تشخیص نوروویروس در آزمایشگاه : آنچه آزمایشگاهی ها باید بدانند

با شروع فصل سرما افراد زیادی به دلیل ابتلا به اسهال و استفراغ به مراکز درمانی مراجعه می‌کنند. این بیماری می‌تواند به علل مختلفی رخ دهد. اما نوروویروس (Norovirus) یکی از دلایل اصلی بروز اسهال و استفراغ به ویژه در فصل زمستان است.

شناختن انواع این ویروس و تشخیص صحیح آن می‌تواند به بهبود بیماری کمک زیادی کند.

در مقالات قبلی در رابطه با عفونت نورویروس و علائم آن صحبت کردیم. اما دراین مطلب قصد داریم به بررسی این ویروس از دید آزمایشگاهیان بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

طبقه بندی ویروسی

نوروویروس در گذشته به عنوان نوروالک (Norwalk) شناخته می‌شد. این نام برگرفته از سویه اصلی نوروالک بود که باعث شیوع گاستروانتریت در مدرسه‌ای در نوروالک اوهایو در سال 1968 شد.

نوروویروس از خانواده Caliciviridae هستند. این ویروس‌ها گروهی از ویروس‌های تک رشته‌ای RNA هستند. در درجه اول باعث گاستروانتریت حاد (التهاب معده و یا روده) می‌شوند.

بر اساس ساختار ژنتیکی، نوروویروس‌ها را می‌توان در ۷ زیر گروه مختلف (ژنوگروه) طبقه‌بندی کرد. این ژنوگروه‌های مختلف GI، GII، GIII، GIV، GV، GVI و GVII نامیده می‌شوند.

شایع‌ترین زیرگروه نوروویروس که منجر به عفونت‌ در بدن انسان می‌شوند، زیر گروه‌های GI و GII هستند.

• ژنوگروه GI حاوی ویروس‌هایی مانند ویروس نوروالک^[1] و ویروس ساوتهمپتون^[2] است.
• ژنوگروه GII نیز شامل ویروس‌هایی مانند ویروس مکزیکو^[3]، ویروس هاوایی^[4] و ویروس تورنتو^[5] است.

طرح طبقه‌بندی نوروویروس در سال 2019 به روزرسانی شدو یکسری تغییرات در ان اعمال گردید. به عنوان مثال:

• نوروویروس‌ها در حال حاضر به ده ژنوگروه (GI-GX) و 48 ژنوتیپ طبقه بندی می‌شوند.
• برخی از ژنوتیپ‌ها مجدداً طبقه‌بندی شدند. به عنوان مثال، 15 به یک ژنوگروه جدید GIX تبدیل شد.

نحوه جمع آوری نمونه برای بررسی نوروویروس

نوروویروس اغلب باعث اسهال و استفراغ می‌شود. این ویروس از طریق مدفوع، استفراغ، سطوح و یا آب و غذای آلوده به دیگران منتقل می‌شود. به همین دلیل برای تشخیص آن ممکن است نمونه‌های مختلفی مورد بررسی قرار گیرد. از آنجایی که این بیماری به شدت واگیردار است، در صورت مشاهده بیماران مشکوک، باید تست نورورویروس گرفته شود تا بتوان از بیمار شدن افراد دیگر جلوگیری کرد. این موضوع در مدارس، دانشگاه‌ها، زندان‌ها و خانه سالمندان بسیار اهمیت دارد. در ادامه به بررسی نمونه‌هایی خواهیم پرداخت که اغلب برای بررسی نورویروس‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند.

الف/ نمونه های بالینی

۱. جمع‌آوری نمونه مدفوع برای آزمایش نوروویروس

نمونه‌ی بالینی ارجح برای آزمایش نورویوروس ، مدفوع کامل است.  نمونه باید از حداقل 5 فرد بیمار جمع‌آوری شود. در حالت ایده‌آل، نمونه‌های مدفوع باید در مرحله حاد بیماری (حداکثر 72 ساعت پس از شروع علائم) جمع‌آوری شود، در حالی که مدفوع هنوز مایع یا نیمه جامد است. زیرا بیشترین مقدار ویروس در مرحله حاد بیماری دفع می‌شود.

نوروویروس گاهی اوقات می‌تواند پس از برطرف شدن علائم (حداکثر 7 تا 10 روز پس از شروع) نیز در نمونه مدفوع وجود داشته باشد. در این شرایط توصیه می‌شود، نمونه از تعداد بیشتری از بیماران جمع‌آوری شود.

هر نمونه باید دارای شرایط زیر باشد:

• به وضوح برچسب گذاری شده باشد.
• در یک ظرف پلاستیکی ضد نشت و ضد نفوذ جمع آوری شود. برای انتقال نمونه به آزمایشگاه، قوطی مدفوع باید درون یک کیسه قرار گیرد.
• اگر آزمایش در عرض 2 تا 3 روز پس از جمع آوری انجام شود، نمونه‌ها باید در 39 درجه فارنهایت (4 درجه سانتیگراد) در یخچال نگهداری شوند.
• اگر آزمایش فراتر از این زمان‌ها انجام شود یا قرار است بایگانی شوند، نمونه‌ها باید در حالت ایده‌آل در دمای 94 -درجه فارنهایت (70- درجه سانتی‌گراد) نگهداری شوند.
• اگر دستیابی به این دما میسر نیست، نمونه را در دمای 4 -درجه فارنهایت (20- درجه سانتی‌گراد) نگهداری کنید.

۲. جمع آوری استفراغ برای آزمایش نوروویروس

همانطور که گفته شد، نمونه‌ی ارجح برای نورورویروس، مدفوع است. اما در کنار نمونه‌ی مدفوع می‌توان نمونه استفراغ را نیز جمع‌آوری کرد و برای آزمایشات بیشتر، مورد بررسی قرار داد. این نمونه ها باید مانند نمونه مدفوع جمع آوری و به آزمایشگاه ارسال شوند. نمونه های استفراغ باید در دمای -4 درجه فارنهایت (20- درجه سانتی‌گراد) نگهداری شوند.  یا در دمای  94- درجه فارنهایت (70- درجه سانتی‌گراد) منجمد گردند.

۳. نمونه سرم برای تشخیص عفونت نوروویروس

نمونه‌های سرم برای تشخیص آزمایشگاهی بیماری نوروویروس توصیه نمی‌شوند. اما برای مطالعات خاص و تایید تشخیص ممکن است آنتی بادی‌های موجود در سرم نیز مورد بررسی قرار گیرند. به این منظور ممکن است نمونه‌های سرمی فاز حاد (حین داشتن علائم) و نقاهت (در حال بهبودی) جمع‌آوری شوند. نمونه‌های سرم باید در دمای 4- درجه فارنهایت (20- درجه سانتی‌گراد) منجمد شوند.

نمونه‌های سرم فاز حاد باید در 5 روز اول پس از شروع علائم جمع‌آوری شوند.

نمونه‌های مرحله نقاهت باید در هفته سوم تا چهارم پس از شروع علائم جمع‌آوری شوند.

ب/ نمونه‌های محیطی

۱.  نمونه‌های غذا و آب

نورویروس را می‌توان در آب، غذا و نمونه‌های محیطی تشخیص داد. به این منظور، ویروس ابتدا باید از نمونه غذا یا آب استخراج شده و سپس غلیظ شود. اگر غذا یا آب علت مشکوک شیوع نوروویروس باشد، نمونه‌ها باید در اسرع وقت جمع‌آوری شده و بلافاصله در یخچال نگهداری شوند.

نمونه‌های غذا باید در دمای 4 – درجه فارنهایت (20- درجه سانتی‌گراد) به صورت منجمد نگهداری شوند.

آب را می توان با پردازش حجم زیاد (تا 100 لیتر) از طریق فیلترهای طراحی شده ویژه برای نورویروس آزمایش کرد. نمونه‌های آب باید در یخچال یا در دمای 39 درجه فارنهایت (4 درجه سانتی‌گراد) نگهداری شوند.

۲.  نمونه‌های محیطی

سطوح سخت مانند پیشخوان آشپزخانه، دستگیره ها و … نیز می‌‎توانند از لحاظ آلودگی به نوروویروس مورد آزمایش قرار گیرند. به این منظور سواب اجسام مانند سطوح، دستگیره در و نرده‌ها جمع آوری می‌شود. با این وجود، مقدار ویروس روی سطوح اغلب کم است و تشخیص نوروویروس از طریق سواب همیشه ممکن نیست. به همین دلیل نتایج باید با احتیاط و در چارچوب شواهد اپیدمیولوژیک موجود تفسیر شوند.

تشخیص آزمایشگاهی نورورویروس

روش‌های تشخیصی نورویروس بر تشخیص RNA ویروسی (ماده ژنتیکی) یا آنتی ژن ویروسی تمرکز دارد. این قبیل آزمایش‌های تشخیصی در اغلب آزمایشگاه‌های بهداشت عمومی و بسیاری از آزمایشگاه‌های بالینی در دسترس هستند.

برای تشخیص این ویروس اغلب از روش‌های واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونویسی معکوس- زمان واقعی (RT-qPCR) استفاده می‌شود.

در ادامه به بررسی برخی از رایج‌ترین روش‌های تشخیصی نورورویروس در آزمایشگاه خواهیم پرداخت.

۱. سنجش RT-qPCR

آزمایش RT-qPCR در واقع RNA ویروس را شناسایی می‌کند. این تست را می‌توان برای نمونه مدفوع، استفراغ، غذا، آب و نمونه‌های محیطی استفاده کرد. سنجش RT-qPCR روش ارجح برای تشخیص نوروویروس است. زیرا بسیار حساس و اختصاصی است. به کمک این تکنیک،  می‌توان 10 تا 100 نسخه نورویروس را شناسایی کرد. آن‌ها از مجموعه‌های پرایمر الیگونوکلئوتیدی مختلف برای شناسایی نوروویروس‌های ژنوگروه I، ژنوگروه II، ژنوگروه VIII و GIX استفاده می‌کنند. آزمایش RT-qPCR می‌تواند تخمینی از بار ویروسی نیز ارائه دهند.

۲. پلتفرم‌های مولتی پلکس دستگاه گوارش

اخیراً چندین پلتفرم تجاری برای تشخیص پاتوژن‌های متعدد دستگاه گوارش در دسترس قرار گرفته است. این پنل‌ها، شامل ژنوگروه I و ژنوگروه دوم نوروویروس هستند. حساسیت این سنجش‌ها برای نورویروس در همان محدوده RT-qPCR است.

۳.  ایمونواسی‌های آنزیمی

ایمونواسی‌های سریع آنزیمی (EIA) ، آنتی‌ژن نوروویروس را در نمونه‌های مدفوع شناسایی می‌کنند. با این وجود، این کیت‌ها حساسیت ضعیفی دارند (50% تا 75%) و به طور کلی برای آزمایش نمونه‌های منفرد از موارد پراکنده گاستروانتریت توصیه نمی‌شوند. این سنجش‌ها می‌توانند برای شناسایی اولیه نوروویروس هنگام آزمایش چند نمونه در طول شیوع استفاده شوند. اما در هر صورت، نمونه‌هایی که تست منفی دارند باید با روش دوم، مانند RT-qPCR تایید شوند. بنابراین، کیت‌‌های EIA به هیچ عنوان جایگزین RT-qPCR در طول بررسی شیوع بیماری نیستند.

۴. ژنوتیپ کردن

خصوصیات ژنتیکی نوروویروس‌ شناسایی‌شده در نمونه‌های مدفوع و محیطی می‌تواند در تحقیقات اپیدمیولوژیک یا شناسایی سویه‌های ویروسی جدید بسیار مفید باشد. به این منظور از ژنوتیپ کردن استفاده می‌شود. ژنوتیپ اطلاعاتی است که در ژنوم هر یک از سلول‌های موجودات زنده به صورت DNA وجود دارد. این اطلاعات بر روی کروموزوم‌های داخل هسته (در یوکاریوت‌ها) یا داخل سیتوپلاسم (در پروکاریوت‌ها) قرار گرفته اند.

نورویروس را می‌توان با تجزیه و تحلیل توالی یک محصول RT-PCR ژنوتیپ کرد.

سوالات رایج در رابطه با تشخیص آزمایشگاهی نرورویروس

۱.  نورویروس چگونه در آزمایشگاه شناسایی می‌شود؟

روش‌های تشخیصی نورویروس بر تشخیص RNA ویروسی (ماده ژنتیکی) یا آنتی ژن ویروسی تمرکز دارد. آزمایش‌های تشخیصی در همه آزمایشگاه‌های بهداشت عمومی و بسیاری از آزمایشگاه‌های بالینی در دسترس هستند. وبیشتر آن‌ها از روش‌های واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونویسی معکوس- زمان واقعی (RT-qPCR) برای تشخیص نوروویروس استفاده می‌کنند.

۲. آیا آزمایش خون می‌تواند نورویروس را تشخیص دهد؟

تیتر آنتی بادی سرم را می‌توان در عرض 2 هفته پس از بیماری تشخیص داد.

۳. شیوع نوروویروس چگونه شناسایی می‌شود؟

شیوع نوروویروس به صورت وقوع دو یا چند بیماری مشابه توسط آزمایشگاه، تعریف می‌شود.

۴.  کدام نمونه برای تشخیص نورویروس ایده‌آل است؟

نمونه‌های بالینی برای تشخیص نوروویروس ارجحیت دارند. مدفوع کامل نمونه بالینی ارجح برای تشخیص آزمایشگاهی بیماری نوروویروس است.

۵. نورویروس در میکروبیولوژی چیست؟

نوروویروس ها از خانواده Caliciviridae هستند. آن‌ها گروهی از ویروس‌های RNA و تک رشته‌ای هستند که در درجه اول باعث گاستروانتریت حاد (التهاب معده و/یا روده) می‌شوند. نوروویروس‌ها قبلا نوروالک نامیده می‌شدند.

۶.  نورویروس چگونه در محیط بالینی پخش می‌شود؟

نورویروس از طریق ذرات ریز مدفوع یا استفراغ از یک فرد آلوده منتشر می‌شود.

۷.  نورویروس چه مدت روی سطوح فعال است؟

نوروویروس از طریق تماس فرد با فرد آلوده یا لمس سطوح آلوده مانند در، توالت و دستگیره شیر آب منتقل می‌شود. نوروویروس می‌تواند دو هفته روی سطوح زنده بماند. تمیز کردن و ضد عفونی کردن سطوح برای حذف و از بین بردن ویروس بسیار مهم است.

سخن پایانی

نوروویروس یکی از علل اصلی بروز اسهال و استفراغ، به‌ویژه در فصول سرد سال است. این بیماری بسیار واگیردار است و به سرعت منتقل می‌شود. به همین دلیل تشخیص بروز آن به ویژه در مراکزی که تعداد زیادی از افراد کار یا زندگی می‌کنند اهمیت بالایی دارد. لازم است چنین مراکزی به محض دیدن چند مورد ابتلا به اسهال و استفراغ، حتما جهت بررسی بیماری با مراکز درمانی یا آزمایشگاه ارتباط برقرار کنند.

واژه نامه