تست حساسیت به اپتوچین : آشنایی با اصول، کاربردها و نتایج

تست حساسیت به اپتوچین (Optochin Susceptibility Test) اغلب برای شناسایی سویه‌های استرپتوکوکوس پنومونیه بکار می‌رود. در واقع این تست امکان شناسایی احتمالی استرپتوکوک آلفا همولیتیک (S. pneumoniae) را فراهم می‌کند. اما باید توجه داشت که برخی از سویه‌های پنوموکوکی به اپتوچین مقاوم هستند.

این آزمایش به دلیل سادگی، هزینه کم و حساسیت بیش از 95 درصد، یکی از تست‌های رایج در آزمایشگاه محسوب می‌شود. در ادامه قصد داریم به بررسی اصول این تست بپردازیم. پس با ما همراه باشید.

مروری بر تاریخچه استفاده از اپتوچین

اپتوچین که اتیل هیدروکوپرین هیدروکلراید^[1] نیز نامیده می‌شود، مشتقاتی از کینین است که یک عامل ضد مالاریا است. مورگنروث و لوی این ماده را در سال 1911 به عنوان آنتی بیوتیکی برای درمان عفونت پنوموکوکی (عفونت استرپتوکوک پنومونیه) معرفی کردند. اگرچه اپتوچین می‌تواند استرپتوکوکوس پنومونیه را مهار یا از بین ببرد، اما به عنوان یک اقدام درمانی استفاده نمی‌شود. در عوض، از آن در تمایز استرپتوکوک پنومونیه از دیگر استرپتوکوک‌های α-همولیتیک (استرپتوکوک ویریدانس) استفاده می‌شود.

استرپتوکوک پنومونیه یک دیپلوکوک گرم مثبت، کاتالاز منفی، α همولیتیک، بی هوازی از جنس استرپتوکوک از خانواده استرپتوکوکاسه در کلاس باسیل است. این باکتری معمولاً در دستگاه تنفسی فوقانی انسان یافت می‌شود. اما در بیماران با نقص ایمنی و مستعد منجر به پنومونی، مننژیت، اوتیت میانی، آرتریت و بسیاری از عفونت‌های دیگر می‌شود. از آنجایی که علت اصلی ذات الریه است، به آن پنوموکوک می‌گویند.

استرپتوکوک پنومونیه معمولاً در دستگاه تنفسی یافت می‌شود و از نمونه‌های تنفسی جدا می‌شود که در آن گروه‌های متنوع دیگری از استرپتوکوک‌های α-همولیتیک نیز یافت می‌شوند. از این رو، شناسایی S. pneumoniae دشوار است. خوشبختانه بوون و جف در سال 1955 دیسکی را با اپتوچین آغشته کردند و پیشنهاد کردند که از آن به عنوان روشی برای افتراق S. pneumoniae از سایر استرپتوکوک‌های viridans استفاده شود. این روش تست حساسیت اپتوچین برای شناسایی باکتری پنوموکوک نامیده می‌شود. اگرچه تست حساسیت اپتوچین برای اولین بار در سال 1915 توصیف شد، این آزمایش تا اواسط دهه 1950 تقریباً توسط آزمایشگاه ها استفاده نشد.

اصول و کاربردهای تست حساسیت اپتوچین

همانطور که گفته شد، اتیل هیدروکوپرین هیدروکلراید (اپتوچین)، یک مشتق کینین است. اپتوچین به طور انتخابی رشد استرپتوکوک پنومونیه را در غلظت بسیار کم (5 میلی گرم در میلی لیتر یا کمتر) مهار می‌کند. به همین دلیل استرپتوکوک پنومونیه باید مناطقی در اطراف دیسک‌های اپتوچین روی محیط کشت داشته باشد اما استرپتوکوک‌های گروه viridans هیچ منطقه‌‌ای در اطراف دیسک اپتوچین ندارند. Optochin همچنین ممکن است استرپتوکوک های viridans را مهار کند، اما فقط در غلظت‌های بسیار بالاتر.

اپتوچین محلول در آب است و به آسانی در محیط آگار منتشر می‌شود. برای انجام تست حساسیت اپتوچین، دیسک‌های کاغذی  آغشته به اپتوچین را روی محیط کشت حاوی نمونه مشکوک قرار می‌دهند. سلول‌های استرپتوکوک پنومونیه به دلیل تغییر در کشش سطحی در اطراف دیسک لیز می‌شوند و ناحیه مهار ایجاد می‌شود.

مواد مورد نیاز برای انجام تست حساسیت به اپتوچین

برای انجام تست حساسیت اپتوچین، حداقل مواد و لوازم زیر مورد نیاز است:

• دیسک‌های کاغذی آغشته به اپتوچین: دیسک‌های اپتوچین را می‌توان از فروشندگان لوازم آزمایشگاهی خریداری کرد. هر دیسک معمولا به 5 میکروگرم اپتوچین آغشته شده است. توجه داشته باشید که محل نگهداری این دیسک‌ها باید دمایی حدود 2 تا 8 درجه سانتی گراد داشته باشد. دیسک‌ها باید از نور، گرمای بیش از حد و رطوبت نیز دور نگهداشته شوند.
• آگار خون گوسفند 5 درصد
• لوپ‌های میکروبیولوژیکی استاندارد
• انکوباتور Co2 در دمای 35 الی37 درجه سانتی‌گراد
• فورسپس استریل

کنترل کیفیت آزمایش

تست حساسیت اپتوچین نیز مانند هر تست آزمایشگاهی دیگری نیاز به کنترل کیفیت دارد.  هر تعداد از دیسک‌های اپتوچین باید با کنترل‌های مثبت و منفی آزمایش شوند.

کنترل مثبت: رشد سویه ATCC 49619 S. pneumoniae توسط اپتوچین مهار می‌شود.

کنترل منفی: رشد سویه ATCC 49456 S. mitis توسط اپتوچین مهار نمی‌شود.

روش انجام تست حساسیت اپتوچین

دیسک‌های Optochin (6 میلی متر، 5 میکروگرم) را می‌توان از یک فروشنده تجاری تهیه کرد. اگر منبع تجاری دیسک‌های اپتوچین در دسترس نباشد، می‌توان محلول 1:4000 اتیل هیدروکوپرین هیدروکلراید را روی دیسک‌های کاغذ فیلتر استریل 6 میلی متری اعمال کرد.

با استفاده از یک لوپ تلقیح، دو یا سه کلنی مشکوک از یک کشت خالص را به روش کشت خطی روی آگار خون گوسفند 5% پخش کنید.

یک دیسک اپتوچین را در ناحیه کشت شده قرار دهید.

پلیت آگار را در دمای 35 الی 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور CO2 به مدت 18 تا 24 ساعت انکوبه کنید.

توجه: دو سویه مختلف را می‌توان در یک پلیت آگار آزمایش کرد، اما باید مراقب بود که کشت‌ها روی هم قرار نگیرند.

تشخیص مستقیم

برای تشخیص مستقیم استرپتوکوک پنومونیه در پلیت آگار، یک دیسک اپتوچین را به ربع دوم پلیت آگار اضافه کنید و ناحیه مهار را در اطراف استرپتوکوک پنومونیه مشاهده کنید. اما توجه داشته باشید که بدون انکوباسیون ممکن است هاله عدم رشد بزرگتری را مشاهده کنید. بنابراین افزودن دیسک اپتوچین به طور معمول توصیه نمی‌شود. اما ممکن است برای آزمایشگاه هایی با تعداد زیادی نمونه از بیماران مبتلا به پنومونی اکتسابی از جامعه مفید باشد.

نتایج تست حساسیت اپتوچین

نتایج تست حساسیت اپتوچین معمولا به صورت زیر خواهد بود:

مثبت: وجود ناحیه مهار 14 میلی‌متری یا بیشتر برای دیسکی که حدود 6 میلی متر قطر دارد.

منفی: بدون  ایجاد منطقه مهار

مبهم: هر ناحیه مهار کمتر از 14 میلی‌متر برای پنوموکوک‌ها مشکوک است.

توجه: ناحیه بازدارندگی کوچکتر (کمتر از 14 میلی‌متر) یا عدم وجود ناحیه بازداری نشان می‌دهد که آزمایشدیگری مثل آزمایش حلالیت صفرا مورد نیاز است. مهم است که به یاد داشته باشید که پنوموکوک‌ها گاهی اوقات به اپتوچین مقاوم هستند.

موارد احتیاط هنگام استفاده از تست حساسیت اپتوچین

هنگام انجام تست حساسیت اپتوچین حتما به نکات زیر توجه داشته باشید.

• قبل از اینکه دمای محیطِ ذوب شده به زیر 40 درجه سانتیگراد برسد، محیط را در پلیت بریزید. در غیر این صورت، ممکن است توده های برجسته ای در محیط کشت تشکیل شود.
• برای شناسایی باکتری، همیشه از آگار خون گوسفند 5 درصد استفاده کنید.
• دیسک را در فاصله 25 میلی متری از لبه پلیت قرار دهید. اگر از چند دیسک آنتی بیوتیک استفاده می‌کنید، دیسک‌ها را حداقل 25 میلی‌متر از یکدیگر دور کنید.
• در صورتی که باکتری های آزمایشی α-همولیتیک هستند اما حساسیت متوسطی به اپتوچین نشان می‌دهند، نیاز به آزمایش حلالیت صفرا دارید.
• گاهی اوقات، استرپتوکوکوس پنومونیه مقاوم به اپتوچین گزارش شده است.
• کلنی های مقاوم به اپتوچین ممکن است استرپتوکوک پنومونیه باشند یا نباشند. بنابراین نیاز به تایید دارند.
• این یک روش مبتنی بر کشت است، بنابراین حداقل 24 ساعت زمان برای نتایج و تفسیر آزمایش نیاز دارد.

سخن پایانی

تمایز استرپتوکوکوس پنومونیه از سایر استرپتوکوک‌های ویریدانس به نشان دادن حساسیت به اپتوچین، حلالیت صفرا، واکنش با یک پروب DNA خاص یا تشخیص پلی ساکاریدهای کپسولی خاص گونه بستگی دارد. امروزه اکثر آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی بالینی به تست حساسیت اپتوچین وابسته هستند. به همین دلیل در این مطلب سعی کردیم به معرفی این تست و اصول انجام آن بپردازیم. امیدواریم این مقاله مورد توجه شما قرار گرفته باشد.