رنگ آمیزی زیل نلسون

مایکوباکتریوم‌ها ^[۱] باکتری‌های هوادوست و باسیلی شکل هستند که به‌راحتی رنگ نمی‌گیرند اما زمانیکه رنگ گرفتند در برابر از دست دادن رنگ خود به‌وسیله اسید یا الکل مقاومت می‌کنند، بنابراین باسیل‌های مقاوم به اسید یا اسیدفست نامیده می‌شوند. روش رنگ‌آمیزی زیل نلسون ^[۲] تکنیکی است که جهت رنگ آمیزی گونه‌های مایکوباکتریوم از جمله مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ^[۳]، مایکوباکتریوم اولسرانس ^[۴] و مایکوباکتریوم لپره ^[۵] استفاده می‌شود.

 در این مطلب قصد داریم تا شما را با تکنیک رنگ‌آمیزی زیل نلسون، مواد و محلول‌های مورد استفاده در این روش و همچنین نحوه بررسی نتایج حاصل از آن آشنا کنیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

۱. آشنایی با تکنیک رنگ‌آمیزی زیل نلسون

روش رنگ آمیزی زیل نلسون یک روش رنگ آمیزی افتراقی است که ابتدا توسط شخصی به نام Ziehl ساخته شد و بعدا توسط فردی به نام Neelsen اصلاح گردید. از این رو این تکنیک را با نام زیل نلسون می‌شناسند.

مایکوباکتریوم، اکتینومایسس (Actinomycetes)، نوکاردیا (Norcadia)، ایزوسپورا (Isospora)، کریپتوسپوریدیوم (Cryptosporidium) و برخی قارچ‌ها دارای دیواره سلولی ضخیمی هستند که از کمپلکس‌های لیپوئیدی ^[۶] به نام اسید مایکولیک ^[۷] تشکیل شده‌اند. اسید مایکولیک باعث می‌شود تا  دیواره سلولی، مومی، آبگریز و نفوذ ناپذیر شود. به همین دلیل رنگ آمیزی اسید مایکولیک دشوار است.

در تکنیک رنگ‌آمیزی زیل نلسون از فوشین بازی (basic fuchsin) و فنول (phenol) برای رنگ‌آمیزی دیواره سلولی گونه‌های مایکوباکتریوم استفاده می‌شود. همانطور که گفته شد مایكوباكتریوم به راحتی رنگ نمی‌گیرد. بنابراین استفاده از گرما همراه با كربول فوشین و فنول باعث نفوذ رنگ به دیواره سلول باكتری خواهد شد. کربول فوشین که خاصیت بازی دارد به اجزای منفی باکتری‌ها متصل می‌شود که شامل اسید مایکولیک و دیواره سلول لیپیدی است.

از کاربردهای روش رنگ‌آمیزی زیل نلسون می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

• شناسایی و تشخیص گونه‌های مایکوباکتریوم از جمله مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ^[۸] و مایکوباکتریوم لپرا ^[۹]
• افتراق باسیل‌های اسید فست و غیر اسید فست
• شناسایی برخی از گونه های قارچ مانند کریپتوسپوریدیوم ^[۱۰]

توجه: رنگ‌آمیزی مایکوباکتریم‌ها را می‌توان به 2 صورت زیر انجام داد.

۱. روش زیل نلسون داغ: در این روش رنگ فنول-کربول فوشین گرم می‌شود تا رنگ بتواند به دیواره سلول مایکوباکتریوم مومی نفوذ کند.

۲. روش سرد: در این تکنیک که به رنگ‌آمیزی کانیون (Kinyoun Method) نیز معروف است، رنگ گرم نمی‌شود بلکه با افزایش غلظت فوشین و فنول بازی و استفاده از یك ماده شیمیایی، نفوذ رنگ به دیواره سلولی حاصل خواهد شد.

۲. نمونه مورد نیاز

از آنجایی که در طول شب، ترشحات (به عنوان مثال خلط) انباشته می‌شوند، نمونه‌‌ای که در صبح جمع‌آوری شود ارجحیت دارد.

برای آماده‌سازی لام نیز ممکن است اسمیر به دو صورت تهیه شود:

۱. اسمیر مستقیم (Direct Smear): اسمیر قبل از پردازش مستقیماً از نمونه بیمار تهیه می‌شود.

۲. اسمیر غیرمستقیم (Indirect Smear): اسمیر از یک نمونه‌ی پردازش شده پس از سانتریفیوژ کردن تهیه شده است.

۳. مواد و محلول‌های مورد استفاده

۱-۳. کربول فوشین

• آب مقطر …………………………………………… ۱۰۰ میلی‌لیتر
• فوشین بازی ……………………………………….. ۱ گرم
• الکل اتیل (اتانول۱۰۰٪) ………………….. ۱۰ میلی‌لیتر
• فنول کریستال…………………………………… ۵ میلی‌لیتر

۲-۳. اسید الکل (هیدروکلریک اسید 3٪ در اتیل الکل ۹۵ ٪)

• اتیل الکل ……………………………………… ۹۵ میلی لیتر
• آب مقطر……………………………………….. ۲ میلی لیتر
• هیدروکلریک اسید غلیظ ……………… ۳ میلی لیتر

از اسید الکل جهت رنگ‌زدایی استفاده می‌شود. به جای آن می‌توان از اسید سولفوریک ۲۰٪  نیز استفاده کرد.

۳-۳. متیلن بلو  ۰/۲۵٪ در  اسید استیک ۱٪

• متیلن بلو …………………………. ۰/۲۵ گرم
• آب مقطر …………………………… ۹۹ میلی لیتر
• اسید استیک ……………………… ۱ میلی لیتر

می‌توان مالاشیت گرین (۵ گرم در لیتر) را جایگزین متیلن بلو کرد.

۴. مراحل رنگ‌آمیزی به روش زیل نلسون

• ابتدا اسمیری از کشت نمونه را روی یک لام میکروسکوپ تمیز و استریل قرار دهید.

• کربول فوشین را روی اسمیر بریزید به‌طوری که کاملا اسمیر را پوشش دهد. در این مرحله و برای رنگ گرفتن ارگانیسم لازم است تا کربول فوشین را حرارت دهید. به این منظور ابتدا یک پنبه را به الکل آغشته کرده و آن را شعله ور کنید. پنبه را زیر لام گرفته و لام را به آرامی حرارت دهید تا بخار ایجاد شود. هنگام ایجاد بخار پنبه را از زیر لام بردارید. با قطع شدن بخار، مجددا پنبه را زیر لام قرار دهید. این کار را به مدت ۵ دقیقه انجام دهید. توجه داشته باشید که از حرارت دادن بیش از حد لام خودداری کنید و مراقب باشید رنگ نجوشد.

• پس از گذشت ۵ دقیقه، لام را به آرامی با آب شیر بشویید.
• اسید سولفوریک ۲۰٪ را روی لام بریزید و ۱ الی ۲ دقیقه صبر کنید. این مرحله را تکرار کنید تا جایی که اسمیر صورتی شود.
• اسید را با آب بشویید.
• متیلن بلو را روی لام بریزید به‌طوری که کاملا اسمیر را بپوشاند. پس از گذشت ۲ الی ۳ دقیقه لام را با آب بشویید.
• اجازه دهید لام در دمای اتاق خشک شود و سپس آن‌را به کمک عدسی ایمرسیون بررسی کنید.

۵. بررسی نتایج رنگ‌آمیزی زیل نلسون

• باکتری‌های اسید فست………..صورتی
• باکتری‌های غیر اسیدفست……..آبی

۶. جمع‌بندی

همانطور که در قسمت‌های قبلی نیز به آن اشاره شد، روش رنگ‌آمیزی زیل نلسون یکی از تکنیک‌های بسیار کاربردی در  آزمایشگاه‌های هیستوپاتولوژی است که جهت بررسی و تشخیص ارگانیسم‌هایی به کار می‌رود که با استفاده از تکنیک‌هایی مانند رنگ‌آمیزی گرم، قابل تشخیص نیستند. مایکوباکتریم‌ها از این قبیل میکروارگانیسم‌ها هستند.

لازم به ذکر است که برای رنگ آمیزی اسید فست دو روش وجود دارد:

۱. روش‌های کربول فوشین که شامل تکنیک زیل نلسون و کانیون است.

۲. روش فلوروکروم با استفاده از رنگ‌های O- اورامین (auramine-O) یا اورامین-رودامین (auramine-rhodamine)

در این مطلب سعی کردیم تا شما را با روش رنگ‌آمیزی زیل نلسون آشنا کنیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.

واژه‌نامه