تکنیک رنگ آمیزی اسید فست ، اصول و نتایج

 رنگ آمیزی اسید فست نوعی تکنیک رنگ آمیزی افتراقی در آزمایشگاه است که برای شناسایی میکروارگانیسم های خاصی  مانند اعضای جنس مایکوباکتریوم استفاده می‌شود. این میکروارگانیسم‌ها با دیواره‌های سلولی موم مانند و تقریباً نفوذناپذیر مشخص می‌شوند. آن‌ها حاوی اسید مایکولیک و مقادیر زیادی اسیدهای چرب، موم ها و لیپیدهای پیچیده هستند. این نوع دیواره سلولی در برابر اکثر ترکیبات (ماننداسیدها) مقاوم است. بنابراین میکروارگانیسم های اسید فست نیاز به تکنیک رنگ آمیزی خاصی دارند.

در این تکنیک ممکن است رنگ‌های آزمایشگاهی مختلفی استفاده شود. برای استفاده از هرکدام نیز ممکن است تکنیک و ترتیب خاصی وجود داشته باشد. در این مطلب قصد داریم به بررسی اصول رنگ‌ آمیزی اسید فست بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

در این تکنیک ممکن است رنگ‌های آزمایشگاهی مختلفی استفاده شود. برای استفاده از هرکدام نیز ممکن است تکنیک و ترتیب خاصی وجود داشته باشد. در این مطلب قصد داریم به بررسی اصول رنگ‌ آمیزی اسید فاست بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

چه زمانی از تکنیک اسید فست استفاده می‌شود؟

تکنیک رنگ‌ آمیزی اسید فست برای شناسایی میکروارگانیسم‌های مقاوم به اسید در آزمایشگاه استفاده می‌شود. باکتری‌های اسید فست دارای غلظت بالایی از اسید مایکولیک (نوعی لیپید) در دیواره سلولی خود هستند. به همین دلیل رنگ‌آمیزی آن‌ها دشوار است. باکتری‌های اسید فست  با روش رنگ‌آمیزی گرم به‌طور ضعیف رنگ می‌شوند. بنابراین برای بررسی آن‌ها معمولا از تکنیک اسید فست استفاده می‌شود.

رنگ مورد استفاده در رنگ آمیزی اسید فست، کاربول فوشین^[۱] است. این ماده محلول در چربی و حاوی فنل است. فنل در این تکنیک یک ماده ضروری است. زیرا باعث تسهیل ورود رنگ به دیواره مومی باکتری می‌شود. برای وارد کردن رنگ اولیه فوشین کربول به دیواره سلولی از بخار استفاده می‌شود. بخار به شل شدن لایه مومی کمک می‌کند و باعث ورود رنگ اولیه به داخل سلول می‌شود. سپس اسمیر با یک رنگ‌زدای بسیار قوی (اسید الکل) شسته می‌شود. این ماده رنگ را از تمام سلول‌های غیر اسید فست پاک می‌کند. سلول‌های غیر اسید فست رنگ‌زدایی شده و رنگ متضادی را به خود جذب می‌کنند (مانند متیلن بلو)

تکنیک رنگ آمیزی اسید فست در شناسایی بیماری‌های ناشی از باکتری‌های اسید فست مفید است. به ویژه سل و جذام. علاوه بر این، از این رنگ برای تعیین وجود باکتری اسید فست از بافت ریه در بیماران تحت درمان با آنتی بیوتیک استفاده می‌شود.

مکانیزم‌های پایداری اسیدی بر اساس گونه‌های باکتریایی متفاوت است. مشهورترین باکتری اسید فست جنس مایکوباکتریوم است. که شامل گونه‌های مسئول بیماری های سل و جذام می باشد. برخی از باکتری‌ها نیز ممکن است تا حدی اسید فست  باشند، مانند نوکاردیا.

ساختار و ترکیب دیواره سلولی اسید فست

باکتری‌های اسید فست گرم مثبت هستند. اما دیواره سلولی اسید فست علاوه بر پپتیدوگلیکان، حاوی مقادیر زیادی گلیکولیپید است. تقریباً ۶۰ درصد از دیواره سلولی را تشکیل می‌دهند.

لایه‌های دیواره سلولی اسید فست که با داخلی‌ترین لایه (نزدیک‌ترین به غشای پلاسمایی) شروع می‌شود، عبارتند از:

لایه ۱: لایه پپتیدوگلیکان

لایه ۲: لایه آرابینوگالاکتان (کربوهیدرات بلندی که از قندهای آرابینوز و گالاکتوز تشکیل شده است)

لایه ۳: غشای خارجی حاوی اسیدهای مایکولیک

لایه ۴: سطح بیرونی با پروتئین‌های سطحی پوشیده شده است. البته در سویه و گونه‌های مختلف باکتری متفاوت است.

برخی از تکنیک‌‌های رنگ آمیزی اسید فست

همانطور که در بخش مقدمه گفته شد، ممکن است از رنگ‌های آزمایشگاهی متفاوتی برای انجام تکنیک رنگ‌ آمیزی اسید فست استفاده شود. در ادامه به بررسی برخی از رایج‌ترین آن‌ها خواهیم پرداخت.

• رنگ زیل نلسون (Ziehl–Neelsen)، انواع کلاسیک و اصلاح شده
• رنگ کینیون (Kinyoun stain)، در پس‌زمینه‌هایی که شناسایی باکتری‌های قرمز دشوار است، می‌توان آبی ویکتوریا را جایگزین فوشین کربول کرد. اسید پیکریک را نیز به‌عنوان ضد لکه به‌جای متیلن بلو استفاده کرد.
• رنگ فایت (Fite stain)
• رنگ الیس و زابرووارنی (Ellis and Zabrowarny stain) (بدون فنل/اسید کربولیک)
• رنگ رودامین اورامین (Auramine-rhodamine stain)
• رنگ فنل اورامین (Auramine phenol stain)

رنگ‌آمیزی میکروارگانیسم‌ها به روش اسید فاست

• یک لام شیشه‌ای را برچسب گذاری کنید. با یک مداد مومی یک دایره در مرکز آن بکشید.
• با استفاده از لوپ استریل شده یک امولسیون استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس را روی لام قرار دهید. (این‌ها باکتری‌های غیر اسید فست شما خواهند بود).
• سپس، یک حلقه از کلنی مایکوباکتریوم اضافه کرده و دو باکتری را با هم مخلوط کنید. (این باکتری اسیدفست  شما است)
• اجازه دهید اسمیر روی لام خشک شود.
• هنگامی که مایع روی لام کاملاً تبخیر شد، لام را سه مرتبه از روی شعله عبور دهید. به این طریق باکتری‌ها را با حرارت ثابت کنید.
• آب را به جوش بیاورید. شما فقط به ۲۰۰ میلی لیتر آب نیاز دارید. هنگامی که آب به جوش آمد، لام را روی بخار آب در حال جوش قرار دهید. می‌توانید برای سهولت کار از جای لام شیاردار استفاده کنید.
• ناحیه اسمیر را با یک دستمال کاغذی مربعی بپوشانید. رنگ کاربول فوشین را با دقت روی دستمال کاغذی بمالید. اگر سهوا رنگ داخل اب در حال جوشیدن ریخت، فورا کار را متوقف کنید. آب را در محل دفع زباله مایع دور بریزید. زیرا دود حاصل از فوشین کربن می‌تواند سمی باشد.
• لام رنگ‌آمیزی شده را به مدت ۷ دقیقه بخار دهید و به طور مداوم رنگ بیشتری بمالید تا دستمال کاغذی خشک نشود.
• به آرامی کاغذ را با فورسپس بردارید و آن را دفع کنید سپس، لام را با آب بشویید.
• رنگ را با ۶ قطره اسید الکل رنگ کنید. سپس با آب بشویید.
• لام را به مدت ۲ دقیقه در متیلن بلو قراردهید.
• لام را با آب بشویید و خشک کنید.
• اسمیر رنگ‌آمیزی شده را زیر لنز شیئی ۱۰۰x با روغن ایمرسیون بررسی و نتایج خود را ثبت کنید.

ساختارهای اسیدی قابل توجه

تعداد بسیار کمی از میکروارگانیسم‌ها دارای ساختار اسیدی هستند. این امر باعث می‌شود رنگ آمیزی اسید فست به ویژه در تشخیص مفید باشد. یرخی از رایج‌ترین میکروارگانیسم‌هایی که ساختار اسیدی دارند در ادامه ذکر شده‌اند.

• مایکوباکتریوم‌ها (mycobacteria)
• اکتینومیست‌ها (Actinomycetes)، به ویژه برخی از هوازی‌ها با اسید مایکولیک در دیواره سلولی خود
• نوکاردیا (Nocardia)، اسیدفاست ضعیف؛ مقاومت در برابر رنگ زدایی با غلظت اسید ضعیف‌تر
• رودوکوکوس (Rhodococcus)
• گوردونیا (Gordonia)
• تسوکامورلا (Tsukamurella)
• دیتزیا (Dietzia)
• سر اسپرم
• هاگ‌های باکتری
• Legionella micdadei
• اجزای سلولی خاص به عنوان مثال اجسام انکلوژن سیتوپلاسمی در نورون‌ها
• اووسیست برخی از انگل‌های کوکسیدین در نمونه های مدفوع مانند کریپتوسپوریدیوم پارووم
• اشکال مخمر قارچی به طور متناقضی با تکنیک اسید فست رنگ آمیزی می‌شوند. در مطالعه‌ای روی قارچ‌های اسید فست، ۶۰ درصد بلاستومایسس‌ها و ۴۷ درصد هیستوپلاسما، رنگ‌آمیزی سیتوپلاسمی مثبت سلول‌های مخمر مانند را نشان دادند و کریپتوکوک یا کاندیدا رنگ‌آمیزی نشدند و رنگ‌آمیزی بسیار نادری در آندوسپورهای Coccidioides مشاهده شد.

تفسیر نتیجه رنگ آمیزی اسید فست

پس از رنگ‌آمیزی، ارگانیسم‌های اسید فست قرمز روشن تا بنفش، میله‌ای شکل، صاف یا کمی خمیده، به صورت منفرد یا در گروه های کوچک ظاهر می‌شوند.

سایر ارگانیسم‌ها نیز به رنگ آبی دیده میشوند. پس زمینه نیز باید آبی رنگ شود.

محدودیت های تکنیک رنگ آمیزی اسید فست

یکی از معایب این تکینیک رنگ آمیزی این است که کاغذ صافی باید مرطوب بماند. این امر ممکن است کمی کار را دشوار کند. همچنین ارگانیسم‌هایی که روی آگار خون کشت می‌شوند ممکن است با کمبود مواد مغذی مواجه شوند. در نتیجه محتوای چربی در غشای خارجی پایین‌تر و رنگ‌آمیزی ضعیف خواهد بود.

سخن پایانی

میکروارگانیسم‌های اسید فست حاوی اسید مایکولیک در غشای بیرونی خود هستند که سلول‌ها را مومی و در برابر رنگ‌آمیزی گرم مقاوم می‌کند. به همین دلیل رنگ آمیزی و بررسی آن‌ها نیازمند تکنیک‌های خاصی است.  به این منظور از گرما و فنل برای نفوذ رنگ به سطح مومی میکروارگانیسم‌های اسیدی استفاده می‌شود. در این مطلب نگاهی کلی بر رنگ‌ آمیزی اسید فاست داشتیم. برای بررسی تصاویر بیشتر می‌توانید به اطلس جامع آزمایشگاهی شرکت پل ایده آل پارس مراجعه کنید.

واژه نامه