محیط کشت کلیگر آیرون آگار : اصول و کاربردها

کلیگر آیرون آگار (KIA) ^[1] یک محیط کشت آزمایشگاهی است که برای شناسایی انتروباکتریاسه استفاده می‌شود. اصول عملکرد این محیط کشت بر اساس تخمیر قند و تولید سولفید هیدروژن است. در سال 1918، شخصی به نام کلیگلر، محیط کشتی را برای تشخیص H2S و تمایز گونه‌های سالمونلا ایجاد کرد. بعدها این محیط کشت با جایگزینی یکسری مواد اصلاح شد و کلیگر آیرون آگار نام گرفت. در ادامه قصد داریم به بررسی مواد تشکیل دهنده و نحوه استفاده از کلیگر آیرون آگار بپردازیم. پس با ما همراه باشید.

کاربرد اصلی کلیگر آیرون آگار

کاربرد اصلی محیط کشت کلیگر آیرون آگار ، شناسایی گونه‌های انتروباکتریاسه است. اما می‌توان از آن برای بررسی باسیل‌های گرم منفی روده نیز استفاده کرد. این آگار در تشخیص H2S تولید شده توسط برخی از سویه‌های سودوموناس نیز کاربرد دارد.

ایجاد تمایز بین گونه‌های باکتریایی از طریق تولید سولفید هیدروژن و تخمیر دکستروز و لاکتوز صورت می‌گیرد.

ترکیبات کلیگر آیرون آگار

ترکیبات اصلی محیط کشت کلیگر آیرون آگار عبارتند از پپتون، پودر آزمایشگاهی لمکو، عصاره مخمر، کلرید سدیم، لاکتوز، گلوکز (دکستروز)، سیترات فریک، تیوسولفات سدیم، فنل قرمز و آگار.

ترکیب محیط کشت KIA با محیط کشت  TSIتقریبا یکسان است. با این تفاوت که 10 گرم ساکارز در TSI اضافه می‌شود. در جدول 1 ترکیبات کلیگر آیرون آگار به همراهع مقدار هریک ذکر شده است.

جدول 1. مواد تشکیل دهنده محیط کشت KIA

توجه : pH نهایی این محصول باید حدود 7.4 باشد. این محیط کشت به صورت اسلنت (شیب‌دار) در لوله‌های آزمایش ریخته می‌شود.

گلوکز و لاکتوز منبع کربوهیدرات هستند و به طور مساوی در هر دو قسمت مایل و عمیق لوله توزیع می‌شوند. با این حال، غلظت لاکتوز 10 برابر گلوکز است.

در این محیط کشت از بازدارنده‌ها استفاده نشده است. به همین دلیل اغلب گونه‌های باکتریایی می‌توانند روی آن رشد کنند.

ترکیب چهار مشتق پروتئینی یعنی عصاره گوشت گاو، عصاره مخمر، پپتون و پروتئوز پپتون، محیط کشت KIA را از نظر تغذیه‌ای بسیار غنی می‌کند.

تیوسولفات سدیم منبع گوگرد است و سولفات آهن به عنوان آشکارساز سولفید هیدروژن عمل می‌کند.

نشانگر فنل رد در pH  پایین‌تر از  6.8 زرد رنگ است. از طرف دیگر pH محیط تلقیح نشده  7.8 است. بنابراین مقادیر نسبتاً کمی از تولید اسید منجر به تغییر رنگ قابل توجهی می‌شود.

محیط کشت کلیگر آیرون آگار چگونه آماده می‌شود؟

۱. بهترین روش آماده‌سازی کلیگر آیرون آگار ، استفاده از پودر آماده‌ است. این پودر به صورت تجاری عرضه می‌شود.

۲. برای آماده سازی آگار ، اغلب 5.5 گرم از پودر آماده را در هر 100 میلی لیتر آب مقطر حل می‌کنند. البته میزان غلظت بسته به توصیه سازنده ممکن است متفاوت باشد. پس حتما از دستورالعمل سازنده برای آماده سازی این محیط کشت پیروی کنید.

۳. پس از اینکه محیط کشت آماده شد، اجازه دهید به دمای 50 الی 55 درجه سانتی‌گراد برسد. سپس آن را در در لوله‌های آزمایش بریزید. توصیه می‌شود در هر لوله 6 میلی‌لیتر از محلول ریخته شود. 

۴. درب لوله‌ها را باز بگذارید و آن‌ها را درون اتوکلاو قرار دهید. به مدت 15 دقیقه تحت دمای 121 درجه سانتی‌گراد اتوکلاو کنید. اجازه دهید آگار مذاب در حالت مایل جامد شود. به این ترتیب محیط کشت شما دو فاز خواهد داشت.

• قسمت مایل: در سرتاسر سطح خود در معرض اکسیژن اتمسفر قرار دارد و هوازی است.
• قسمت عمیق: نسبتاً بی‌هوازی است.

5. محیط کشت کلیگر آیرون آگار را در جای تاریک خنک و در دمای 2 الی 8 درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید.

ماندگاری  این محلول حدود 3 هفته یا بیشتر است. به شرط اینکه درپوش‌های لوله محکم بسته شوند و هیچ تغییری در ظاهر محیط تیجاد نشود. تغییر ظاهری محیط کشت می‌تواند نشان دهنده آلودگی یا تغییر pH باشد.

محیط کشت کلیگر آیرون آگار چگونه سبب تمایز می‌شود؟

الف/ ارگانیسم‌های تخمیر کننده غیر لاکتوز در محیط کشت KIA

اگر محیط کشت کلیگر آیرون آگار با یک ارگانیسم تخمیر کننده گلوکز تلقیح شود که نمی‌تواند از لاکتوز استفاده کند، فقط مقدار نسبتا کمی اسید در محیط کشت ایجاد می‌شود. در ابتدا، در طی 8 تا 12 ساعت اول انکوباسیون، حتی این مقدار کم اسید ممکن است باعث تغییر رنگ هر دو قسمت آگار (هم قسمت مایل و هم قسمت عمیق) به رنگ زرد شود.

با این حال، ظرف چند ساعت بعد، ذخایر گلوکز به طور کامل تمام می‌شود و باکتری‌ها شروع به تخریب اکسیداتیو اسیدهای آمینه در قسمت مایل آگار می‌کنند. این منجر به آزاد شدن آمین‌هایی می‌شود که مقادیر اسید موجود در قسمت مایل را خنثی می‌کنند. طی 18 تا 24 ساعت، کل قسمت مایل به pH قلیایی باز می‌گردد و رنگ آن مجددا قرمز می‌شود.

اما، در قسمت عمیق (بخش بی هوازی) لوله، تخریب اسید آمینه برای مقابله با اسید تشکیل شده کافی نیست. بنابراین قسمت عمیق لوله، زرد باقی می‌ماند.

ب/ ارگانیسم‌های تخمیر کننده لاکتوز در محیط کشت KIA

اگر محیط کشت کلیگر آیرون آگار با ارگانیسم تخمیر کننده لاکتوز تلقیح شود، در صورت تمام شدن منبع گلوکز، بازهم تخمیر ادامه می‌یابد. زیرا ارگانیسم قادر به استفاده از لاکتوز  است که غلظت آن در محیط کشت KIA ،حدودا 10 برابر بیشتر از گلوکز است.

در نتیجه، هنگامی که لوله در پایان 18 تا 24 ساعت بررسی می‌شود، تولید اسید از تخمیر لاکتوز همچنان در حال وقوع است. بنابراین هر دو سطح مایل و عمیق زرد به نظر می‌رسند.

بررسی نتایج محیط کشت کلیگر آیرون آگار

باکتری‌هایی که روی محیط کشت KIA رشد می‌کنند سه نوع واکنش کلی ایجاد می‌کنند. در ادامه به بررسی این سه واکنش خواهیم پرداخت.

۱. محیط کشت بدون تغییر: در این حالت قسمت مایل، قلیایی/قلیایی (K/K) است. در واقع تخمیر کربوهیدرات اتفاق نمی‌افتد. این امر نشان‌دهنده‌ی وجود باسیل‌های گرم منفی غیر تخمیری در محیط کشت است. یعنی جاندارانی که قادر به تولید اسید از تخمیر گلوکز یا لاکتوز نیستند. مانند سودوموناس آئروژینوزا.

۲. تخمیر کننده غیر لاکتوز: در این حالت قسمت مایل قلیایی / اسیدی (K/A) است. یعنی  گلوکز تخمیر می‌شود اما لاکتوز تخمیر نمی‌گردد. این ویژگی برای باکتری‌های غیر تخمیر کننده لاکتوز، مانند گونه‌های شیگلا صدق می‌کند. در ابتدا، تخمیر گلوکز ، هر دو قسمت عمیق و مایل محیط را اسیدی می‌کند. اما در نهایت قسمت مایل به pH قلیایی برمی‌گردد.

۳. تخمیر کننده لاکتوز: در این حالت هر دو قسمت مایل و عمیق اسیدی (A/A) هستند. در این حالت گلوکز و لاکتوز هر دو تخمیر می‌شوند. این ویژگی برای کلیفرم‌های تخمیر کننده لاکتوز، مانند اشریشیا کلی و گونه‌های کلبسیلا-انتروباکتر صدق می‌کند.

علاوه بر واکنش‌های فوق، ممکن است واکنش‌های دیگری نیز در محیط کشت کلیگر آیرون آگار صورت گیرد. به عنوان مثال:

• تولید گاز: تولید گاز معمولا در فضای پایین لوله و وسط لوله ایجاد می‌شود. این به دلیل تولید گاز CO2 توسط ارگانیسم است.
• تولید H2S: سیاه شدن بخش عمیق محیط کشت KIA تولید سولفید هیدروژن (H2S) را نشان می‌دهد. باکتری‌های غیر تخمیرکننده لاکتوز و مولد سولفید هیدروژن، مانند گونه‌های سالمونلا، گونه‌های سیتروباکتر و گونه‌های پروتئوس، می‌توانند سبب ایجاد این پدیده شوند.

لوله‌های حاوی کلیگر آیرون آگار با چندین الگوی واکنش

A: اسید/اسید و تولید گاز

B: اسید/اسید و بدون گاز

C: قلیایی/اسیدی

D: قلیایی / اسیدی و تولید  H2

E: قلیایی / قلیایی

بررسی رفتار برخی از باکتری‌های مهم و رایج در محیط کشت KIA

همانطور که گفته شد، نتایج کشت ارگانیسم‌های مختلف در کلیگر آیرون آگار متفاوت است. در جدول 2 به بررسی بررسی رفتار برخی از باکتری‌های رایج در محیط کشت KIA پرداخته شده است.

جدول 2.برخی از باکتری‌های مهم و رایج در محیط کشت KIA

سخن پایانی

کلیگر آیرون آگار (KIA) یک محیط کشت مهم در تشخیص گونه‌های انتروباکتریاسه است. برای استفاده از این محیط کشت نکاتی وجود دارد. به عنوان جمع‌بندی، مروری اجمالی بر این نکات خواهیم داشت.

توصیه می‌شود حتما آزمایش بیوشیمیایی، ایمونولوژیک یا طیف سنجی جرمی انجام شود.

گونه‌ها یا سویه‌های خاصی ممکن است واکنش‌های تاخیری ایجاد کنند. بنابراین نتایج باید پس از 18 الی 24 ساعت بررسی شود. در غیر این صورت ممکن است منجر به نتایج اشتباه شود.

استفاده از کشت خالص هنگام تلقیح ضروری است. اگر کلیگر آیرون آگار با کشت مخلوط تلقیح شود، ممکن است مشاهدات نامنظم رخ دهد.

واژه نامه