رنگ آمیزی تریکروم مدفوع
رنگ آمیزی تریکروم مدفوع یکی از مؤثرترین روش‌های بررسی مدفوع برای تشخیص انگلهای تک یاخته‌ای روده و تخم کرم‌ها است.
برای تشخیص بهینه و مطالعه دقیق ساختار داخلی کیست‌های تک یاخته‌ای و برخی از تخم‌های کرمی، مراحل رنگ‌آمیزی ضروری است. رنگ آمیزی تریکروم از آن دسته تکنیک‌هایی است که کاربرد زیادی در این زمینه دارد. به همین دلیل در این مطلب قصد داریم به بررسی روش رنگ آمیزی تریکروم مدفوع بپردازیم.
رنگ آمیزی تریکروم مدفوع
تروفوزوئیت شکلی فعال از انگل است. تروفوزوئیت، برخلاف کیست توان مقابله با شرایط را ندارد. این شکل از انگل خارج از بدن میزبان می‌میرد.
به طور کلی مشخص شده است که فیلم‌های مدفوع رنگ آمیزی شده (stained fecal films) مؤثرترین وسیله برای بررسی مدفوع و تک یاختههای روده‌ای هستند. اسمیر رنگ‌آمیزی دائمی، تشخیص و شناسایی کیست‌ها و تروفوزوئیت‌ها (Trophozoite) را تسهیل می‌کند. همچنین تک یاختههای کوچکی که ممکن است در اسمیر غلیظ دیده نشوند، اغلب روی اسمیر رنگ‌آمیزی شده قابل مشاهده هستند.
رنگ آمیزی تریکروم به طور گسترده در آزمایشگاه‌های انگل‌شناسی بالینی استفاده می‌شود. این رنگ، ترکیبات ساده‌ای دارد. همچنین چنانچه مدفوع تازه باشد و یا با موادی مانند پلی وینیل الکل (PVA) نگهداری شده باشد، بازهم نتایج خوبی حاصل می‌گردد. به همین دلیل رنگ آمیزی تریکروم مدفوع یک روش موثر برای بررسی انگلهای روده‌ای به شمار می‌آید.
در رنگ آمیزی تریکروم مدفوع اغلب از دو نوع زیر استفاده می‌شود:
- رنگ آهن هماتوکسیلین (iron hematoxylin)
- رنگ گوموری اصلاح شده (Wheatley’s)
تکنیک Wheatley’s، در واقع اصلاح شده‌ی روش گوموری است که در رنگ آمیزی بافت کاربرد دارد. این تکنیک ساده و در عین حال سریع است و اسمیرهای یکنواختی را از تک یاختههای روده، سلول‌های انسانی و مخمرها ایجاد می‌کند. در ادامه به بررسی روش رنگ‌آمیزی تریکروم مدفوع خواهیم پرداخت.
تکنیک Wheatley’s – مواد و محلول‌ها
رنگ آمیزی گوموری برای اولین بار توسط فردی به نام Gomori برای رنگ آمیزی مقاطع بافتی و اسمیرهای سیتولوژیکی ایجاد شد. در سال 1951، فردی به نام ویتلی (Wheatley) با اضافه کردن مراحل تثبیت و دهیدراسیون، تکنیک Gomori را اصلاح کرد. تکنیک Wheatley ، منجر به رنگ آمیزی ساده و سریع برای آمیب‌ها و تک‌یاخته‌های روده شد و آن را یک رنگ مناسب برای رنگ آمیزی تریکروم مدفوع کرد.
مواد و محلول‌های مورد استفاده در این تکنیک در جدول 1 ذکر شده است.
جدول 1.تکنیک Wheatley – مواد و محلول‌ها
| معرف‌ها | Materials | مقدار |
| کروموتروپ 2R | Chromotrope 2R | 0.6 g |
| سبز روشن SF | Light green SF | 0.3 g |
| اسید فسفوتنگستیک | Phosphotungstic acid | 0.7 g |
| اسید استیک (گلاسیال) | Acetic acid (glacial) | 1.0 mL |
| آب مقطر | Distilled water | 100 mL |
نحوه آماده سازی محلول رنگ آمیزی تریکروم مدفوع
برای آماده‌سازی محلول رنگ آمیزی، به روش زیر عمل کنید:
- 1 میلی لیتر اسید استیک را به اجزای خشک اضافه کنید.
- اجازه دهید مخلوط به مدت 15 تا 30 دقیقه در دمای اتاق بماند. سپس آب مقطر را به آن اضافه کنید. محلول آماده شده باید بنفش به نظر برسد.
لازم به ذکر است که این محلول را می‌توان به صورت تجاری نیز خریداری کرد.
رنگ آمیزی تریکروم مدفوع مستلزم استفاده از محلول ید-الکل نیز هست. برای آماده سازی این محلول به روش زیر عمل کنید:
- کریستال‌های ید را به الکل 70 درصد اضافه کنید تا مایعی تیره و غلیظ به دست آید.
- زمان استفاده، مقدار مورد نظر از این مایع غلیظ را با الکل 70 درصد رقیق کنید.
مراحل رنگ آمیزی تریکروم مدفوع
مراحل رنگ آمیزی تریکروم مدفوع شامل دو مرحله اصلی است.
الف: آماده کردن اسمیر ب : رنگ آمیزی اسمیر
توجه داشته باشید که حتما از لوازم حفاظت فردی مانند دستکش و ماسک استفاده کنید.
الف. آماده سازی اسمیر
آماده سازی اسمیر مدفوع ممکن است به روش‌های مختلفی اجام شد. زیرا یا مدفوع تازه است یا قبلا جمع‌آوری شده و به مواد نگهدارنده آغشته شده است.
بخش 1- چنانچه مدفوع تازه است:
بخش کوچکی از نمونه را بردارید. با استفاده از یک اپلیکاتور یا براش، دو اسمیر را روی یک لام میکروسکوپ تمیز آماده کنید.
بلافاصله اسمیرها را در فیکساتور Schaudinn غوطه‌ور کنید و اجازه دهید حداقل 30 دقیقه در این فیکساتیو بمانند. البته تثبیت به مدت یک شب ارجحیت دارد.
اگر نمونه مایع است، چند قطره از مدفوع را با سه یا چهار قطره PVA روی یک لام شیشه‌ای مخلوط کنید. اجازه دهید لام چند ساعت در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی‌گراد بماند تا خشک شود.
بخش 2-چنانچه مدفوع به مواد نگهدارنده آغشته است:
اگر نمونه در PVA است، مقداری از مخلوط‌ها را روی یک حوله کاغذی بریزید تا PVA جذب شود. سپس اسمیر را همانطور که در بخش 1 توضیح داده شد، روی لام میکروسکوپ آماده کنید.
ب. روش رنگ آمیزی
- پس از اینکه اسمیرها به درستی ثابت و خشک شدند، لام ها را به مدت 3 دقیقه در اتیل الکل 70 درصد قرار دهید.
- سپس لام‌ها را به مدت 2 تا 5 دقیقه در محلول ید-الکل قرار دهید.
- سپس لام را با دو مرتبه با الکل 70 درصد شست شو دهید. یکبار به مدت 5 دقیقه و بار دوم به مدت 2 تا 5 دقیقه.
- لام را به مدت 10 دقیقه در محلول رنگ آمیزی تری کروم قرار دهید.
- پس از گذشت 10 دقیقه، لام را به مدت 5 ثانیه در اتیل الکل 90 درصد اسیدی شده قرار دهید.
- اسلایدها را چندین بار در اتانول 100% فرو کنید.
- سپس دو مرتبه در اتیل الکل 100% فرو ببرید.
- مرحل شفاف سازی با استفاده از زایلین را انجام داده و لامل را روی لام قرار دهید.
- رنگ آمیزی تریکروم مدفوع بهتر است با استفاده از روغن ایمرسیون زیر میکروسکوپ بررسی شود.
کنترل کیفیت
توصیه می‌شود حین رنگ آمیزی تریکروم مدفوع از یک لام کنترلی استفاده شود. این لام می‌تواند حاوی تک یاختههای شناخته شده مانند گونه‌های Giardia باشد.
بررسی نتایج رنگ آمیزی تریکروم مدفوع
در اسمیرهایی که به درستی تثبیت و رنگ آمیزی شده‌اند، سیتوپلاسم تروفوزوئیت‌های تک یاخته‌ای سبز یا آبی دیده می‌شود. هسته و اجسام کروماتوئید، گلبول‌های قرمز و باکتری‌ها نیز اغلب به رنگ بنفش رنگ آمیزی می‌شوند.
توضیحات کلی
اگر نمونه‌ها به طور نامناسب تثبیت شوند، ارگانیسم‌های تک یاخته‌ای ممکن است رنگ قرمز کثیف یا کدر (CLOUDY) به خود بگیرند.
حذف ناقص کلرید جیوه (تثبیت کننده Schaudinn) ممکن است منجر به رسوب گرانول‌های انکساری شود که در تشخیص اشکال انگلی اختلال ایجاد می‌کند. حتما محلول اتانول-ید ۷۰ درصد را به طور مرتب عوض کنید تا این اتفاق نیفتد.
اسمیرهای بیش از حد سبز ممکن است نشان دهنده حذف ناکافی ید باشند. طولانی شدن زمان شستشو در الکل 70 درصد و تعویض مکرر محلول، ممکن است این مشکل را کاهش دهد.
جمع‌بندی
رنگ آمیزی تریکروم مدفوع یک روش رایج و کاربردی در آزمایشگاه‌های انگل‌شناسی است. در این روش معمولا از تکنیک اصلاح شده گوموری استفاده می‌شود. رنگ آمیزی تریکروم می‌تواند به بررسی انگلهای تک‌یاخته‌ای موجود در مدفوع بپردازد، علی الخصوص زمانی که غلظت تک یاخته ها بالا است.
در این مطلب سعی کردیم این تکنیک را توضیح دهیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.
