رنگآمیزی تریکروم ویتلی: اصول، مراحل، کاربردها
رنگآمیزی تریکروم ویتلی (Wheatley Trichrome Staining) یکی از روشهای مهم و کاربردی در انگلشناسی است که برای تشخیص دقیق پروتوزوآهای (Protozoa) رودهای در نمونههای مدفوع استفاده میشود. این روش بهویژه در آزمایشگاههایی کاربرد دارد که میخواهند شکلهای مختلف انگل، از جمله کیستها و تروفوزوئیتها، را با وضوح بالا مشاهده کنند.
این رنگآمیزی معمولاً روی نمونههایی انجام میشود که باPVA تثبیت شدهاند یا با فیکساتور شادین (Schaudinn’s) نگهداری شدهاند. PVA مخفف Polyvinyl Alcohol است. در آزمایشگاههای انگلشناسی و میکروبیولوژی کاربردهای زیر را دارد.
رنگ تریکروم ابتدا در سال ۱۹۵۱ توسط گوموری (Gomori) معرفی شد و یک سال بعد، ویتلی (Wheatley) آن را با افزودن مراحل دقیقتر فیکساسیون و هیدراتاسیون به شکل امروزی درآورد. نتیجه، روشی سریع، ساده و بسیار مؤثر برای تشخیص آمیبها و تاژکداران رودهای شد. روشی که هنوز هم در بسیاری از آزمایشگاهها استاندارد است.
اصول (Principle) رنگآمیزی تریکروم ویتلی
در روش رنگآمیزی تریکروم ویتلی از نمونههای مدفوع یا اسمیرهای نازک مدفوع استفاده میشود که بهصورت دائمی روی لام پخش و ثابت شدهاند. به این ترتیب شناسایی کیستها و تروفوزوئیتها با دقت بالایی انجام شود. این تکنیک حساسیت بسیار بالایی دارد و میتواند پروتوزوآهای کوچکی را که ممکن است در بررسی مرطوب (Wet Mount) دیده نشوند، تشخیص دهد.
رنگآمیزی تریکروم ویتلی یک نسخه اصلاحشده از روش اصلی گوموری برای رنگآمیزی بافت است. این تکنیک ساده است، بهسرعت انجام میشود و اسمیرهایی با رنگگیری یکنواخت از پروتوزوآهای رودهای، مخمرها (Yeasts)، آرتیفکتها و سلولهای انسانی تولید میکند.
نمونهی مدفوع مورد استفاده باید تازه باشد. همچنین نمونه باید باPVA فیکس شده باشد و یا در محلول SAF (Sodium Acetate–Acetic Acid–Formalin) نگهداری شده باشد.
کاربردهای رنگآمیزی تریکروم ویتلی
این روش رنگ آمیزی برای موارد زیر به کار میرود.
- تشخیص عفونتهای پروتوزوآی رودهای
- شناسایی مورفولوژیهای انگلها
- شناسایی انواع سلولهای مخمر (Yeast Cells)
- شناسایی سلولهای انسانی
تفاوت رنگآمیزی تریکروم ویتلی با مانسون تریکروم و سایر تریکرومها
رنگآمیزی تریکروم ویتلی یک روش اختصاصی و حساس برای انگلشناسی است که عمدتاً برای شناسایی پروتوزوآهای رودهای در نمونههای مدفوع به کار میرود. این تکنیک با استفاده از اسمیرهای تثبیتشده با PVA یا Schaudinn’s fixative انجام میشود و امکان مشاهده دقیق تروفوزوئیتها و کیستها را فراهم میکند. ویژگی برجستهی این روش، ایجاد کنتراست بالا بین پروتوزوآها و پسزمینه سبز رنگ و توانایی تفکیک سلولهای انسانی و مخمرها است، که آن را از سایر روشهای تریکروم متمایز میکند.
در مقابل، رنگآمیزیManson Trichrome و سایر تریکرومها مانند Mallory و Gomori بیشتر در بافتشناسی (Histology) کاربرد دارند و برای بررسی بافتهای همبند، کلاژن، عضله و تغییرات فیبروز به کار میروند. این روشها معمولاً روی مقاطع بافتی فیکساتشده و پارافینگذاریشده انجام میشوند و هدفشان شناسایی ساختارهای بافتی و فیبریلها است، نه مشاهده پروتوزوآهای رودهای. تفاوت اصلی این روشها با Wheatley Trichrome در نوع نمونه، ترکیب رنگ، ساختار هدف و فیکساتور مورد استفاده است.
به طور خلاصه، اگرچه تمام روشهای تریکروم بر اصل سه رنگ برای تفکیک اجزای سلولی بنا شدهاند، اما Wheatley Trichrome تنها روش مناسب برای رنگآمیزی دائمی اسمیر مدفوع و تشخیص کیست و تروفوزوئیت پروتوزوآ است. در حالی که Manson و سایر تریکرومها برای کاربردهای بافتشناسی و تفکیک بافتهای همبند و فیبروز طراحی شدهاند. این تفاوتها باعث میشود انتخاب روش رنگآمیزی متناسب با نوع نمونه و هدف مطالعه، اهمیت بالایی در نتیجهگیری دقیق داشته باشد.
تهیهی معرفها
تهیهی معرفها برای رنگآمیزی تریکروم ویتلی شامل تهیه محلول رنگ اصلی، اتانولهای با غلظتهای مختلف، اتانول اسیدی، اتانول یددار، زایلن، محیط مانت و روغن ایمرسیون است.
محلول رنگ تریکروم حساس و با ماندگاری طولانی است و باید دور از نور نگهداری شود. سایر معرفها برای مراحل مختلف رنگآمیزی و تثبیت نمونهها بهکار میروند و ترکیب دقیق و ترتیب استفاده از آنها، نتیجهی رنگآمیزی یکنواخت و واضح از پروتوزوآهای رودهای، سلولهای انسانی و آرتیفکتها را تضمین میکند. در ادامه به بررسی محلولهای مورد استفاده در این روش رنگ آمیزی خواهیم پرداخت.
محلولهای مورد نیاز
1. اتانول ۹۵٪
2. اتانول ۱۰۰٪
3. زایلن یا جایگزین زایلن (Xylene)
4. محیط مانت (Permount Mounting Medium)
5. روغن ایمرسیون (Immersion Oil)
6. اتانول ۷۰٪
7. اتانول ۷۰٪ یددار
محلول مادر:
- افزودن ید کریستالی به اتانول ۷۰٪ تا ایجاد محلول تیره (حدود ۱–۲ g در ۱۰۰ ml.)
- حین مصرف رقیقسازی محلول مادر با اتانول ۷۰٪ تا رسیدن به رنگ قهوهای مایل به قرمز تیره (رنگ چای پررنگ)
8. اتانول اسیدی ۹۰٪
روش تهیه:
- اتانول — ۹۹.۵ ml
- اسید استیک گلاسیال — ۰.۵ ml
9. محلول رنگ تریکروم (Wheatley’s Trichrome Stain)
ترکیبات:
- Chromotrope 2R — 6 g
- Light Green SF — 3 g
- Phosphotungstic Acid — 7 g
- Acetic Acid (Glacial) — 0 ml
- Distilled Water — 100 ml
روش تهیه:
- مقدار 1ml اسید استیک گلاسیال را به ترکیبات خشک اضافه کنید.
- مخلوط را بهمدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق رها کنید تا عملآوری (Ripening) انجام شود.
- سپس 100ml آب مقطر را اضافه کنید؛ رنگ محلول به بنفش تغییر میکند.
- محلول را دور از نور و در بطری شیشهای یا پلاستیکی، در دمای اتاق نگهداری کنید.
ماندگاری محلول: ۲۴ ماه
روش انجام رنگآمیزی تریکروم ویتلی
توجه داشته باشید که هنگام انجام این روش حتما از دستکش محافظ استفاده کنید.
آمادهسازی نمونه مدفوع
- نمونه مدفوع تازه تهیه شود.
- مقادیر کمی از مدفوع را با اپلیکاتور روی لامهای میکروسکوپی تمیز قرار دهید و اسمیر بسیار نازک از نمونه درست کنید.
- اسمیر را خشک نکنید و بلافاصله آن را در Schaudinn’s fixative قرار دهید. اجازه دهید ۳۰ دقیقه تثبیت شود.
- در صورتی که نمونه مدفوع آبکی باشد، ۳–۴ قطره PVA روی اسمیر اضافه کنید، مخلوط کنید و اجازه دهید چند ساعت در دمای ۳۵–۳۷ درجه سانتی گراد بماند و یا یک شب در دمای اتاق خشک شود.
رنگآمیزی اسمیرها
اگر اسمیر با PVA آماده شده است، ابتدا آن را ۱۰ دقیقه در محلول ید-اتانول (اتانول ۷۰٪ + ید) قرار دهید. برای نمونههایی با فیکساتورهای دیگر و بدون کلراید جیوه، مرحله ید را حذف کنید.
- لام را از Schaudinn’s fixative خارج کنید و ۵ دقیقه در اتانول ۷۰٪ قرار دهید.
- لام را در اتانول ۷۰٪ + ید قرار دهید:
- برای نمونه تازه: ۱ دقیقه
- برای نمونه خشک شده با PVA به مدت ۵–۱۰ دقیقه
- لام را مجددا به مدت ۵ دقیقه در اتانول ۷۰٪ قرار دهید.
- لام را ۳ دقیقه در اتانول ۷۰٪ قرار دهید.
- لام را ۱۰ دقیقه در محلول رنگ تریکروم قرار دهید.
- لام را در اتانول ۹۰٪ + افزودن اسید استیک به مدت ۱–۳ ثانیه قرار دهید، سپس سریع آنرا خارج کنید. اجازه ندهید لام مدت طولانی در این محلول بماند.
- لام را در اتانول ۱۰۰٪ برای مرحله شستشو فرو ببرید.
- لام را در دو بار در اتانول ۱۰۰٪، هر بار به مدت ۳ دقیقه قرار دهید.
- لام را در زایلن به مدت ۵–۱۰ دقیقه قرار دهید.
- اسمیر را با لامل (Coverslip) با استفاده از محیط مانت مانند Permount مونتاژ کنید.
- اجازه دهید اسمیر یک شب خشک شود یا حداقل ۱ ساعت در دمای ۳۷ سانتی گراد بماند.
مشاهده میکروسکوپی
- اسمیر را ابتدا در بزرگنمایی X ۱۰۰ بررسی کنید.
- سپس با استفاده از روغن ایمرسیون (Immersion Oil) مشاهده کنید. ۲۰۰–۳۰۰ فیلد مورد بررسی قرار گیرد.
نتایج و تفسیر رنگآمیزی تریکروم ویتلی
نتایج رنگ آمیزی تریکروم ویتلی به صورت زیر خواهد بود:
- مشاهده پروتوزوآها: تروفوزوئیتها و کیستهای پروتوزوآ باید زیر میکروسکوپ بررسی شوند.
- رنگآمیزی سیتوپلاسم تروفوزوئیتها: معمولاً آبی-سبز یا بنفش روشن دیده میشود.
- رنگآمیزی کیستها:کیستها رنگ بنفشتر دارند.
- مشاهده سلولهای انسانی و مخمر: سلولهایی مانند گلبولهای قرمز (RBCs)، پلیمورفونوکلئرها (PMNs)، ماکروفاژها و همچنین مخمرها میتوانند شناسایی شده و به رنگ قرمز دیده شوند.
- هستهها و اجسام داخل سلولی: هستهها و inclusion bodies نیزرنگ قرمز با تهرنگ بنفش به خود میگیرند.
- پسزمینه : پسزمینه رنگ سبز دارد و این باعث کنتراست بالا با پروتوزوآها میشود.
- گلیکوژن: مولکولهای گلیکوژن توسط حلالهای رنگ حل میشوند و به صورت شفاف و بدون رنگآمیزی دیده میشوند، درست مانند خود ارگانیسم.
محدودیتهای رنگآمیزی تریکروم ویتلی
- تخمها و لاروهای هلمینتها: این روش قادر به رنگآمیزی دائمی تخمها و لاروهای هلمینتها نیست.
- نیاز به بزرگنمایی بالا: برای شناسایی و بررسی پروتوزوآها، استفاده از بزرگنمایی بالا و روغن ایمرشن ضروری است. با این حال، برخی مورفولوژیهای پروتوزوآها ممکن است از دست بروند یا دیده نشوند.
- پروتوزوآهای خاص: برخی پروتوزوآها مانند Cryptosporidium parvum و Cyclospora cayetanensis با این رنگآمیزی قابل شناسایی نیستند.
- اسپورهای میکروسپوریدیا: اسپورهای Microsporidia در اسمیرهای رنگآمیزیشده با تریکروم ویتلی قابل مشاهده نیستند.
جمع بندی
رنگآمیزی تریکروم ویتلی یک روش سریع، ساده و حساس برای شناسایی پروتوزوآهای رودهای در نمونههای مدفوع است. این تکنیک با استفاده از اسمیرهای تثبیتشده با PVA یا Schaudinn’s fixative، امکان مشاهده دقیق تروفوزوئیتها و کیستها را فراهم میکند. در عین حال میتواند سلولهای انسانی و مخمرها را نیز تمایز دهد.
با وجود حساسیت بالا، این روش دارای محدودیتهایی است؛ برخی پروتوزوآهای کوچک یا خاص مانند Cryptosporidium و Cyclospora قابل شناسایی نیستند و تخمها یا لاروهای هلمینت با آن رنگ نمیگیرند.
این روش در تشخیص عفونتهای پروتوزوآی رودهای، بررسی مورفولوژی انگلها، شناسایی سلولهای مخمر و سلولهای انسانی کاربرد گسترده دارد و به دلیل ایجاد کنتراست بالا و رنگآمیزی یکنواخت، هنوز یکی از استانداردهای اصلی در آزمایشگاههای انگلشناسی به شمار میرود.
