رنگ آمیزی پرشین بلو
پرشین بلو (آبی پروس) یکی از رنگ‌های رایجی است که امروزه برای رنگ‌آمیزی بافت مورد استفاده قرار می‌گیرد. در واقع این رنگ اولین رنگ مصنوعی بود که در طول انقلاب صنعتی کشف شد.
این ماده به طور تصادفی در سال 1704 توسط یک شیمی‌دان که قصد ساخت رنگ دیگری را داشت، کشف شد اما تا سال 1867 که فرمول اصلی این رنگ توسط پاتولوژیست آلمانی به نام مکس پرل [1] بیان شد، به عنوان یک رنگ هیستوشیمیایی مورد استفاده قرار نمی‌گرفت. به همین دلیل است که این رنگ اغلب با نام پرل پرشین بلو شناخته می‌شود.
این رنگ برای نمایش دادن آهن موجود در بافت‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. روش‌های مختلفی برای رنگ‌آمیزی با پرشین بلو وجود دارد. یکی از روش‌های رایج رنگ‌آمیزی با این رنگ، روش گوموری است. محلول‌های پتاسیم فروسیانید و اسید کلریدریک که در این روش استفاده می‌شوند بسیار قوی‌تر از محلول‌های استفاده شده در روش پرل است. اما در بیشتر متون موجود در شاخه هیستولوژی روش پرل آورده شده است و همچنین نسبت به روش‌های دیگر مقرون به صرفه است. به همین دلیل برآن شدیم تا در این مقاله رنگ‌آمیزی بافت به روش پرل را مورد بررسی قرار دهیم پس با ما همراه باشید تا با مواد مورد نیاز، مراحل رنگ‌آمیزی و نتایج به دست آمده از رنگ‌آمیزی پرل بیشتر آشنا شوید.
رنگ‌آمیزی با پرشین بلو (PB) جزو رنگ‌‌آمیزی‌های خاص به شمار نمی‌رود بلکه یک واکنش هیستوشیمیایی است.
در چه مواردی از پرشین بلو برای رنگ‌آمیزی استفاده می‌شود؟
پروتکل‌های مختلفی برای رنگ‌آمیزی با رنگ پرشین بلو وجود دارد اما همه این پروتکل‌ها دارای یک هدف مشخص هستند. به طور کلی برای نمایش دادن آهن موجود در بافت‌ها از این رنگ استفاده می‌شود.
این رنگ در طیف گسترده‌ای از آزمایشات با اهداف تحقیقاتی و تشخیصی استفاده می‌شود. به عنوان مثال در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی رنگ پرشین بلو (PB) کاربرد بسیاری دارد. پاتولوژیست‌ها برای تشخیص وجود آهن در نمونه‌های برداشته شده از مغز استخوان و طحال از این رنگ استفاده می‌کنند. این روش به ویژه برای ارزیابی بیماران مبتلا به بیماری‌های پاتولوژیکی که دارای رسوبات هموسیدرین هستند، بسیار مفید خواهد بود. احتمال وجود این رسوبات در بیماری‌های ذکر شده در زیر وجود دارد:
- کم‌خونی همولیتیک
- هموکروماتوز (که ممکن است در آن مقدار آهن تشکیل شده در اندام‌ها بیش از حد مجاز باشد.)
- برخی بیماری‌های کبدی
- ریه‌های بیماران مبتلا به نارسایی احتقانی قلب
به همین دلیل محققانی که مطالعه و بررسی‌هایی روی این بیماری‌ها انجام می‌دهند، ممکن است به دفعات از این رنگ برای رنگ‌آمیزی قطعات بافت برش داده شده استفاده کنند تا وجود آهن در بافت‌های مورد نظر را تشخیص دهند.
همچنین در مواردی که یک لکه قهوه‌ای در بخشی از یک بافت مشاهده شود و نیاز به شناسایی آن باشد نیز ممکن است از این رنگ استفاده شود.
در واکنش پرشین بلو چه اتفاقی می‌افتد؟
رنگ‌آمیزی با پرشین بلو شامل سه مرحله کلی است:
مرحله اول: برش‌های بافت با اسیدکلریدریک موجود، پروتئین‌های متصل به مولکول‌های هموسیدرین را از بین می‌برند و در نهایت باعث می‌شود یون‌های آهن یا فریک (+3) آزاد شوند.
هموسیدرین یک ماده رنگی به شکل گرانول است که آهن را در خود ذخیره می‌کند. این ماده از تجزیه هموگلوبین به وجود می‌آید و از آهن و پروتئین تشکیل شده است و ممکن است در شرایط پاتولوژیک خاصی مانند هموکروماتوز در بافت‌ها وجود داشته باشد.
این ماده‌ی زرد-قهوه‌ای در آب و مواد قلیایی محلول نیست. این درحالی است که حتی بعد از فیکس شدن نیز در اسید حل می‌شود.
مرحله دوم: در این مرحله یون‌های فریک با محلول پتاسیم فروسیانید مخلوط می‌شوند و فریک فروسیانید –یک ماده رنگی نامحلول با رنگ آبی روشن- را تشکیل می‌دهند.
فریک فروسیانید همان رنگ پرشین بلو یا آبی پروس است. اسیدکلریدریک و فروسیانید پتاسیم را می‌توانید به صورت محلول‌های جداگانه و یا به صورت یک محلول ترکیبی از بازار تهیه کنید.
مرحله سوم: در صورت نیاز در واکنش پرشین بلو (PB) می‌توان از رنگ‌های مخالف یا counterstain های قرمز مانند نوترال‌رد (neutral red) یا سافرانین‌او (safranin O) استفاده کرد. پس از طی مراحل ذکر شده، نتیجه رنگ‌آمیزی به گونه‌ای است که آهن موجود در بافت به رنگ آبی یا بنفش مشاهده می‌شود. اجزای دیگر بافت مانند هسته و سیتوپلاسم به رنگ قرمز مشاهده می‌شوند که این موضوع به دلیل اضافه کردن رنگ مخالفِ قرمز (Red counterstain) به نمونه است.
مواد مورد استفاده در رنگ‌آمیزی پرشین بلو به روش پرل:
| مواد مورد نیاز | توضیحات |
| فیکساتیو بافر فرمالین خنثی (%۱۰) | – |
| بلوک‌های بافت پارافینی ۵ میکرومتری | برای این رنگ‌آمیزی لازم است نمونه بافت قالب‌گیری شده با پارافین را در ابعاد ۵ میکرومتر برش دهید. |
| محلول اسید کلریدریک (%۲) | ۲ میلی‌لیتر اسید کلریدریک غلیظ + ۹۸ میلی‌لیتر آب مقطر |
| تریتون-X-ء۱۰۰ (%۱۰) | ۱۰ میلی‌لیتر تریتون-X-ء۱۰۰ + ۹۰ میلی‌لیتر آب مقطر |
| تیمول | چند دانه تیمول برای جلوگیری از رشد قارچ |
| محلول پتاسیم فروسیانید (٪۱) | ۱ گرم پتاسیم فروسیانید + ۹۸ میلی‌لیتر آب مقطر + ۲ میلی‌لیتر تریتون-X-ء۱۰۰ (٪۱۰) |
| محلول هیدروکلریک اسید-پتاسیم فروسیانید | ۲۰ میلی‌لیتر هیدروکلریک اسید (٪۲) + ۲۰ میلی‌لیتر پتاسیم فروسیانید (٪۱)
*این محلول را درست قبل از رنگ‌آمیزی آماده کنید و پس از استفاده آن را دور بریزید. |
| محلول نوکلئار فست رد (Kernechtrot) | ۰/۱ گرم نوکلئار فست رد را به کمک گرما در ۱۰۰ میلی‌لیتر محلول سولفات آلومینیوم ٪۵ حل کنید. محلول را خنک کنید و سپس آن را فیلتر کنید.
در آخر چند دانه تیمول به عنوان ماده نگهدارنده به آن اضافه کنید. |
*دلیل اضافه کردن تریتون-X-ء۱۰۰، ثبات محلول اسید کلریدریک-پتاسیم فروسیانید است. در صورت حذف این ماده محلول تمایل به تجزیه دارد و در نتیجه رسوب آبی رنگ مناسبی ایجاد نمی‌کند.
مراحل رنگ‌آمیزی
*برای انجام این رنگ‌آمیزی از لام‌های positive control استفاده کنید.
۱- پارافین‌زدایی کنید و با آب مقطر هیدراسیون را انجام دهید.
۲- لام‌ها را به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق در محلول اسید کلریدریک-پتاسیم فروسیانید قرار دهید.
۳- لام‌ها را ۵ مرتبه با آب مقطر بشوید.
۴- لام‌ها را به مدت ۳ دقیقه درون محلول نوکلئار فست رد قرار دهید.
۵- مجددا ۳ مرتبه آن‌ها را با آب مقطر بشویید.
۶- دهیدراسیون را در الکل‌هایی با خلوص مختلف انجام دهید.
۷- لام‌ها را ۳ یا ۴ مرتبه با زایلن تمیز کنید.
۸- لام را با رزین مصنوعی آغشته کنید.
نتایج به دست آمده از رنگ‌آمیزی
| بخش سلول/ ماده مورد نظر | رنگ مشاهده شده |
| آهن فریک | آبی روشن |
| هسته | قرمز |
| سیتوپلاسم | صورتی |
نمونه‌های دیگری از نتایج مشاهده شده از رنگ‌آمیزی پرشین بلو زیر میکروسکوپ که نوروپاتی واسکولیتیک را نشان می‌دهد:
“تشخیص قطعی” واسکولیت
سندروم چرگ اشتراوس با واسکولیت نکروزان شامل رگ مغزی بزرگ (v) با نفوذ transmural دیواره با ائوزینوفیل‌ها
“تشخیص قطعی” واسکولیت
عروق نشان‌دهنده نکروز و التهاب فیبرینوئید فعال که فاقد حضور هموسیدرین هستند.
رسوبات هموسیدرین در اطراف اسکلروتیک مشاهده شد.
“تشخیص احتمالی” واسکولیت
(v) التهاب دور عروق با اسکلروز عروق کوچک اپی‌نوریال را نشان می‌دهد.
عروق recanalize شده در اپی‌نوریوم
“تشخیص احتمالی” واسکولیت
تنگی مجرا همراه با recanalization
واژه‌نامه
| Max Perls | [۲] | Prussian Blue | [۱] |
