تکنیک رنگ‌آمیزی ورهوف

تکنیک رنگ‌آمیزی ورهوف (Verhoeff) که به عنوان تکنیک Verhoeff-van Gieson نیز شناخته می‌شود، یک روش رنگ آمیزی در آزمایشگاه‌های هیستوپاتولوژی است که توسط شخصی به نام فردریک هرمان ورهوف^[1] در سال 1908 ایجاد شد. از این تکنیک برای رنگ‌آمیزی نمونه بافت‌‌های غضروف کشسان (الاستیک)، ریه‌ها، پوست، مثانه و برخی رباط‌ها استفاده می‌شود.

در این مطلب قصد داریم به بررسی این تکنیک رنگ‌امیزی و مواد و محلول‌های مورد استفاده در آن بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

چرا برای رنگ‌آمیزی بافت الاستیک از تکنیک ورهوف استفاده می‌شود؟

برای پاسخ به این سوال ابتدا باید مروری بر رنگ‌های روتین و خاص در آزمایشگاه داشته باشیم.

در آزمایشگاه‌های هیستوپاتولوژی، اصطلاح “رنگ آمیزی روتین” به رنگ هماتوکسیلین و ائوزین (H&E)  اطلاق می‌شود که به طور “روتین” برای آشکارسازی ساختار یک بافت در اکثر نمونه‌های بافتی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

در مقابل رنگ‌های خاص به دسته‌ای از رنگ‌های آزمایشگاهی گفته می‌شود که به کمک آن‌ها می‌توان گروه خاصی از ارگانیسم‌ها یا نمونه‌های بافت را بررسی کرد. این رنگ‌ها اغلب زمانی مورد استفاده قرار می‌گیرند که تکنیک رنگ‌آمیزی H&E تمام اطلاعات مورد نیاز آسیب‌شناس یا محقق را فراهم نکند.

بررسی الاستین (Elastin) یکی از این موارد خاص است. الاستین پروتئینی است که فیبرهای الاستیک موجود در بافت همبند را می‌سازد. فیبر الاستین به واسطه‌ی آنزیمی به نام لیزیل اکسیداز ^[2] به‌هم متصل می‌شوند و یک ماتریس الاستین منشعب و سه بعدی ایجاد می‌کنند که به انعطاف‌پذیری بافت کمک می‌کند. الاستین معمولاً در پوست و دیواره رگ‌های خونی یافت می‌شود و این توانایی را دارد که پس از کشش، مجدد به حالت اولیه خود باز گردد. بررسی الاستین با استفاده از رنگ‌آمیزی هماتوکسلین- ائوزین کار چندان راحتی نیست. بنابراین نیاز به رنگ‌آمیزی خاص دارد. آسیب شناسان ممکن است برای تشخیص سندرم مارفان، آمفیزم و آرتریت سلولی غول آسا (غول پیکر) فیبر الاستیک را مورد بررسی قرار دهند. یکی از رنگ‌های خاصی که برای رنگ آمیزی و بررسی فیبر الاستیک مورد استفاده قرار می‌گیرد، تکنیک رنگ‌آمیزی ورهوف است. اگرچه رنگ‌های خاص مختلفی برای شناسایی الیاف الاستیک وجود دارد (به عنوان مثال آلدهید فوشین ^[3])، اما رنگ‌آمیزی ورهوف بیشتر مورد استفاده قرار می‌گیرد زیرا سریع است و باعث ایجاد تمایز شدید الیاف الاستیک می‌شود.

مواد و محلول‌های مورد استفاده در تکنیک رنگ‌آمیزی ورهوف

در ادامه این مطلب به بررسی مواد و محلول‌های مورد استفاده در رنگ‌آمیزی ورهوف و نحوه آماده‌سازی آن‌ها خواهیم پرداخت.

۱. فیکساتیو:

بافر فرمالین خنثی 10%.

۲. نمونه:

قطعات پارافین‌گیری شده که به ضخامت 5 میکرومتر برش خورده‌اند.

۳. هماتوکسیلین الکلی5%

کریستال‌های هماتوکسیلین (C.I. 75290)ء ———————- 5.0 گرم

الکل 80%——————————————————–100.0 میلی‌لیتر

۴. کلرید آهن10٪

کلرید آهن(FeCl3 ∙ 6H20)  ———————————-  10.0 گرم

آب مقطر ——————————————————–100.0 میلی‌لیتر

۵. محلول ید لوگول

یدید پتاسیم —————————————————–4.0 گرم

ید —————————————————————- 2.0 گرم

آب مقطر ———————————————————100.0 میلی‌لیتر

نحوه آماده‌سازی: یدید پتاسیم را کمی در آب مقطر حل کرده و سپس ید را اضافه نمایید و حل کنید. در نهایت باقی مانده آب مقطر را اضافه کنید.

۶. محلول رنگ آمیزی ورهوف

هماتوکسیلین الکلی  5%—————————————-20.0 میلی‌لیتر

کلرید آهن 10% ———————————————–10.0 میلی‌لیتر

ید لوگول ——————————————————10.0 میلی‌لیتر

۷. کلرید آهن2٪

کلرید آهن 10%(FeCl3 ∙ 6H20)  —————————  10.0 گرم

آب مقطر —————————————————–40.0 میلی‌لیتر

۸. لکه ون گیسون

اسید فوشین  (C.I. 42685)ء ———————————–  0.1 گرم

اسید پیکریک اشباع (تقریباً 1.4٪) ————————–  100.0 میلی‌لیتر

مراحل رنگ‌آمیزی ورهوف

تکنیک رنگ‌آمیزی ورهوف دو مرحله اصلی دارد:

• بخش رنگ آمیزی ورهوف: در این مرحله یک رنگ حاوی آهن و هماتوکسیلین که مخصوص الیاف الاستیک است، با الاستین پیوندهای قوی ایجاد می‌کند.
• بخش رنگ آمیزی ون گیسون: در این مرحله لام با استفاده از ضد لکه‌ای که مخصوص کلاژن است، رنگ‌آمیزی می‌شود. به مراحل رنگ‌آمیزی ورهوف که در ادامه ذکر شده است توجه کنید:

۱. پارافین‌زدایی و هیدراسیون بافت را انجام دهید.

۲. لام را به مدت 10 دقیقه در محلول رنگ آمیزی ورهوف قرار دهید. پس از گذشت 10 دقیقه ابتدا لام را برای چند ثانیه زیر شیر آب نگه دارید و سپس دو مرتبه در آب مقطر فرو برده و خارج کنید.

۳. جهت ایجاد تمایز، لام را به مدت 15 ثانیه در کلرید آهن 2% قرار دهید و مجددا آن را دو مرتبه در جار حاوی آب مقطر فرو برده و خارج کنید.

۴. فیبر الاستیک را زیر میکروسکوپ بررسی کنید. در این مرحله باید فیبرهای سیاه با پس‌زمینه خاکستری مشاهده کنید. در غیر این صورت مرحله 3 را مجدد تکرار کنید.

۵. لام را به مدت 1 دقیقه در محلول ون گیسون قرار دهید. اما اجازه ندهید لام درون محلول باقی بماند. بلکه به حالت ضربه‌ای لام را درون جار رنگ‌آمیزی حاوی محلول ون گیسون حرکت دهید.

۶. بافتِ روی لام را با درجات مختلف الکل دهیدراته کرده و شفاف‌سازی با زایلن را انجام دهید.

۷. در نهایت لامل را به کمک رزین مصنوعی روی لام قرار داده و نتایج را زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.

نتایج رنگ‌آمیزی فیبر الاستیک با تکنیک ورهوف

فیبر الاستیک——————-  مشکی

هسته ————————–  آبی متمایل به مشکی

کلاژن ————————–  قرمز

سایر عناصر بافت—————-  زرد

چه کسانی از تکنیک رنگ‌آمیزی ورهوف استفاده می‌کنند؟

رنگ‌آمیزی ورهوف به طور گسترده هم برای اهداف تشخیصی و هم برای اهداف تحقیقاتی کاربرد دارد.

در آزمایشگاه‌های تشخیصی، تکنیک ورهوف برای شناسایی وجود یا عدم وجود الیاف الاستیک در بافت‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.

به عنوان مثال، پاتولوژیست ممکن است از این تکنیک برای بررسی میزان از بین رفتن بافت الاستیک در ریه بیماران مبتلا به آمفیزم استفاده کند و یا از رنگ آمیزی ورهوف جهت بررسی نازک شدن فیبر الاستیک در عروق خونی بیماران مبتلا به تصلب شرایین بهره ببرد.

محققان نیز ممکن است در پروژه‌های تحقیقاتی خود روی بیماری‌های مختلف از رنگ‌آمیزی ورهوف برای تمایز بافت همبند در نمونه‌ استفاده کنند.

ما در این مطلب سعی کردیم تا شما را با تکنیک رنگ‌آمیزی ورهوف، مواد به کار رفته در آن و نتایج حاصل از این رنگ‌آمیزی آشنا کنیم.

شما چگونه از رنگ آمیزی ورهوف در آزمایشگاه خود استفاده می‌کنید؟

واژه نامه