راهنمای محیط‌ کشت مورد استفاده در کشت سلول حیوانی

آیا برای کشت سلول حیوانی از محیط کشت مناسب استفاده می‌کنید؟

کشت سلولی یک تکنیک بیوتکنولوژیکی بسیار مهم در دنیای علمی است. می‌توان آن‌را به عنوان بستری تعریف کرد که به درمان بیماری‌های مختلف و توسعه تکنیک‌های تشخیصی مربوطه کمک می‌کند. این تکنیک شامل جداسازی سلول‌های استخراج شده از بدن گیاه، حشره یا حیوان و رشد مصنوعی آن‌ها می‌شود.

بسیاری از محصولات بیوتکنولوژی (مانند واکسن‌های ویروسی) اساساً به کشت سلول حیوانی وابسته هستند. به همین دلیل در این مقاله قصد داریم به موضوع محیط‌ کشت مورد استفاده در کشت سلول حیوانی بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

اصول و کاربردهای کشت سلول حیوانی

همانطور که در بخش مقدمه گفته شد، کشت سلول حیوانی نقش مهمی در حوزه پزشکی و آزمایشگاهی دارد.

 گاهی اوقات پروتئین‌های ساده‌تر با استفاده از rDNA در کشت‌های باکتریایی تولید می‌شوند. اما پروتئین‌های پیچیده‌تری که گلیکوزیله شده‌اند (تغییر شده با کربوهیدرات) در حال حاضر باید در سلول‌های حیوانی ساخته شوند.

کشت سلول حیوانی درحال حاضر برای بررسی عوامل ضد سرطان، آنزیم‌ها، ایمونوبیولوژیک‌ها اینترلوکین‌ها، لنفوکین‌ها، آنتی بادی های مونوکلونال (mABs) و هورمون‌ها استفاده می‌شود.

سلول‌ها در آزمایشگاه‌ها در پتری دیش یا فلاسک‌ها در محیط مناسب و تحت شرایط محیطی بسیار کنترل شده رشد می‌کنند. شرایط محیطی که مورد توجه قرار می‌گیرد عبارتند از PH، دما، اسمولالیته، ترکیب غذایی و غیره.

از همین‌رو، محیط کشت نقش اساسی در تکنیک‌های کشت سلول حیوانی ایفا می‌کند. به‌طور معمول، محیط مورد استفاده در کشت سلول حیوانی دارای اجزایی مانند ویتامین‌ها، اسیدهای آمینه، گلوکز، سرم، نمک‌های معدنی، عوامل چسبندگی و هورمون‌ها است.

مراحل کشت سلول حیوانی

کشت سلول حیوانی به طور کلی شامل مراحل اصلی زیر است:

• برداشت سلول‌ها
• جداسازی سلول‌ها با استفاده از آنزیم‌های مناسب.
• کشت در یک ظرف با محیط رشد مناسب
• کشت در انکوباتور
• انجام روش‌های آزمایشگاهی

ترکیب محیط کشت برای سلول‌های حیوانی

اجزای اصلی برای کشت سلولی حیوانی به شرح زیر است:

• منابع انرژی: گلوکز، فروکتوز، اسیدهای آمینه
• منابع نیتروژن: اسیدهای آمینه
• ویتامین‌ها: معمولاً ویتامین های محلول در آب B و C هستند.
• نمک‌های معدنی: Na+، K+، Ca2+، Mg2+
• چربی و اجزای محلول در چربی: اسیدهای چرب، کلسترول
• آنتی بیوتیک‌ها
• عوامل رشد و هورمون ها
• اکسیژن و CO2

راهنمای محیط‌ کشت مورد استفاده در کشت سلول حیوانی

به طور کلی در کشت بافت حیوانی از 2 نوع محیط کشت استفاده می‌شود:

• محیط کشت طبیعی
• محیط کشت مصنوعی

نوع محیط اساساً به نوع سلولی که باید کشت شود و اهداف آن بستگی دارد.

1- محیط‌ کشت طبیعی

این محیط‌ها معمولا شامل سه نوع ماده زیر هستند:

لخته‌ها: لخته‌های پلاسما رایج ترین لخته‌ها هستند. در حال حاضر، پلاسما به صورت تجاری در حالت مایع یافت می‌شود که می‌تواند در آزمایشگاه مورد استفاده قرار گیرد.

مایعات بیولوژیکی: از چندین مایع بیولوژیکی می‌توان به عنوان محیط کشت استفاده کرد مانند مایع آمنیوتیک، مایع جنب ، همولنف حشرات، آب هومورال چشم، سرم و غیره. در این بین، سرم بیشتر ترجیح داده می‌شود.

عصاره بافت: رایج‌ترین عصاره بافتی که در کشت سلول حیوانی استفاده می‌شود عصاره جنین جوجه است. اما از عصاره جنین گاو نیز استفاده می‌شود. عصاره طحال، کبد، مغز استخوان و لکوسیت‌ها نیز گاهی مورد استفاده قرار می‌‌گیرند. مخلوطی از اسیدهای آمینه و برخی ترکیبات آلی می‌تواند جایگزینی برای عصاره بافت باشد.

طیف وسیعی از سلول‌های استخراج شده از حیوانات را می‌توان به راحتی با استفاده از محیط‌های طبیعی کشت داد. با این وجود مواد موجود در محیط کشت‌های طبیعی به درستی تعریف نشده‌اند. به همین دلیل است که شناخت ترکیب صحیح اجزای موجود در این محیط‌ها دشوار است. به دلیل عدم آگاهی در مورد ترکیب چنین محیط‌های طبیعی، برخی از سلول‌ها قادر به رشد یا تکثیر به میزان مطلوب نیستند.

2-  محیط‌ کشت مصنوعی در کشت سلول حیوانی

محیط‌های مصنوعی معمولاً از مواد مغذی آلی و معدنی تشکیل شده‌اند. محیط کشت‌های مصنوعی همچنین حاوی ویتامین‌ها، کربوهیدرات‌ها، کوفاکتورها، نمک‌ها، سرم و غیره هستند. محیط‌های مصنوعی برای کشت سلول حیوانی از رشد نامحدود سلول‌ها حمایت می‌کنند. انواع مختلفی از محیط‌های مصنوعی وجود دارد که در مقایسه با محیط کشت‌های طبیعی بسیار بهینه‌تر هستند.

محیط کشت مصنوعی در کشت سلول حیوانی معمولا به دلایل زیر مورد استفاده قرار می‌گیرند:

• بقای کوتاه مدت
• بقای طولانی مدت
• رشد نامحدود

محیط‌ مصنوعی در کشت سلول حیوانی را می‌توان به انواع زیر طبقه بندی کرد:

• محیط‌ حاوی سرم
• محیط‌ بدون سرم
• محیط‌ بدون پروتئین
• محیط‌ شیمیایی تعریف شده

3- محیط‌های حاوی سرم

سرم مایع زرد رنگ و شفافی است که پس از حذف فیبرین و سلول‌ها از خون باقی می‌ماند. محیط‌های کشت طبیعی، حدود10-2 درصد سرم دارند. این ماده مواد مغذی اساسی سلول‌ها را تامین می‌کند. همچنین حاوی چندین هورمون و فاکتورهای رشد مختلف است.

رایج‌ترین مکمل مورد استفاده در کشت سلول‌ حیوانی سرم جنین گاوی (FBS) است.

با این حال، وجود سرم در یک محیط کشت سلولی حیوانی می‌تواند معایب بسیار زیادی داشته باشد. به عنوان مثال خطر آلودگی میکروبی.

4- محیط کشت بدون سرم در کشت سلول حیوانی

وجود سرم در مورد مطالعات ایمونولوژیک کشت سلول حیوانی، می‌تواند منجر به تفسیرهای نادرست شود.

محیط کشت‌‌های بدون سرم نیز در کشت سلول حیوانی رایج هستند. این محیط‌ها برای غلبه بر مشکلات ناشی از محیط‌های حاوی سرم، مورد استفاده قرار گرفتند. فرمولاسیون چنین محیطی در ابتدا به‌طور خاص برای حمایت از کشت سلول‌های بنیادی انجام شد. این محیط‌ها همچنین حاوی مقادیر مشخصی از فاکتورهای رشد و پروتئین هستند.

5-  محیط‌های بدون پروتئین

 محیط کشت‌های بدون پروتئین فقط دارای اجزای غیر پروتئینی هستند. استفاده از این محیط‌ها در مقایسه با محیط‌های حاوی سرم باعث رشد بهتر سلول‌ها می‌شود. محیط‌های بدون پروتئین فاقد هر گونه پروتئین هستند و فقط شامل ترکیبات غیر پروتئینی می شوند.

6-  محیط‌های شیمیایی تعریف شده

این محیط‌ها حاوی مواد معدنی و آلی فوق‌العاده خالص و عاری از آلاینده‌ها هستند. همچنین ممکن است حاوی مواد افزودنی پروتئین خالص مانند فاکتورهای رشد باشند.

ترکیبات آن‌ها با اصلاح ژنتیکی در باکتری‌ها یا مخمرها با افزودن ویتامین ها، کلسترول، اسیدهای آمینه خاص و اسیدهای چرب تولید می‌شود.

خواص فیزیکی و شیمیایی محیط کشت

یکی از نکات مهم در کشت سلول حیوانی ، توجه به خواص فیزیکی و شیمیایی محیط کشت است. به منظور ارتقاء رشد و تکثیر خوب سلول های کشت شده، محیط کشت باید دارای خواص فیزیکی و شیمیایی خاصی باشد. در ادامه به بررسی این خواص خواهیم پرداخت.

1- pH:

اکثر سلول‌ها می‌توانند در محدوده pH 7.0-7.4 رشد کنند، اما بسته به نوع سلول تفاوت‌های جزئی وجود دارد. معمولاً از فنل قرمز به عنوان شاخص pH  استفاده می‌شود. این ماده در pH 7.0 نارنجی، در pH 6.5 زرد، زیر pH 6.5 زرد لیمویی، در pH 7.6 صورتی و در pH 7.8 بنفش می‌شود. در pH 7.4 نیز قرمز است.

2- CO2، بی کربنات و بافر:

pH با افزایش CO2 اتمسفر کاهش می‌یابد و محیط اسیدی می‌شود.

3- اکسیژن:

اغلب سلول‌های in vivo برای زنده ماندن به اکسیژن نیاز دارند. اما غلظت بالای اکسیژن در محیط کشت می‌تواند به دلیل تولید رادیکال‌های آزاد سمی باشد. برای کاهش سمیت O2، اغلب افزودن سلنیوم به محیط توصیه می‌شود. زیرا سلنیوم یک کوفاکتور برای سنتز گلوتاتیون است. با این وجود توصیه می‌شود به دستورالعمل‌های آزمایشگاه خود رجوع کنید.

4- درجه حرارت:

به طور خاص، دمای بهینه برای یک کشت سلولی به دمای بدن ارگانیسم بستگی دارد. بنابراین دمای بهینه برای سلول‌های به دست آمده از انسان و حیوانات خون گرم، 37 درجه سانتی گراد است. سلول‌های آزمایشگاهی نمی‌توانند دمای بالاتر را کنترل کنند. اگر دما از 40 درجه سانتی‌گراد فراتر رود، بیشتر آن‌ها می‌میرند.

بنابراین برای نتایج قابل تکرار، حفظ دمای ثابت (0.5 ± درجه سانتیگراد) مهم است. اگر سلول‌ها از پرندگان جمع آوری شوند، دمای بهینه برای کشت اندکی بالاتر است (38.5 درجه سانتیگراد).

دمای کشت برای حیوانات خونسرد (poikilotherms) می تواند حدود 15-25 درجه سانتیگراد باشد. دما علاوه بر تأثیر مستقیم بر رشد سلولی، بر حلالیت CO2 نیز تأثیر می گذارد. دمای بالاتر حلالیت را افزایش می دهد.

5- اسمولالیته:

اسمولاریته یک پارامتر مهم در کشت سلول حیوانی است. زیرا سبب شباهت محیط کشت با محیط طبیعی می‌شود . اگر اسیدها، بازها، داروها و غیره روی محیط اعمال شوند، اسمولاریته تحت تأثیر قرار می‌گیرد.

سخن پایانی

انتخاب محیط مناسب نقش مهمی در کشت سلولی حیوانی دارد. بنابراین، کسب دانش گسترده در مورد تفاوت‌های میان انواع مختلف محیط کشت‌ها  بسیار مهم است. این امر منجر به رشد و نگهداری مناسب سلول‌ها می‌شود. همچنین استفاده بهتر از سلول‌های کشت‌شده را تسهیل می‌کند.