتر رفته باشد و کدورت محیط اطراف خط تلقیح مشاهده شود، آزمون مثبت است.

ب) بررسی میکروسکوپی

کلنی جداشده را در یک براث مناسب تلقیح کنید.

آن را به‌صورت هوازی به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید.

یک قطره از کشت براث را روی لام تمیز میکروسکوپ قرار دهید و لامل بگذارید.

تحرک زمانی مشاهده می‌شود که سلول‌های منفرد باکتری در جهت‌های تصادفی حرکت کنند.

نمونه را با بزرگنمایی ۴۰۰× یا با استفاده از روش غوطه‌وری در روغن مشاهده کنید.

برای شناسایی بیشتر باسیل‌های گرم‌مثبت، ابتدا آزمون کاتالاز را انجام دهید و سپس مراحل زیر را دنبال کنید.

۱. باسیل‌های بزرگ اسپورساز و کاتالاز مثبت

اگر کاتالاز تولید شود و باسیل‌های بزرگ اسپورساز مشاهده شوند، از کارت VITEK BCL، کیت API 50 CHB یا کیت تجاری معادل برای شناسایی جدایه تا سطح گونه استفاده کنید.

این جدایه ممکن است از جنس Bacillus باشد.

اگر گروه Bacillus cereus شناسایی شد، برای تمایز گونه‌های موجود در این گروه به فصل ۱۴ BAM با عنوان Bacillus cereus مراجعه کنید.

با این حال، شناسایی باسیل‌های شبه-Bacillus فقط زمانی لازم است که جدایه‌ها از پلیت‌های هوازی به دست آمده باشند و برای جدایه‌های حاصل از مرحله غنی‌سازی لازم نیست.

۲. باسیل‌های کاتالاز منفی

اگر کاتالاز تولید نشود، از کارت VITEC CBC، کیت API 50 CHL یا کیت تجاری معادل برای شناسایی جدایه تا سطح گونه استفاده کنید.

این جدایه ممکن است Lactobacillus باشد.

۳. کوکوباسیل‌های کوتاه کاتالاز مثبت

در موارد نادر، اگر کاتالاز تولید شود و کوکوباسیل‌های کوتاه مشاهده شوند، آزمون تحرک را انجام دهید.

اگر جدایه در دمای ۲۰ تا ۲۵ درجه سانتی‌گراد متحرک و در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد غیرمتحرک باشد، ممکن است Listeria باشد.

برای شناسایی جدایه تا سطح گونه از کارت VITEK GP، کیت API Listeria یا کیت تجاری معادل استفاده کنید.

شناسایی کوکسی‌های گرم‌مثبت

از محیط APC (MLA یا BP)، یک پلیت MLA را کشت خطی داده و به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ ± ۲ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید. سپس فعالیت کاتالاز و در صورت مثبت بودن آن، تولید کواگولاز را بررسی کنید.

در صورت منفی بودن کاتالاز: آگار بایل اسکولین، TSB حاوی ۶٫۵٪ NaCl و آگار خون گوسفند ۵٪ را تلقیح و ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ ± ۲ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید. نتایج به شکل زیر گزارش می‌شوند:

• سیاه شدن بایل اسکولین و رشد در ۶٫۵٪ NaCl: Enterococcus spp. (Group D enterococcus)
• سیاه شدن بایل اسکولین بدون رشد در ۶٫۵٪ NaCl: Group D Streptococcus, not enterococcus
• عدم سیاه شدن بایل اسکولین: گزارش به‌عنوان استرپتوکوک آلفا، بتا یا گاماهمولیتیک، بر اساس نوع همولیز.
• در صورت نبود آگار خون گوسفند ۵٪: Streptococcus, not Group D

در صورت نیاز، شناسایی تکمیلی استرپتوکوک‌ها با روش‌های مرجع ۷ یا کیت‌های سرولوژیک تجاری انجام می‌شود.

در صورت مثبت بودن کاتالاز: کلنی تازه را روی آگار مانیتول سالت و محیط‌های OF حاوی دکستروز، با و بدون لایه وازلین یا روغن معدنی، و نیز آگار غنی‌شده اسلنت برای آزمون کواگولاز تلقیح کنید. شناسایی به‌صورت زیر انجام می‌شود:

• S. aureus: کواگولاز مثبت و/یا تخمیر مانیتول
• S. epidermidis: کواگولاز منفی، عدم تخمیر مانیتول و واکنش‌های اکسیداتیو و تخمیری در OF دکستروز
• Micrococcus spp.: واکنش اکسیداتیو بدون تخمیر در OF دکستروز

الف) آزمون کاتالاز

یک قطره از H₂O₂ سه‌درصد را مستقیماً روی کلنی جداشده یا روی یک لام تمیز قرار دهید.

حلقه پلاتینی حاوی مقداری از جدایه را داخل قطره قرار دهید.

اگر گاز اکسیژن به‌سرعت آزاد شود و حباب تشکیل شود، واکنش مثبت است.

حلقه‌های سیم نیکروم ممکن است واکنش مثبت کاذب ایجاد کنند.

هنگام قرار دادن H₂O₂ مستقیماً روی کلنی، باکتری‌ها کشته خواهند شد.

برای کنترل کیفیت محلول H₂O₂، یک کنترل مثبت، مانند Staphylococcus یا یک باکتری روده‌ای، و یک کنترل منفی، مانند Streptococcus، باید هم‌زمان آزمایش شوند.

ب) آزمون کواگولاز

مقدار کمی از رشد حاصل از اسلنت نگهداری را به یک لوله ۱۳ × ۱۰۰ میلی‌متری حاوی ۰٫۲ میلی‌لیتر BHI Broth منتقل کنید.

لوله را به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ ± ۲ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

سپس ۰٫۵ میلی‌لیتر پلاسمای کواگولاز خرگوش لیوفیلیزه بازسازی‌شده و حاوی EDTA اضافه کنید.

محتویات را کاملاً مخلوط کنید.

به مدت ۶ ساعت در دمای ۳۵ ± ۲ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید و تشکیل لخته را بررسی کنید.

برخی سویه‌های دارای تولید ضعیف کواگولاز ممکن است برای مشاهده تشکیل لخته به انکوباسیون شبانه نیاز داشته باشند.

در هر مجموعه نمونه، یک میکروارگانیسم شناخته‌شده کواگولاز مثبت و یک میکروارگانیسم شناخته‌شده کواگولاز منفی نیز باید استفاده شود.

تمام سویه‌هایی را که واکنش کواگولاز مثبت دارند، S. aureus در نظر بگیرید.

شناسایی باسیل‌های گرم‌منفی

تمام باسیل‌های گرم‌منفی را روی محیط‌های زیر تلقیح کنید:

• آگار TSI به‌صورت اسلنت
• پلیت آگار مک‌کانکی
• آگار ستریماید
• پلیت MLA

محیط‌ها را به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ ± ۲ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

واکنش‌های TSI اسلنت/ته لوله به شکل A/A یا K/A، که در آن A نشان‌دهنده اسیدی و K نشان‌دهنده قلیایی است، همراه با تولید H₂S، نشان‌دهنده یک جدایه از خانواده Enterobacteriaceae است.

واکنش‌های K/K، K/NC، که در آن NC به معنی «بدون تغییر» است، یا NC/NC نشان‌دهنده باسیل‌های گرم‌منفی غیرتخمیری (NF) هستند.

اگر تولید سولفید هیدروژن باعث پوشیده‌شدن یا مخفی‌شدن واکنش‌های TSI شود، براث‌های کربوهیدرات لاکتوز و گلوکز را تلقیح کرده و به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ ± ۲ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

برای جدایه‌های Enterobacteriaceae، آزمون‌های ذکرشده را انجام دهید و نتایج را با استفاده از منابع ۳، ۶ و ۱۱ تا ۱۳ تفسیر کنید.

برای شناسایی در سطح گونه می‌توان از API 20E یا کیت تجاری معادل استفاده کرد.

محیط‌های موردنیاز برای این آزمون‌ها در بخش های بالاتر  فهرست شده‌اند.

شناسایی باسیل‌های گرم‌منفی غیرتخمیری و Pseudomonas

اگر میکروارگانیسم روی آگار ستریماید رشد کند یا به‌عنوان یک باسیل گرم‌منفی غیرتخمیری شناسایی شود، موارد زیر را تعیین کنید:

• تولید رنگدانه فلورسنت و غیرفلورسنت
• تولید اسید به‌صورت هوازی از گلوکز، ساکاروز، زایلوز یا مانیتول
• تولید گاز نیتروژن از یک منبع نیتروژن غیرآلی

سایر آزمون‌های موردنیاز را با استفاده از محیط‌های فهرست‌شده در بخش D انجام دهید.

استفاده از استامید، رشد در دمای ۴۲ درجه سانتی‌گراد و مایع‌سازی ژلاتین از آزمون‌های مهم برای تمایز سه گونه Pseudomonas شامل:

• aeruginosa
• fluorescens
• putida

هستند.

برای تفسیر نتایج این آزمون‌ها از منابع ۴، ۱۱، ۱۲ و ۱۹ یا از کیت و پایگاه داده API مربوط به باکتری‌های غیرتخمیری استفاده کنید.

جدایه‌های مشکوک به P. aeruginosa باید با روش زیر تأیید شوند.

شناسایی Pseudomonas aeruginosa؛ بخش مهم آزمون میکروبی محصولات آرایشی

شناسایی P. aeruginosa اهمیت ویژه‌ای دارد. این میکروارگانیسم می‌تواند در محصولات آرایشی مورد استفاده در ناحیه چشم زنده بماند و با عفونت‌های چشمی مرتبط بوده است.

این باکتری یک پاتوژن فرصت‌طلب انسانی است و مقاومت بالایی در برابر عوامل ضدباکتریایی مانند ترکیبات آمونیوم چهارتایی، پنی‌سیلین و بسیاری از آنتی‌بیوتیک‌های وسیع‌الطیف دارد.

به همین دلیل، شناسایی آن یکی از بخش‌های مهم آزمون میکروبی محصولات آرایشی محسوب می‌شود.

الف) شناسایی اولیه

آگار TSI

کلنی‌های تیپیک و کاملاً جداشده از پلیت آگار ستریماید را به اسلنت TSI منتقل کنید.

سطح محیط را کشت خطی دهید و قسمت ته لوله را نیز تلقیح کنید.

لوله را به مدت ۲۴ ± ۲ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

تمام اسلنت‌هایی که رشد داشته باشند و در بخش اسلنت و ته لوله واکنش قلیایی یا قرمز نشان دهند، باید به‌عنوان موارد مشکوک مثبت برای Pseudomonas spp. در نظر گرفته شوند.

سپس آزمون اکسیداز و سایر واکنش‌های بیوشیمیایی را انجام دهید.

برخی سودوموناس‌ها ممکن است مقدار کمی H₂S در TSI تولید کنند. این واکنش ممکن است با رنگدانه‌های محلول تولیدشده توسط برخی گونه‌ها اشتباه شود.

آزمون اکسیداز

برای آزمون اکسیداز سودوموناس‌ها از نوارهای آزمون اکسیداز استفاده کنید.

ترکیب معرف

• Tetramethyl-p-phenylenediamine-dihydrochloride: مقدار ۱٫۰ گرم
• Ascorbic acid: مقدار ۰٫۱ گرم
• آب مقطر: ۱۰۰ میلی‌لیتر

کاغذ صافی Whatman شماره ۴۰ را به نوارهای کوچک، تقریباً ۱۰ × ۴۰ میلی‌متر، برش دهید.

نوارها را در معرف قرار دهید.

سپس آن‌ها را خارج کرده و اجازه دهید محلول اضافی خارج شود.

نوارها را روی حوله‌های کاغذی در یک سینی قرار دهید.

برای محافظت از معرف در برابر نور، روی نوارها را با حوله کاغذی بپوشانید.

سپس آن‌ها را در انکوباتور ۳۵ درجه سانتی‌گراد خشک کنید.

معرف در دماهای بالاتر نیز تجزیه می‌شود.

پس از خشک‌شدن، نوارها را در یک بطری قهوه‌ای و در دمای اتاق نگهداری کنید.

نوارها باید از نور و رطوبت محافظت شوند.

نوار آماده باید سفید باشد.

این نوارها به‌صورت نامحدود پایدار هستند.

با استفاده از حلقه پلاتینی، مقدار زیادی از سلول‌ها را روی بخشی از نوار بمالید.

سیم نیکروم می‌تواند واکنش مثبت کاذب ایجاد کند.

نتیجه را پس از ۱۰ ثانیه و نه بیشتر بخوانید.

تشکیل رنگ بنفش تیره نشان‌دهنده نتیجه مثبت است.

اگر هیچ رنگی ایجاد نشود، نتیجه منفی است. همچنین اگر رنگ بنفش پس از گذشت ۱۰ ثانیه ظاهر شود، نتیجه منفی در نظر گرفته می‌شود.

گونه‌های Pseudomonas اکسیداز مثبت هستند.

حدود قابل‌قبول آلودگی میکروبی در محصولات آرایشی

استانداردهای رایج و پذیرفته‌شده برای حدود میکروبی در محصولات آرایشی، به‌طور کلی مشخص می‌کنند که تعداد کل میکروارگانیسم‌ها در هر گرم یا میلی‌لیتر نباید از مقادیر زیر بیشتر باشد:

محصولات مورد استفاده در ناحیه چشم، غشاهای مخاطی و کودکان زیر ۳ سال

حداکثر:

1 × 10² CFU/g یا mL

سایر محصولات آرایشی موضعی

حداکثر:

1 × 10³ CFU/g یا mL

با این حال، تنها تعداد کل میکروارگانیسم‌ها برای ارزیابی وضعیت میکروبی محصول کافی نیست.

وجود عوامل بیماری‌زا نیز در ارزیابی محتوای میکروبی یک محصول آرایشی اهمیت زیادی دارد.

میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا یا فرصت‌طلبی که وجود آن‌ها نگرانی ویژه‌ای ایجاد می‌کند، عبارت‌اند از:

• Staphylococcus aureus
• Pseudomonas aeruginosa
• Escherichia coli
• Candida albicans

همچنین برخی میکروارگانیسم‌هایی که معمولاً غیر بیماری‌زا در نظر گرفته می‌شوند، در صورت ورود به بدن از مسیرهای خاص، مانند استفاده موضعی، ممکن است در شرایط دیگری به عوامل فرصت‌طلب و بیماری‌زا تبدیل شوند.

برای مثال، ورود این میکروارگانیسم‌ها به زخم‌ها یا استفاده از محصولات آرایشی به‌گونه‌ای که محصول وارد پوست یا از طریق آن عبور کند، می‌تواند شرایط متفاوتی ایجاد کند.

اثربخشی نگهدارنده‌های محصولات آرایشی، چرا نگهدارنده‌ها اهمیت دارند؟

دستورالعمل‌های فوق برای تفسیر نتایج، مربوط به محصولات آرایشی پیش از زمان مصرف هستند.

محصولات آرایشی حاوی نگهدارنده‌های ضدمیکروبی هستند.

بنابراین انتظار می‌رود این محصولات بتوانند در برابر مقدار مشخصی از آلودگی یا دستکاری میکروبی ناشی از مصرف‌کننده مقاومت کنند.

در گذشته، آزمون‌های اعتبارسنجی‌شده‌ای برای ارزیابی اثربخشی نگهدارنده‌ها در محصولات آرایشی وجود نداشت.

با این حال، آزمون اثربخشی نگهدارنده‌های دارویی در فارماکوپه ایالات متحده یا آزمون آرایشی ارائه‌شده در دستورالعمل‌های فنی انجمن CTFA مورد استفاده قرار می‌گرفت.

در ادامه، آزمون CTFA برای استفاده در محصولات آرایشی مایع توسط AOAC اعتبارسنجی شد.

همچنین روشی برای ارزیابی اثربخشی نگهدارنده‌ها در محصولات آرایشی جامد پیشنهاد شده است.

محصولات آرایشی موجود در کیت‌های آزمایش قابل‌استفاده مجدد، مانند کیت‌هایی که در فروشگاه‌های خرده‌فروشی عرضه می‌شوند، نیز می‌توانند با استفاده از آزمون سواب استریل، به‌صورت نیمه‌کمی از نظر میکروبیولوژیک ارزیابی شوند.

جمع‌بندی

آزمون میکروبی محصولات آرایشی مجموعه‌ای از مراحل به‌هم‌پیوسته است که از دریافت و آماده‌سازی صحیح نمونه آغاز می‌شود و تا شمارش، کشت غنی‌سازی و شناسایی میکروارگانیسم‌ها ادامه پیدا می‌کند.

انتخاب روش آماده‌سازی به ماهیت محصول بستگی دارد. محصولات مایع، جامد، پودری، کرمی، روغنی، آئروسل‌ها و دستمال‌های مرطوب، هرکدام به روش آماده‌سازی متناسب با ویژگی‌های خود نیاز دارند.

پس از آماده‌سازی، شمارش باکتری‌های هوازی، قارچ‌ها، مخمرها، کپک‌ها و در صورت نیاز میکروارگانیسم‌های بی‌هوازی انجام می‌شود. در کنار شمارش، مرحله غنی‌سازی نیز امکان شناسایی میکروارگانیسم‌هایی را فراهم می‌کند که ممکن است در کشت مستقیم قابل مشاهده نباشند.

در مرحله بعد، جدایه‌ها بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیک، رنگ‌آمیزی، آزمون‌های بیوشیمیایی و در صورت نیاز کیت‌های تجاری شناسایی می‌شوند. شناسایی میکروارگانیسم‌هایی مانند Staphylococcus aureus، Pseudomonas aeruginosa، Escherichia coli و Candida albicans اهمیت ویژه‌ای دارد.

در این میان، Pseudomonas aeruginosa به دلیل توانایی بقا در برخی محصولات آرایشی مورد استفاده در ناحیه چشم و ارتباط آن با عفونت‌های چشمی، توجه ویژه‌ای را می‌طلبد.

در نهایت، تفسیر نتایج تنها بر اساس تعداد کل میکروارگانیسم‌ها انجام نمی‌شود. وجود عوامل بیماری‌زا، نوع محصول، محل مصرف و توانایی سیستم نگهدارنده محصول در کنترل رشد میکروبی نیز اهمیت دارند.

بنابراین، اجرای دقیق و مرحله‌به‌مرحله آزمون میکروبی محصولات آرایشی می‌تواند اطلاعات مهمی درباره وضعیت میکروبی فرآورده و کیفیت آن ارائه دهد و به ارزیابی ایمنی میکروبی محصولات آرایشی کمک کند.

تاریخچه بازنگری

• ژوئیه ۲۰۲۴: بخش‌های3 و I به‌روزرسانی شدند.
• آوریل ۲۰۲۴: بخش‌های A، F و G برای اضافه‌شدن پروتکل تحلیل دستمال‌های مرطوب، شامل گزینه‌های Stomaching و Vortexing، به‌روزرسانی شدند.
• دسامبر ۲۰۲۱: بخش J بازنگری شد.
• ژوئیه ۲۰۲۱: شکل ۱ حذف شد. آزمون‌های بیوشیمیایی تأیید Pseudomonas aeruginosa به آرشیو منتقل شدند. همچنین اطلاعات تماس جدید برای جدایه‌های قارچی اضافه و برخی اصلاحات جزئی در نمایه‌سازی و نگارش برای افزایش وضوح انجام شد.
• نسخه اصلی این فصل به‌عنوان یک روش آرشیوی در دسترس است.
• ژوئیه ۲۰۱۷: بخش‌های H-1 و H-2 بازنگری شدند.
• ژانویه ۲۰۱۷: در بخش‌های H-1 و H-2، مقدار ۱ میلی‌لیتر اضافی از رقت ۱۰⁻¹ برای آزمایش در نظر گرفته شد.
• مه ۲۰۱۶: در بخش H-1، دامنه رقت از ۱۰⁻¹ تا ۱۰⁻⁶ به ۱۰⁻¹ تا ۱۰⁻³ تغییر یافت.
• مه ۲۰۱۶: در بخش H-4، کل بخش «آزمون غربالگری برای تعیین تعداد کل میکروارگانیسم‌ها» حذف شد.
• مه ۲۰۱۶: بخش شناسایی میکروارگانیسم‌ها به‌روزرسانی شد. در صورت جداسازی باسیل‌های شبه-Bacillus از پلیت‌های هوازی، شناسایی آن‌ها در نظر گرفته شد.
• اوت ۲۰۰۱: بخش D بازنگری و مرجع 2b اضافه شد.
• اوت ۲۰۰۱: فرمولاسیون M79 اصلاح شد.

برای مشاهده فصل‌های دیگر BAM به FDA.gov مراجعه کنید.