باکتری‌ها عمدتاً بر اساس ترکیبات آلی که می‌توانند تجزیه کنند شناسایی می‌شوند. محدوده ترکیبات مورد استفاده بستگی به مجموعه آنزیم‌هایی دارد که باکتری‌های مختلف قادر به تولید آن هستند.

روش‌های مختلفی برای شناسایی باکتری‌های بیماری‌زا وجود دارد. در بین آن‌ها روش‌های بیوشیمیایی (بیوتایپینگ) همچنان از اهمیت اساسی برخوردار هستند.

در پوستر ” واکنش‌های بیوشیمیایی برای شناسایی باکتری‌های بیماری‌زا” برای دسترسی آسان مجموعه‌ای از تست‌های رایج و متداول که برای شناسایی باکتریی‌های بیماریزای پزشکی مورد استفاده قرار می‌گیرند فراهم شده است. این آزمون‌ها به ترتیب حروف الفباء انگلیسی مربوط به حرف اول نام آن ها مرتب شده‌اند. اطلاعات مربوط به این آزمون‌ها شامل هدف، کاربرد آن‌ها، محدودیت‌ها، منابع خطا و نیز تفسیر نتایج بدست آمده است. این پوستر به صورت رایگان در وبسایت شرکت پل ایده آل پارس موجود است.

در ادامه مروری بر مهم‌ترین واکنش‌های بیوشیمیایی برای شناسایی باکتری‌های بیماری‌زا خواهیم داشت.

تست استفاده از استامید (Acetamide Utilization Test)

آزمون استفاده از استامید یکی از روش‌های بیوشیمیایی تخصصی در میکروب‌شناسی است که برای شناسایی و افتراق برخی باکتری‌های گرم-منفی، به‌ویژه Pseudomonas aeruginosa، بر اساس توانایی آن‌ها در استفاده از استامید به‌عنوان منبع کربن انجام می‌شود.

هدف

تمایز بین باکتری‌ها بر اساس توانایی آن‌ها در استفاده از استامید به‌عنوان تنها منبع کربن.
شناسایی Pseudomonas aeruginosa از سایر باسیل‌های گرم-منفی غیرتخمیرکننده گلوکز.
نتیجه مثبت با رشد باکتری و تغییر رنگ محیط شیب دار (slant) از سبز به آبی پررنگ مشخص می‌شود.
نتیجه منفی با عدم رشد و عدم تغییر رنگ، به‌طوری که محیط شیب دار سبز باقی می‌ماند، مشخص می‌شود.

کاربردها

این آزمون به‌عنوان یک تست کیفی برای تمایز باکتری‌های گرم-منفی به دو گروه اکسیداتیو و تخمیری استفاده می‌شود.
محیط کشت استامید آگار همچنین به‌عنوان محیط انتخابی برای جداسازی aeruginosa به‌کار می‌رود.
این محیط نسخه‌ای تغییر یافته از محیط سیمون سیترات آگار است و برای تعیین توانایی استامید در ایفای نقش منبع کربن در غیاب پپتون یا سایر منابع پروتئینی طراحی شده است.

محدودیت‌ها

رشد بر روی محیط شیب دار بدون تغییر رنگ ممکن است نشانه نتیجه مثبت باشد. با این حال، اگر با ادامه انکوباسیون، رنگ محیط به آبی تغییر نکند، آزمون باید با مقدار تلقیح کمتر تکرار شود.
نتیجه منفی آزمون، احتمال وجود aeruginosa را رد نمی‌کند. بنابراین برای تأیید شناسایی این باکتری، انجام آزمایش‌های تکمیلی ضروری است.
تنها حدود ۳۸٪ از سویه‌های aeruginosa که پیوسیانین تولید نمی‌کنند، نتیجه مثبت در این آزمون نشان می‌دهند. از این رو، تست‌های بیوشیمیایی بیشتری برای شناسایی قطعی توصیه می‌شود.
نباید محیط شیب‌دار (slant) را سوراخ یا “stab” کرد، چرا که این آزمون نیاز به محیط هوازی دارد.
تلقیح نباید از کشت مایع (broth) انجام شود. زیرا احتمال انتقال اجزای محیط قبلی وجود دارد.
باید از تلقیح سبک (light inoculum) استفاده کرد تا از انتقال مواد باقیمانده از محیط قبلی جلوگیری شود.

تست آرژنین دهیدرولاز (Arginine Dihydrolase Test)

تست آرژینین دهیدرولاز (Arginine Dihydrolase Test) یکی از آزمون‌های بیوشیمیایی مهم برای شناسایی و افتراق گونه‌های مختلف باکتری است. به‌ویژه برای تمایز بین گروهPseudomonas syringae و سایر گونه‌های سودوموناس (Pseudomonas spp.) مورد استفاده قرار می‌گیرد.

هدف

این آزمون برای تمایز گروه Pseudomonas syringae از سایر گونه‌های Pseudomonas به‌کار می‌رود.

نتایج مورد انتظار

ایجاد رنگ صورتی تیره (deep pink) نشان‌دهنده واکنش مثبت است.

نکات مهم

هنگام تهیه محیط کشت، مراقب باشید که pH بیش از حد بالا نرود. اگر محیط بیش از حد صورتی شود(pH بالا)، ممکن است تمایز واکنش مثبت دشوار گردد.
آنزیم آرژینین دهیدرولاز از تجزیه آرژینین آمونیوم آزاد می‌کند. قلیایی شدن حاصل توسط معرف pH فنل رد (Phenol Red) نمایش داده می‌شود که در زیر لایه روغن به رنگ صورتی تیره در می‌آید. این در تضاد با رنگ صورتی نارنجی نمونه‌های کنترل (بدون تلقیح) یا کشت‌های منفی است.
در یک آزمون مثبت، میکروارگانیسم ابتدا باید از گلوکز موجود استفاده کند تا pH محیط را کاهش دهد. این فرآیند در ۲۴ ساعت اول انکوباسیون با تغییر رنگ از بنفش به زرد مشخص می‌شود. پس از اسیدی شدن محیط، آنزیم آرژینین دهیدرولاز فعال می‌شود. کشت به مدت ۲۴ ساعت دیگر در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌شود تا میکروارگانیسم بتواند از آرژینین استفاده کند. سپس نتیجه نهایی بررسی می‌شود. بازگشت رنگ از زرد به بنفش نشان‌دهنده نتیجه مثبت برای آرژینین دهیدرولاز است. عدم تغییر رنگ به زرد در ۲۴ ساعت اولیه یا عدم بازگشت به بنفش در ۴۸ ساعت به معنای نتیجه منفی است.

آزمون حساسیت به باسیتراسین (Bacitracin Susceptibility Test)

آزمون حساسیت به باسیتراسین (Bacitracin Susceptibility Test) یکی از تست‌های رایج در میکروب‌شناسی تشخیصی است. این تست به منظور شناسایی افتراقی بین گونه‌های خاصی از استرپتوکوک‌ها و تمایز بین استافیلوکوک‌ها و میکروکوک‌ها انجام می‌شود.

کاربردها

این آزمون برای شناسایی احتمالی و تمایز استرپتوکوک‌های گروه A با خاصیت بتا-همولیتیک ( Streptococcus pyogenesحساس به باسیتراسین) از سایر استرپتوکوک‌های بتا-همولیتیک استفاده می‌شود.
همچنین برای تمایز گونه‌های استافیلوکوک (مقاوم) از میکروکوک‌ها (حساس) کاربرد دارد.

نتایج مورد انتظار

نتیجه مثبت: وجود هر ناحیه عدم رشد (zone of inhibition) بزرگ‌تر از ۱۰ میلی‌متر؛ نشان‌دهنده حساس بودن باکتری است.
نتیجه منفی: عدم وجود ناحیه عدم رشد؛ نشان‌دهنده مقاومت باکتری می باشد.

محدودیت‌ها

عملکرد آزمون به سلامت دیسک آنتی‌بیوتیک بستگی دارد. لذا رعایت شرایط نگهداری مناسب و تاریخ انقضا ضروری است.
محیط کشت باید تازه تهیه شده باشد تا انتشار مؤثر آنتی‌بیوتیک در محیط فراهم شود.
گاهی اوقات استرپتوکوک‌های گروه C و G نیز ممکن است نسبت به باسیتراسین حساسیت نشان دهند.
در هنگام بررسی ایزوله‌ها، استفاده از تلقیح سبک (light inoculum) ممکن است باعث ایجاد ناحیه عدم رشد کاذب شود.

آزمون بایل اسکولین (Bile Esculin Test)

آزمون بایل اسکولین (Bile Esculin Test) یک آزمون بیوشیمیایی مهم برای شناسایی و افتراق باکتری‌های گرم-مثبت، به‌ویژه انتروکوک‌ها و استرپتوکوک‌های گروه D، بر اساس توانایی آن‌ها در هیدرولیز اسکولین در حضور نمک‌های صفراوی است.

هدف

شناسایی Enterococci و استرپتوکوک‌های گروه D بر اساس توانایی آن‌ها در هیدرولیز اسکولین در حضور صفرا (bile)

تمایز بین اعضای Enterococci و استرپتوکوک‌های گروه D از سایر استرپتوکوک‌های ویریدانس (viridans) یا استرپتوکوک‌های غیر گروهD.

کاربردها

این آزمون به‌عنوان یک تست بیوشیمیایی برای جداسازی Enterococci و استرپتوکوک‌های گروه D به‌کار می‌رود.

همچنین برای تمایز این ارگانیسم‌ها از استرپتوکوک‌های ویریدانس و سایر باکتری‌های گرم‌مثبت استفاده می‌شود.

محیط کشت بایل اسکولین آگار، یک محیط انتخابی و افتراقی برای رشد ارگانیسم‌هایی مانند Enterococci، Listeria، و Yersinia enterocolitica است.

محدودیت‌ها

اگر تلقیح سنگین (inoculum) زیاد انجام شود یا غلظت صفرا کمتر از ۴۰٪ باشد، ممکن است برخی از استرپتوکوک‌های گروه ویریدانس (به‌جز S. bovis ) در محیط اسکولین-صفرا واکنش مثبت نشان دهند.

آزمون اسکولین بدون صفرا قابلیت افتراق S. bovis (که قبلاً استرپتوکوک گروه D نامیده می‌شد) از سایر استرپتوکوک‌های ویریدانس را ندارد.

برخی ارگانیسم‌ها ممکن است در حین متابولیسم، گاز H₂S تولید کنند که با یون آهن واکنش داده و کمپلکس سیاه‌رنگ ایجاد می‌کند. این پدیده ممکن است در نتایج آزمون هیدرولیز اسکولین اختلال ایجاد کرده و باعث نتیجه مثبت کاذب شود.

برخی میکروارگانیسم‌ها مانند E. coli دارای آنزیم β-گلوکوزیداز هستند و تنها پس از انکوباسیون طولانی ممکن است نتیجه مثبت نشان دهند. با این حال، اگر هدف آزمون تشخیص β-گلوکوزیداز در سایر ارگانیسم‌ها باشد، نباید از انکوباسیون طولانی استفاده کرد.

آزمون CAMP

آزمون CAMP مخفف (Christie–Atkins–Munch-Peterson) یک تست تشخیصی ساده و مؤثر در میکروب‌شناسی است که برای شناسایی Streptococcus agalactiae و سایر باکتری‌های CAMP-مثبت از جمله Listeria monocytogenes استفاده می‌شود. این تست بر پایه توانایی تولید فاکتور CAMP توسط ارگانیسم مورد بررسی است.

هدف

تمایز Streptococcus agalactiae از سایر استرپتوکوک‌های بتا-همولیتیک.
شناسایی توانایی یک ارگانیسم در تولید فاکتور CAMP
این آزمون برای شناسایی Listeria monocytogenes نیز استفاده می‌شود. زیرا یک ارگانیسم CAMP-مثبت است.
آزمون می‌تواند برای تشخیص توانایی تولید فاکتور CAMP توسط میکروارگانیسم‌ها به‌کار رود.

نتیجه

اگر ارگانیسم مورد آزمایش CAMP مثبت باشد و ویژگی‌های ریخت‌شناسی و بیوشیمیایی (کاتالاز منفی، گرم-مثبت، کوکسی‌های زنجیره‌ای یا جفتی) مطابق با گونه‌های Streptococcus باشد، به عنوان Streptococcus agalactiae گزارش می‌شود. باسیل‌های گرم‌مثبت زیر نیز ممکن است CAMP مثبت باشند:

Rhodococcus equi
Listeria monocytogenes
Propionibacterium avidum/granulosum
Actinomyces neuii
Turicella otitidis
Corynebacterium glucuronolyticum
Corynebacterium coyleae
Corynebacterium imitans
برخی سویه‌های Corynebacterium striatum و گروه Corynebacterium afermentans

محدودیت‌ها

همولیز غیراختصاصی افزایش‌یافته در محل تلاقی خطوط کشت (اثر “چوب کبریت”) ممکن است با برخی دیگر از استرپتوکوک‌ها نیز دیده شود. اما تنها استرپتوکوک‌های گروه B، یک ناحیه مشخص به‌شکل سر پیکان ایجاد می‌کنند. لازم است مورفولوژی کلنی، گروه‌بندی و نوع همولیز گروه B بررسی و تأیید شود.
سویه‌هایی که آزمون CAMP آن‌ها منفی است، ممکن است همچنان agalactiae باشند و به انجام آزمایش‌های تکمیلی نیاز داشته باشند.
pyogenes می‌تواند واکنشی نشان دهد که ممکن است به اشتباه مثبت تفسیر شود. در صورت تردید، باید توجه داشت که S. pyogenes در آزمون PYR (پیرولیدونیل-β-نفتیلامید) مثبت و S. agalactiae منفی است.
آزمون CAMP همچنین Listeria monocytogenes، پاتوژن انسانی، را از اکثر گونه‌های دیگر لیستریا متمایز می‌کند.
اگر ضخامت آگار کم باشد یا محیط بیش از حد همولیز شده باشد، واکنش ممکن است ضعیف یا غیرقابل تشخیص شود.

آزمون کاتالاز (Catalase Test)

آزمون کاتالاز یکی از تست‌های سریع و ابتدایی در میکروب‌شناسی است که بر اساس توانایی باکتری‌ها در تجزیه پراکسید هیدروژن (H₂O₂) به آب و اکسیژن، به‌منظور شناسایی و تمایز بین گروه‌های مختلف باکتری‌ها، از جمله استافیلوکوک، استرپتوکوک، مایکوباکتریوم و سایر گونه‌ها انجام می‌شود.

هدف

باکتری‌های از نظر ریخت‌شناسی مشابه مانند Enterococcus یا Streptococcus (کاتالاز منفی) و Staphylococcus (کاتالاز مثبت) را می‌توان با این آزمون از هم تمایز داد.
همچنین برای افتراق بین باکتری‌های هوازی و بی‌هوازی اجباری مفید است.
آزمون کاتالاز نیمه‌کمّی (Semiquantitative catalase test) برای شناسایی Mycobacterium tuberculosis به‌کار می‌رود.
به‌منظور تمایز گونه‌های هواپذیر (aerotolerant) Clostridium (کاتالاز منفی) از گونه‌های Bacillus (کاتالاز مثبت) استفاده می‌شود.
این آزمون به‌عنوان ابزاری کمکی برای شناسایی اعضای خانواده Enterobacteriaceae نیز کاربرد دارد.

محدودیت‌ها

نمونه باکتریایی نباید از محیط بلاد آگار (Blood agar) گرفته شود، زیرا گلبول‌های قرمز حاوی آنزیم کاتالاز هستند و ممکن است باعث ایجاد نتیجه مثبت کاذب شوند.
کشت باید بین ۱۸ تا ۲۴ ساعت سن داشته باشد.
پراکسید هیدروژن باید تازه تهیه شده باشد، زیرا ناپایدار است و به‌مرور تجزیه می‌شود.
نباید از لوپ فلزی حاوی آهن استفاده کرد.
برخی باکتری‌ها آنزیمی به نام پراکسیداز تولید می‌کنند که پراکسید هیدروژن را تجزیه می‌کند و ممکن است منجر به واکنش ضعیف مثبت (تولید آهسته و اندک حباب‌ها) شود. این واکنش نباید با واکنش مثبت واقعی اشتباه گرفته شود.
نباید ارگانیسم را مستقیماً به معرف اضافه کرد. به‌ویژه اگر از لوپ‌های فلزی حاوی آهن استفاده شده باشد. زیرا تماس آهن با پراکسید هیدروژن می‌تواند باعث نتیجه مثبت کاذب شود.

آزمون کواگولاز (Coagulase Test)

آزمون کواگولاز برای تمایز Staphylococcus aureus (کواگولاز مثبت) که آنزیم کواگولاز تولید می‌کند، از گونه‌هایی مانند S. epidermidis و S. saprophyticus (کواگولاز منفی) که فاقد این آنزیم هستند، استفاده می‌شود.
به این گروه دوم، یعنی استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی، به اختصار CONS گفته می‌شود که مخفف Coagulase Negative Staphylococcus است.

ارگانیسم‌های کواگولاز مثبت

Staphylococcus aureus

و برخی باکتری‌های حیوانی مانند:

Staphylococcus pseudintermedius

Staphylococcus intermedius

Staphylococcus schleiferi

Staphylococcus delphini

Staphylococcus hyicus

Staphylococcus lutrae

ارگانیسم‌های کواگولاز منفی (CONS)

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus saprophyticus

Staphylococcus warneri

Staphylococcus hominis

Staphylococcus caprae

و سایر گونه‌های مشابه

آزمون استفاده از سیترات (Citrate Utilization Test)

آزمون استفاده از سیترات یکی از تست‌های بیوشیمیایی مهم برای شناسایی باکتری‌های گرم‌منفی روده‌ای (Enterobacteriaceae) است که بر پایه توانایی آن‌ها در استفاده از سیترات به‌عنوان تنها منبع کربن طراحی شده است.

واکنش مثبت

رشد باکتری همراه با تغییر رنگ محیط شیب‌دار (slant) از سبز به آبی پررنگ.

مثال از باکتری‌های با واکنش مثبت:

Salmonella
Edwardsiella
Citrobacter
Klebsiella
Enterobacter
Serratia
Providencia

واکنش منفی

عدم رشد باکتری و عدم تغییر رنگ؛ محیط شیب دار همچنان سبز باقی می‌ماند.

مثال از باکتری‌های با واکنش منفی:

Escherichia
Shigella
Morganella
Yersinia

آزمون DNase

آزمون DNase یکی از تست‌های بیوشیمیایی مهم برای بررسی توانایی باکتری‌ها در تولید آنزیم دزوکسی‌ریبونوکلئاز (DNase) است. این آنزیم قادر است DNA را تجزیه کند و به عنوان یک ابزار تمایز بین گونه‌های خاصی از باکتری‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.

هدف

بررسی توانایی یک میکروارگانیسم در تولید آنزیم
تمایز و شناسایی Staphylococcus aureus از سایر گونه‌های استافیلوکوک.

کاربردها

برای تشخیص توانایی یک میکروارگانیسم در تولید آنزیم DNase استفاده می‌شود.
برای تمایز aureus از سایر گونه‌های Staphylococcus کاربرد دارد.
برای شناسایی گونه‌هایSerratia نیز مفید است، چرا که این باکتری آنزیم DNase تولید می‌کند و می‌توان با آن، سویه‌های غیررنگدانه‌دار را از سایر اعضای خانواده Enterobacteriaceae جدا کرد.

محدودیت‌ها

استفاده از تلقیح بیش از حد یا گسترده ممکن است باعث بی‌رنگ شدن کامل محیط شود که ناشی از کاهش رنگ است؛ در این موارد آزمون باید تکرار شود.
محیط حاوی رنگ متیل گرین برای باکتری‌هایی مانند باسیل‌های گرم منفی مناسب‌تر است، چرا که ابتدا در محیط رشد کرده و سپس نتیجه مثبت نشان می‌دهند.
در مورد Moraxella و کوکسی‌های گرم مثبت با استفاده از رنگ Toulidine green O، تلقیح کم ممکن است باعث نتیجه منفی کاذب شود، چرا که این باکتری‌ها ممکن است به خوبی در محیط رشد نکنند.

آزمایش دکربوکسیلاز (Decarboxylase Test)

آزمایش دکربوکسیلاز یکی از روش‌های مهم در میکروبیولوژی برای تشخیص توانایی باکتری‌ها در شکستن آمینواسیدهاست و به‌ویژه در شناسایی باکتری‌های خانواده Enterobacteriaceae کاربرد دارد.

اصل آزمایش

محیط‌های حاوی آرژنین، لیزین و اورنیتین دکربوکسیلاز برای بررسی توانایی یک میکروارگانیسم در دکربوکسیله کردن یا هیدرولیز آمینواسیدها به کار می‌روند. در این فرایند، آمین تولید شده و باعث قلیایی شدن محیط می‌گردد.

محیط پایه معمولاً بر اساس فرمول Moeller است و حاوی پپتون گوشت و عصاره گوشت گاو است که مواد مغذی نیتروژن‌دار را برای رشد باکتری فراهم می‌کند.

این محیط دارای گلوکز به‌عنوان کربوهیدرات قابل تخمیر و پیریدوکسال (Pyridoxal) به‌عنوان کوفاکتور آنزیمی است که فعالیت دکربوکسیلاز را افزایش می‌دهد. نشانگرهای pH شامل بروم‌کروزول بنفش bromcresol purple و کروزول قرمز (cresol red) هستند.

آمینواسیدهایی مانند آرژنین، لیزین و اورنیتین به صورت جداگانه به محیط پایه افزوده می‌شوند تا تولید آنزیم دکربوکسیلاز برای هرکدام بررسی شود.

با تخمیر گلوکز در محیط، اسید تولید شده و pH کاهش می‌یابد؛ این موجب تغییر رنگ محیط از بنفش به زرد می‌شود.

اگر باکتری آنزیم دکربوکسیلاز تولید کند، واکنش دکربوکسیلاسیون یا هیدرولیز در پاسخ به pH اسیدی انجام می‌شود.

دکربوکسیلاسیون منجر به تولید محصولات نهایی قلیایی (آمین‌ها) شده و رنگ محیط مجدداً به بنفش بازمی‌گردد.

در صورتی که باکتری قادر به تخمیر گلوکز نباشد، محیط به رنگ زرد تغییر نمی‌کند. در این صورت می‌توان آزمایش را با استفاده از لوله کنترل فاقد آمینواسید ادامه داد.

لایزین دکربوکسیلاسیون موجب تولید کاداورین (Cadaverine)، دکربوکسیلاسیون اورنیتین منجر به تولید پوتریسین (Putrescine)، و دکربوکسیلاسیون آرژینین منجر به آگماتین (Agmatine) می‌شود که سپس توسط دی‌هیدرولاز به پوتریسین تبدیل می‌شود.

در واکنش دیگر، آنزیم آرژنین دی‌هیدرولاز آرژنین را به سیترولین (Citrulline) و سپس به اورنیتین و در نهایت پوتریسین تبدیل می‌کند.

دکربوکسیلاسیون واکنشی بی‌هوازی است.بنابراین محتوای هر لوله باید با روغن یا پارافین پوشانده شود.

هدف

بررسی توانایی میکروارگانیسم برای تولید آنزیم دکربوکسیلاز.
افتراق بین اعضای خانواده Enterobacteriaceae بر اساس توانایی در تولید آنزیم‌های دکربوکسیلاز.

تفسیر نتایج

نتیجه مثبت: محیط کدر با رنگ بنفش متمایل به زرد روشن (قلیایی).

نتیجه منفی: رنگ زرد شفاف و روشن (اسیدی) یا بدون تغییر (در باکتری‌های غیرتخمیرکننده).

لوله کنترل باید رنگ اولیه خود را حفظ کرده یا به رنگ زرد درآید. کدورت یا رنگ بنفش در لوله کنترل موجب بی‌اعتباری نتیجه می‌شود و نتایج مشکوک باید با لوله کنترل مقایسه شوند.

کاربردها

افتراق میان اعضای خانواده Enterobacteriaceae که از نظر ویژگی‌های فیزیولوژیکی به یکدیگر نزدیک هستند.
آزمایش آرژینین دکربوکسیلاز برای شناسایی گونه‌های Enterococcus کاربرد دارد:
Enterococcus faecalis و Enterococcus faecium مثبت هستند. در حالی که Enterococcus avium منفی است.
لایزین دکربوکسیلاز در افتراق بین سالمونلا (مثبت) و شیگلا (منفی) کاربرد دارد.

محدودیت‌ها

باید از یک لایه روغن معدنی یا ماده‌ای مشابه برای پوشش سطح لوله استفاده شود تا از تغییر قلیایی به‌دلیل اکسیداسیون جلوگیری شود.
تفسیر نتایج نباید قبل از ۱۸ تا ۲۴ ساعت انکوباسیون انجام شود. تفسیر زودهنگام می‌تواند منجر به نتایج نادرست شود، زیرا تخمیر گلوکز معمولاً در ۱۰ تا ۱۲ ساعت ابتدایی رخ می‌دهد که برای تولید آنزیم دکربوکسیلاز ضروری است.
میکروارگانیسم‌های غیرتخمیرکننده ممکن است فعالیت دکربوکسیلازی ضعیفی داشته باشند و مقدار کافی آمین برای تغییر pH تولید نکنند. اما برخی از آن‌ها ممکن است آمین کافی تولید کنند تا رنگ بنفش عمیقی در مقایسه با لوله کنترل ایجاد کنند.
رنگ خاکستری ممکن است به‌دلیل کاهش نشانگر باشد نه تولید محصول قلیایی. در این موارد افزودن بروم‌کروزول بنفش اضافی به تشخیص کمک می‌کند.
در صورت مشاهده دو لایه با رنگ متفاوت، لوله باید به‌آرامی تکان داده شود و سپس نتیجه تفسیر گردد.
باکتری‌های غیرتخمیرکننده گلوکز که آرژنین مثبت هستند، باید نسبت به لیزین و اورنیتین منفی باشند.

تست هیدرولیز اسکولین (Esculin Hydrolysis Test)

این تست در میکروبیولوژی برای شناسایی توانایی باکتری‌ها در تجزیه‌ی ترکیب اسکولین استفاده می‌شود. واکنش مثبت به هیدرولیز اسکولین نشانه‌ای از حضور آنزیم اسکولیناز در ارگانیسم است و در شناسایی برخی باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی اهمیت دارد.

هدف

بررسی توانایی یک ارگانیسم میکروبی در هیدرولیز اسکولین از طریق تولید آنزیم اسکولیناز.
شناسایی و تفکیک اعضای خانواده انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae).

کاربردها

تست هیدرولیز اسکولین برای شناسایی طیف گسترده‌ای از میکروارگانیسم‌ها استفاده می‌شود، از جمله:
- خانواده Enterobacteriaceae
- گونه‌های استرپتوکوک
- باکتری‌های لیستریا
- باسیل‌های گرم منفی غیرتخمیرکننده،
- باکتری‌های بی‌هوازی (Anaerobes).
این تست می‌تواند برای بررسی توانایی ارگانیسم در هیدرولیز اسکولین یا تولید آنزیم اسکولیناز انجام شود.
با افزودن محلول صفراوی (bile)، تست به‌صورت انتخابی برای گونه‌های استرپتوکوک قابل انجام است.

محدودیت‌ها

برخی ارگانیسم‌ها در طی متابولیسم، گاز هیدروژن سولفید (H₂S) تولید می‌کنند که ممکن است با آهن واکنش داده و کمپلکس سیاه‌رنگ ایجاد کند. این واکنش می‌تواند در تفسیر تست هیدرولیز اسکولین اختلال ایجاد کند. بنابراین، برای باسیل‌های گرم منفی، لوله‌هایی که پس از افزودن معرف تیره می‌شوند باید زیر نور فرابنفش (UV) بررسی شوند.
برخی میکروارگانیسم‌ها مانند E. coli دارای β-گلوکوزیداز القایی هستند و فقط پس از انکوباسیون طولانی (تا ۷ روز) نتیجه مثبت می‌دهند. با این حال، اگر هدف از انجام تست، شناسایی فقط β-گلوکوزیداز ساختاری (constitutive) باشد، نباید از انکوباسیون طولانی استفاده کرد.

تست هیدرولیز ژلاتین (Gelatin Hydrolysis Test)

تست هیدرولیز ژلاتین یکی از تست‌های مهم آنزیمی در میکروبیولوژی است که برای بررسی توانایی باکتری‌ها در تجزیه ژلاتین توسط آنزیم ژلاتیناز به کار می‌رود. این تست به‌ویژه در تشخیص باکتری‌های بیماری‌زا و تفکیک آن‌ها از گونه‌های غیر بیماری‌زا کاربرد زیادی دارد.

هدف

بررسی توانایی یک ارگانیسم در مایع‌سازی (liquefy) ژلاتین از طریق تولید آنزیم ژلاتیناز (gelatinase).
تفکیک و دسته‌بندی میکروارگانیسم‌ها بر اساس توانایی آن‌ها در تجزیه ژلاتین.

تفسیر نتایج

📌 روش لوله‌ای (Tube Test)

نتیجه مثبت: مایع شدن جزئی یا کامل ژلاتین در لوله آزمایش.
نتیجه منفی: سفت و جامد ماندن کامل ژلاتین پس از سرد کردن در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد.

📌 روش پلیت (Plate Method)

نتیجه مثبت: مشاهده ناحیه شفاف در اطراف کلونی‌ها پس از افزودن کلرید جیوه (HgCl₂).
نتیجه منفی: عدم وجود ناحیه شفاف در اطراف کلونی‌ها پس از افزودن کلرید جیوه.

کاربردها

بررسی توانایی میکروارگانیسم در تولید آنزیم ژلاتیناز.
شناسایی باکتری‌های Serratia، Pseudomonas، Flavobacterium و Clostridium.
تفکیک باکتری Staphylococcus aureus (بیماری‌زا و ژلاتیناز مثبت) از Staphylococcus epidermidis (غیر بیماری‌زا و ژلاتیناز منفی)
تمایز بین باکتری‌های تولیدکننده ژلاتیناز مانند Serratia و Proteus از سایر اعضای خانواده Enterobacteriaceae.

محدودیت‌ها

آنزیم ژلاتیناز عمدتاً در سطح محیط لوله کشت اثر می‌گذارد. تکان دادن لوله در حالت گرم می‌تواند منجر به نتیجه منفی کاذب شود.
ژلاتین بسته به نوع آن ممکن است در توانایی تشکیل ژل متفاوت باشد. بنابراین، لازم است یک لوله کنترل (بدون تلقیح) همراه با نمونه آزمایشی در یخچال نگهداری شود.
در روش لوله‌ای، نتایج مثبت کاذب ممکن است در برخی محیط‌ها یا در حضور سالین در انکوباسیون‌های طولانی‌تر از ۴ ساعت رخ دهد؛ که با بررسی لوله کنترل قابل تشخیص است.
روش پلیت برای گونه‌های سخت‌گیر (fastidious) و بی‌هوازی‌های اجباری مناسب نیست.
اگر لوله‌ها در دمای بالاتر از ۲۰ درجه سانتی‌گراد انکوبه شوند، لازم است قبل از خواندن نتیجه، آن‌ها تا زیر ۲۰ درجه خنک شوند تا واکنش به درستی انجام شود.

تست هیدرولیز هیپورات (Hippurate Hydrolysis Test)

هدف

بررسی توانایی باکتری در تولید آنزیم هیپوریکاز (hippuricase) که موجب هیدرولیز بستر هیپورات می‌شود.
افتراق بین باکتری‌ها بر اساس توانایی آن‌ها در هیدرولیز هیپورات.

کاربردها

برای افتراق گونه‌های مختلف جنس Streptococcus، به‌ویژه تمایز گروه B از گروه‌های A، C، F و G که توانایی هیدرولیز هیپورات را ندارند.
جهت شناسایی احتمالی باکتری‌هایی مانند Gardnerella vaginalis، Campylobacter jejuni، و Listeria monocytogenes.
شناسایی توانایی تولید آنزیم هیپوریکاز در باکتری‌ها.

محدودیت‌ها

همه‌ی سویه‌های Streptococcus agalactiae همولیتیک نیستند و برخی از گروه‌های Viridans streptococci ممکن است نتیجه مثبت کاذب بدهند. بنابراین برای کلونی‌های غیرهمولیتیک تست‌های تکمیلی نیاز است.
تعداد کمی از انتروکوک‌ها (Enterococci) ممکن است همولیتیک باشند و هیپورات را هیدرولیز کنند، ولی در تست PYR (pyrrolidonyl-β-naphthylamide) مثبت هستند.
درصد کمی از سویه‌های Campylobacter jejuni ممکن است در این تست منفی باشند و نیاز به روش‌های جایگزین برای شناسایی دارند.
نتیجه منفی این تست، شناسایی Gardnerella vaginalis را رد نمی‌کند؛ زیرا برخی از بیوتیپ‌های مولد واژینوزیس باکتریایی ممکن است در این تست منفی باشند.
اگر زمان انکوباسیون با معرف نینهیدرین (ninhydrin) بیش از ۳۰ دقیقه باشد، احتمال نتیجه مثبت کاذب وجود دارد.
معرف هیپورات در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد در عرض ۷ روز کیفیت خود را از دست می‌دهد.
استفاده از تلقیح با مقدار کم ممکن است باعث نتیجه منفی کاذب شود.
این تست نباید به‌عنوان تست تأییدی در نظر گرفته شود و برای شناسایی قطعی باید از روش‌های ایمونولوژیکی، مولکولی یا طیف‌سنجی جرمی استفاده شود.

تست ایندول (Indole Test)

تست ایندول در میکروبیولوژی ابزاری کلیدی برای تشخیص افتراقی باکتری‌های گرم منفی و برخی گرم مثبت است.

کاربردها

تست ایندول به‌منظور بررسی توانایی باکتری‌ها در تجزیه اسید آمینه تریپتوفان و تولید ترکیب ایندول انجام می‌شود. این تست نقش مهمی در شناسایی افتراقی باکتری‌ها دارد:

افتراق بین Proteus mirabilis (ایندول منفی) و سایر گونه‌های Proteus (ایندول مثبت)
افتراق بین Klebsiella pneumoniae (ایندول منفی) و Klebsiella oxytoca (ایندول مثبت)
افتراق بین Citrobacter freundii (ایندول منفی) و Citrobacter koseri (ایندول مثبت)

نتیجه مثبت

تغییر رنگ به صورتی تا قرمز گیلاسی (تشکیل حلقه قرمز در لایه معرف در سطح محیط کشت) ظرف چند ثانیه پس از افزودن معرف.

باکتری‌های ایندول مثبت

Aeromonas hydrophila
Aeromonas punctata
Bacillus alvei
Edwardsiella sp.،
Escherichia coli
Flavobacterium sp.
Haemophilus influenza
Klebsiella oxytoca
گونه‌های Proteus به‌جز mirabilis و P. penneri
Plesiomonas shigelloides
Pasteurella multocida
Pasteurella pneumotropica
Enterococcus faecalis
Vibrio sp.

نتیجه منفی

عدم تغییر رنگ حتی پس از افزودن معرف مناسب.

باکتری‌های ایندول منفی

Actinobacillus spp.
Aeromonas salmonicida
Alcaligenes sp.
اکثر گونه‌هایBacillus
Bordetella sp.
Enterobacter sp.
Lactobacillus spp اکثر گونه‌های
Haemophilus
اکثر گونه‌های Klebsiella
Neisseria sp.
Pasteurella haemolytica
Pasteurella ureae
Proteus mirabilis
Proteus penneri،
Pseudomonas sp.
Salmonella sp.
Serratia sp.
Yersinia sp.

محدودیت‌ها

تست ایندول به‌تنهایی کافی نیست و باید همراه با سایر تست‌های بیوشیمیایی برای شناسایی کامل باکتری‌ها استفاده شود.
روش لوله‌ای (tube test) نسبت به روش نقطه‌ای (spot test) حساس‌تر و دقیق‌تر است.
در روش نقطه‌ای، معرف Kovac’s را می‌توان به‌جای معرف DMACA استفاده کرد؛ اما حساسیت آن کمتر است.
معرف Kovac’s برای شناسایی باکتری‌های بی‌هوازی توصیه نمی‌شود؛ در عوض، معرف DMACA مناسب‌تر است.
محیط‌های حاوی پپتون‌های نامناسب ممکن است باعث نتایج نادرست شوند؛ باید ابتدا روی باکتری‌های شناخته‌شده تست شود.
محیط‌های حاوی گلوکز مناسب برای تست ایندول نیستند؛ زیرا تولید اسید مانع تولید ایندول می شود. محیط Mueller Hinton agar نیز به دلیل تخریب تریپتوفان (درطول هیدرولیز اسیدی کازئین) مناسب نیست.
محیط‌های رنگی مانند MacConkey و EMB به دلیل تداخل رنگ، منبع مناسبی برای تلقیح در تست ایندول نیستند.
کلونی‌های ایندول مثبت ممکن است در اثر انتشار ایندول به داخل محیط باعث نتایج مثبت کاذب در کلونی‌های ایندول منفی مجاور خودشان شود. برای جلوگیری از این واکنش های مثبت کاذب، کلونی‌های با مرفولوژی مختلف با فاصله حداقل ۵ میلی‌متر از یکدیگر را انتخاب کنید.

آزمایش IMViC

هدف‌ها

بررسی برخی ویژگی‌های بیوشیمیایی مانند تولید ایندول، تولید اسید، تولید استیل‌متیل‌کربینول (استئویین) و استفاده از سیترات در باکتری‌های ناشناس جداشده به منظور شناسایی و تعیین هویت آن‌ها.
تفکیک و شناسایی انتخابی اعضای خانواده (Enterobacteriaceae) انتروباکتریاسه.

باکتری‌های ایندول مثبت

Escherichia coli، Klebsiella oxytoca، Vibrio cholerae، Proteus vulgaris، Porphyromonas asaccharolytica، گونه‌های Vibrio، گونه‌های Flavobacterium، گونه‌های Providencia، Enterococcus faecalis، Haemophilus influenzae، Morganella morganii، گونه‌های Aeromonas، Citrobacter koseri

باکتری‌های ایندول منفی

Klebsiella pneumoniae، Proteus mirabilis، گونه‌های Salmonella، گونه‌های Shigella، Citrobacter freundii، Pseudomonas aeruginosa، Bacteroides fragilis، Staphylococcus aureus

باکتری‌های MR مثبت (Methyl Red)

Escherichia coli، گونه‌های Salmonella، گونه‌های Shigella، گونه‌های Citrobacter، گونه‌های Proteus، گونه‌های Yersinia، گونه‌های Edwardsiella، Staphylococcus aureus

باکتری‌های MR منفی

Klebsiella pneumoniae، گونه‌های Enterobacter، گونه‌های Hafnia، Serratia marcescens

باکتری‌های VP مثبت (Voges-Proskauer)

گونه‌های Klebsiella، گونه‌های Enterobacter، استرپتوکوک‌های ویریدانس (به جز S. mitis و S. vestibularis)، Proteus mirabilis، گونه‌های Hafnia، گونه‌های Serratia، Staphylococcus aureus

باکتری‌های VP منفی

گونه‌های Escherichia، Proteus vulgaris، Citrobacter freundii

باکتری‌های سیترات مثبت

گونه‌های Klebsiella، گونه‌های Citrobacter، Serratia marcescens، Proteus mirabilis، گونه‌های Enterobacter، گونه‌های Salmonella (به‌جز Salmonella Typhi و Paratyphi A)، گونه‌های Edwardsiella، گونه‌های Providencia

باکتری‌های با نتیجه متغیر در آزمون سیترات

Proteus vulgaris، Vibrio cholerae، Vibrio parahaemolyticus

باکتری‌های سیترات منفی

Escherichia coli، گونه‌های Shigella، Salmonella Typhi و Paratyphi A، گونه‌های Yersinia، Morganella morganii، Staphylococcus aureus و غیره

کاربردها

این آزمون به طور معمول در آزمایشگاه‌های بالینی، تحقیقاتی و آموزشی برای شناسایی باکتری‌های ناشناس تا سطح جنس (Genus) مورد استفاده قرار می‌گیرد.
به همراه آزمایش اوره‌آز و TSI (تریپل شوگر آیرون)، می‌توان با استفاده از این آزمون اعضای خانواده Enterobacteriaceae را تفکیک و شناسایی کرد.
برخی از تست‌ها برای افتراق گونه‌های یک جنس خاص استفاده می‌شوند. به عنوان مثال، آزمون ایندول برای افتراق بین oxytoca و K. pneumoniae، C. koseri و C. freundii، P. vulgaris و P. mirabilis به‌کار می‌رود.

محدودیت‌ها

این آزمون به تنهایی برای شناسایی کامل باکتری تا سطح گونه کافی نیست. حتی برای تفکیک اعضای Enterobacterales نیز به آزمون‌های تکمیلی نیاز است.
جنس‌های مختلف ممکن است نتایج مشابهی بدهند که باعث ابهام در تفسیر نتایج می‌شود.
این آزمون‌ها مبتنی بر کشت هستند، بنابراین به زمان بیشتری نیاز دارند. برخی باکتری‌ها بیش از ۲ روز زمان نیاز دارند تا واکنش VP را نشان دهند، و برای تست سیترات ممکن است نیاز به بیش از ۴ روز انکوباسیون باشد.
تنها باکتری‌هایی که قابلیت رشد در محیط کشت را دارند، با این آزمون قابل شناسایی هستند.
کل فرآیند پیچیده است و نیازمند مهارت بالا در کشت و منابع گوناگون برای انجام صحیح مراحل آزمایش است.
در صورت عدم رعایت مدت زمان مناسب انکوباسیون یا استفاده از معرف‌های قدیمی یا نامناسب، امکان بروز نتایج مثبت یا منفی کاذب وجود دارد.

آزمایش KIA (Kligler’s Iron Agar Test)

آزمایش KIA یک آزمون بیوشیمیایی است که توانایی‌های متفاوت باکتری‌ها را در تخمیر گلوکز و/یا لاکتوز یا عدم توانایی در تخمیر آن‌ها و همچنین توانایی تولید گاز H₂S (سولفید هیدروژن) مورد بررسی قرار می‌دهد.

اهداف

تفکیک باسیل‌های روده‌ای گرم‌منفی (Gram-negative enteric bacilli)
بررسی توانایی باکتری در تولید H₂S، گاز، و اسید از طریق تخمیر گلوکز، لاکتوز یا هر دو
افتراق بین باکتری‌های تخمیرکننده لاکتوز و غیرتخمیرکننده لاکتوز

نتایج و تفسیر

رنگ قرمز در شیب محیط و انتهای زرد یا قلیایی /اسیدی

نشان‌دهنده تخمیر گلوکز و عدم تخمیر لاکتوز است.

رنگ زرد در شیب و انتهای زرد (Yellow/Yellow یا اسیدی (A)/اسیدی

نشان‌دهنده تخمیر لاکتوز (یا فقط لاکتوز یا تخمیر هم‌زمان لاکتوز و گلوکز) است.

رنگ قرمز در شیب و انتهای قرمز یا قلیایی /قلیایی

نشان‌دهنده عدم تخمیر گلوکز و لاکتوز است.

سیاه شدن محیط یا تشکیل لکه‌های سیاه

نشان‌دهنده تولید گاز H₂S است.

ترک‌خوردگی محیط، تشکیل حباب گاز یا ایجاد فاصله در محیط

نشان‌دهنده تولید گاز در اثر تخمیر است.

کاربردها

شناسایی باسیل‌های گرم‌منفی
شناسایی و تفکیک اعضای خانواده Enterobacteriaceae
افتراق گونه‌های Salmonella از Shigella
افتراق بین باکتری‌های تخمیرکننده لاکتوز و غیرتخمیرکننده لاکتوز
شناسایی تولید H₂S
غربالگری کشت‌های مدفوعی

محدودیت‌ها

این آزمون دارای چارچوب زمانی دقیقی است و توصیه می‌شود نتیجه بین ۱۸ تا ۲۴ ساعت بعد از انکوباسیون بررسی شود؛ نه زودتر و نه دیرتر.
تخمیر لاکتوز به‌تنهایی و تخمیر هم‌زمان با گلوکز، هر دو نتیجه‌ی مشابهی ایجاد می‌کنند؛ بنابراین این آزمون برای افتراق دقیق بین این دو مناسب نیست.
تولید H₂S باعث سیاه شدن محیط می‌شود که می‌تواند مشاهده رنگ واقعی شیب و انتها را دشوار کند.
این آزمون به‌تنهایی قطعی نیست و برای شناسایی کامل نیاز به نتایج دیگر آزمون‌های بیوشیمیایی دارد.

آگار لیزین آهن (Lysine Iron Agar – LIA)

کاربردها

این محیط برای تفکیک ارگانیسم‌های روده‌ای (انتریک) بر اساس توانایی آن‌ها در دکربوکسیله یا دآمینه کردن لیزین و همچنین تولید گاز H₂S سولفید هیدروژن توصیه می‌شود.
محیط LIA، محیطی حساس برای تشخیص گونه‌های Salmonella تخمیرکننده و غیرتخمیرکننده لاکتوز است.
این آگار به‌ویژه برای افتراق باسیل‌های گرم‌منفی بسیار مفید است — به‌خصوص در میان اعضای خانواده
گونه‌های Proteus و Providencia ممکن است به‌صورت پیش‌فرض با استفاده از این محیط شناسایی شوند، زیرا آن‌ها رنگ قرمز در شیب و انتهای قلیایی ایجاد می‌کنند.

محدودیت‌ها

توصیه می‌شود برای شناسایی کامل از آزمایش‌های بیوشیمیایی، ایمنی‌شناسی، مولکولی یا طیف‌سنجی جرمی (Mass Spectrometry) بر روی کلونی‌های به‌دست‌آمده از کشت خالص استفاده شود.
بسیار مهم است که عمق انتهای محیط کشت (butt) با لوپ سوراخ شود. عدم سوراخ کردن انتها، نتیجه آزمون را بی‌اعتبار می‌سازد.
حساسیت LIA در تشخیص H₂S کمتر از محیط‌های حاوی آهن دیگر مانند محیط SIM (Sulfide Indole Motility) و TSIA است.
گونه‌های Proteus که H₂S تولید می‌کنند، ممکن است رنگ سیاه در محیط ایجاد نکنند.
برخی گونه‌ها یا سویه‌ها ممکن است پاسخ تأخیری داشته یا اصلاً نتوانند قند مورد نظر را به شیوه معمول تخمیر کنند.
تولید گاز ممکن است در ارگانیسم‌هایی به‌جز گونه‌های Citrobacter به‌طور نامنظم یا سرکوب‌شده اتفاق بیفتد.

محیط آبگوشت مالونات (Malonate Broth)

آزمون مالونات در ابتدا برای تمایز بین Escherichia و Enterobacter طراحی شده بود.
امروزه استفاده از آن به عنوان یک محیط تفکیکی گسترش یافته و سایر اعضای خانواده Enterobacteriaceae را نیز در بر می‌گیرد.
واکنش مالونات می‌تواند برای افتراق بین اعضای خانواده Enterobacteriaceae استفاده شود:
- Klebsiella pneumoniae نتیجه مثبت نشان می‌دهد (رنگ محیط پس از ۲۴ ساعت آبی می‌شود).
Escherichia coli نتیجه منفی دارد یعنی رنگ کشت سبز باقی می‌ماند.
این آزمون همچنین برای تمایز بین Salmonella arizonae (مثبت) و سایر گونه‌های Salmonella (منفی) قابل استفاده است.
همچنین در شناسایی و افتراق اعضای خانواده Enterobacteriaceae در محصولات غذایی و لبنی کاربرد دارد.

Mannitol Salt Agar (MSA)

کاربرد: محیط مانیتول سالت آگار برای تمایز بین گونه‌های Staphylococcus و Micrococcus بسیار مفید است.
تخمیر مانیتول توسط استافیلوکوک‌های پاتوژن مانند Staphylococcus aureus، باعث تغییر رنگ محیط به زرد می‌شود.
در مقابل، Staphylococcus epidermidis که گونه‌ای غیرپاتوژن از استافیلوکوک‌هاست، رنگ زرد تولید نمی‌کند.

آزمایش Methyl Red (MR)

هدف

برای تفکیک دو نوع اصلی از باکتری‌های بی‌هوازی اختیاری روده‌ای بر اساس توانایی آن‌ها در تولید اسید استفاده می‌شود.
این آزمون توانایی باکتری در تولید محصولات نهایی اسیدی پایدار از طریق تخمیر مخلوط‌ اسید گلوکز را ارزیابی می‌کند.

محدودیت‌ها

نتیجه‌ی آزمون نباید پیش از ۴۸ ساعت خوانده شود، زیرا برخی ارگانیسم‌ها ممکن است هنوز محصولات کافی از تخمیر گلوکز تولید نکرده باشند.
ارگانیسم‌های MR-منفی ممکن است هنوز فرصت تبدیل این محصولات را نیافته باشند و به اشتباه MR مثبت ظاهر شوند.
اگر پس از ۴۸ ساعت نتیجه تست نارنجی (غیرقطعی) بود، انکوباسیون باید تا سه روز دیگر ادامه یابد و سپس کشت مجدداً آزمایش شود.
آزمایش‌های MR-VP باید همراه با سایر تست‌های تاییدی برای افتراق بین اعضای خانواده Enterobacteriaceae انجام شوند.

آزمایش تحرک (Motility Test)

هدف

تعیین تحرک باکتری
افتراق بین باکتری‌های متحرک و غیرمتحرک

نتایج مورد انتظار

نتیجه مثبت: رشد پخش‌شونده و مات در سراسر محیط که آن را کمی کدر می‌کند.
نتیجه منفی: رشد فقط در امتداد خط تلقیح، با حاشیه‌های مشخص و محیط اطراف شفاف باقی می‌ماند.

کاربردها

برای افتراق میکروارگانیسم‌ها بر اساس تحرک در محیط آزمایشگاهی استفاده می‌شود.
برای رده‌بندی تاکسونومیک ارگانیسم‌ها کاربرد دارد.
در شناسایی عوامل بیماری‌زا مؤثر است.
در پروتکل‌های شناسایی اعضای خانواده Enterobacteriaceae به‌کار می‌رود.
همچنین برای تمایز گونه‌های گرم مثبت کوکسی، به‌ویژه Enterococcus کاربرد دارد:
- Enterococcus faecium و faecalis غیرمتحرک هستند.
- در حالی که gallinarum و E. casseliflavus/E. flavescens معمولاً متحرک هستند.

محدودیت‌ها

برخی ارگانیسم‌ها ممکن است در این محیط رشد کافی نداشته باشند تا امکان تفسیر دقیق فراهم شود و نیاز به تست‌های تکمیلی خواهد بود.
برای شناسایی قطعی توصیه می‌شود از روش‌های بیوشیمیایی، ایمونولوژیک، مولکولی یا طیف‌سنجی جرمی استفاده شود.
نتایج منفی کاذب ممکن است در صورت آسیب دیدن تاژک های باکتری به‌علت حرارت، تکان دادن یا شوک محیطی رخ دهد که باعث غیرمتحرک شدن باکتری می‌شود.
ارگانیسم‌هایی که تحرک ضعیفی دارند ممکن است نتیجه منفی کاذب بدهند.
هنگام تلقیح محیط نیمه‌جامد، بسیار مهم است که سوزن تلقیح دقیقا در امتداد مسیر ورود اولیه خارج شود. حرکات پنکه‌ای یا کج ممکن است باعث رشد در امتداد خط تلقیح شود و تفسیر مثبت کاذب ایجاد کند.

آزمایش احیای نیترات (Nitrate Reduction Test)

هدف

تعیین توانایی یک ارگانیسم در احیاء نیترات به نیتریت
شناسایی راه‌های مختلفی که باکتری‌ها از طریق آن نیترات را احیاء می کنند.

نتایج مورد انتظار

نتیجه مثبت:
- ایجاد رنگ قرمز گیلاسی پس از افزودن معرف A و B
- عدم ایجاد رنگ قرمز پس از افزودن پودر روی (Zn)
نتیجه منفی:
- ایجاد رنگ قرمز پس از افزودن پودر روی (Zn)

کاربردها

تمامی اعضای خانواده Enterobacteriaceae نیترات را احیاء می کنند، اما برخی از آن‌ها نیتریت را به ترکیبات دیگری نیز تبدیل می‌کنند. بنابراین، این آزمون برای تمایز بین اعضای خانواده Enterobacteriaceae که آنزیم نیترات ردوکتاز تولید می‌کنند و باکتری‌های گرم‌منفی‌ای که این آنزیم را ندارند به‌کار می‌رود.
در برخی گونه‌ها، احیاء نیترات با تنفس بی‌هوازی مرتبط است.
در تمایز گونه‌های Mycobacterium کاربرد دارد.
برای شناسایی گونه‌های Neisseria و تفکیک آن‌ها از Moraxella و Kingella استفاده می‌شود.
- به‌طور خاص، این تست در تشخیص بین gonorrhoeae و K. denitrificans اهمیت دارد؛ به‌ویژه وقتی سویه‌های K. denitrificans به شکل دیپلوسوکوس‌های گرم‌منفی در اسمیر رنگ‌آمیزی‌شده ظاهر می‌شوند.
در شناسایی گونه‌های Corynebacterium نیز مفید است.

محدودیت‌ها

آزمایش احیاء نیترات به عنوان ابزاری کمکی برای شناسایی باکتری‌ها کاربرد دارد، اما برای شناسایی کامل، انجام سایر تست‌های بیوشیمیایی با استفاده از کشت خالص توصیه می‌شود.
به‌دلیل احتمال وجود نیتریت در محیط کشت، باید از محیط‌هایی با میزان پایین نیتریت مانند Nitrate Agar یا Nitrate Broth استفاده شود.
نتیجه منفی در تست احیاء با روی (عدم تغییر رنگ) همراه با عدم واکنش نیتریت مثبت می‌تواند به‌طور فرضی نشان‌دهنده این باشد که نیترات به مرحله‌ای فراتر از نیتریت کاهش یافته است.
- اگرچه رایج‌ترین محصول نهایی احیاء نیتریت، گاز نیتروژن است، اما ممکن است محصولات دیگری نیز تشکیل شوند. در این صورت، آزمایش‌های تکمیلی برای تعیین دقیق محصول نهایی واکنش نیاز است.
برای جلوگیری از نتایج منفی کاذب در واکنش نیتریت، باید واکنش‌های نیتریت منفی با افزودن پودر روی به محیط بررسی شوند.
مقدار زیاد پودر روی ممکن است باعث نتایج مثبت کاذب در واکنش نیتریت شود، چون می‌تواند نیترات باقی‌مانده را به‌طور کامل تا آمونیاک احیاء کند.

آزمون حساسیت به نووبیوسین (Novobiocin Susceptibility Test)

هدف

در درجه اول، برای تمایز Staphylococcus saprophyticus از سایر استافیلوکوک‌های کوآگولاز منفی (CONS)، به‌ویژه Staphylococcus epidermidis.
تفکیک CONS به دو گروه: CONS حساس به نووبیوسین و CONS مقاوم به نووبیوسین.

نتیجه و تفسیر

برای محیط BAP روش Hebert

ناحیه ممانعت با قطر ≥۱۲ میلی‌متر = حساس به نووبیوسین
ناحیه ممانعت با قطر <۱۲ میلی‌متر = مقاوم به نووبیوسین

برای محیط MHA روش دیسک دیفیوژن Kirby-Bauer مطابق با CLSI

ناحیه ممانعت با قطر >۱۶ میلی‌متر = حساس
ناحیه ممانعت با قطر ≤۱۶ میلی‌متر = مقاوم

اگر گونه‌ی Staphylococcus جداشده از نمونه ادرار، کوآگولاز منفی و مقاوم به نووبیوسین باشد، به عنوان Staphylococcus saprophyticus گزارش می‌شود.

با این حال، این آزمایش تأییدکننده‌ی قطعی برای S. saprophyticus نیست و نباید برای جدایه‌هایی غیر از آنچه از نمونه ادرار بدست آمده استفاده شود.

کاربردها

برای شناسایی saprophyticus در میان سایر CONSهای پاتوژن
افتراق بین epidermidis و S. saprophyticus در کشت ادرار

محدودیت‌ها

فقط در صورتی می‌توان از آن به‌عنوان آزمون تأییدی برای شناسایی saprophyticus استفاده کرد که باکتری از نمونه ادرار جدا شده باشد.
نیاز به سایر تست‌های بیوشیمیایی برای شناسایی نهایی دارد.
به دلیل اینکه بر پایه کشت است، زمان‌بر است و نیاز به مواد شیمیایی و شرایط خاص دارد.
احتمال بروز نتایج مثبت یا منفی کاذب بالا است.

آزمون اکسیداز (Oxidase Test)

هدف / کاربردها

بررسی وجود آنزیم سیتوکروم اکسیداز در میکروارگانیسم‌ها.
کمک به افتراق گونه‌های Neisseria, Moraxella, Campylobacter و Pasteurella (اکسیداز مثبت).
همچنین برای افتراق گونه‌های سودوموناس (Pseudomonas) از باکتری‌های مرتبط استفاده می‌شود.

محدودیت‌ها

معرف‌های اکسیداز ممکن است به‌صورت خود به خود اکسید شوند؛ باید تازه و کمتر از ۱ هفته از آماده‌سازی آن‌ها گذشته باشد.
رشد در محیط‌های حاوی گلوکز بالا باعث کاهش فعالیت آنزیم می‌شود؛ محیط‌هایی مانند آگار مغذی یا Tryptic Soy Agar توصیه می‌شوند.
رشد در محیط‌های رنگ‌دار ممکن است باعث نتایج غیرطبیعی شود.
معرف‌ها باعث مرگ باکتری‌ها می‌شوند؛ باید پیش از افزودن معرف، انتقال باکتری به محیط جدید انجام شود.
استفاده از لوپ نیکل-کروم یا آهن‌دار ممکن است نتایج مثبت کاذب ایجاد کند؛ لوپ پلاتینی توصیه می‌شود.
اکثر گونه‌های Haemophilus اکسیداز مثبت هستند؛ معرف‌های کم‌حساس ممکن است منفی کاذب بدهند.
بررسی واکنش‌ها باید بر روی محیط‌های غیر انتخابی و غیر افتراقی انجام شود.
از کلونی‌های ۱۸ تا ۲۴ ساعته استفاده شود؛ کلونی‌های قدیمی واکنش ضعیف‌تری می‌دهند.
تغییر رنگ بعد از ۲۰ ثانیه باید نادیده گرفته شود.

آزمون فنیل‌آلانین دآمیناز (Phenylalanine Deaminase Test – PDA)

اهداف

افتراق اعضای Enterobacterales و شناسایی گونه‌های Proteus.
باکتری‌های مثبت: Proteus spp., Morganella spp., Providencia spp.
باکتری‌های منفی: E. coli, Klebsiella spp. و اکثر
شناسایی Proteus در جدایه‌های بالینی.
استفاده در شناسایی بیوشیمیایی باکتری‌های ناشناخته.

محدودیت‌ها

آزمون قطعی نیست و نیاز به سایر تست‌ها دارد.
رنگ سبز ایجاد شده به سرعت محو می‌شود؛ باید حداکثر ۵ دقیقه پس از افزودن کلرید فریک خوانده شود.

آزمون هیدروکسید پتاسیم (Potassium Hydroxide Test – KOH)

هدف

افتراق بین باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت

نتایج مورد انتظار

مثبت: غلیظ و رشته‌ای شدن (رشته‌های طولانی) ظرف ۳۰ ثانیه = گرم منفی
منفی: بدون تغییر یا رشته‌ای نشدن = گرم مثبت

کاربردها

در آزمایشگاه‌هایی با حجم بالای نمونه، مکمل رنگ‌آمیزی گرم و دیسک آنتی‌بیوتیک است.

محدودیت‌ها

منفی بودن آزمون، اثبات قطعی گرم مثبت بودن نیست.
کشت‌های قدیمی (بیش از ۴۸ ساعت) ممکن است مثبت کاذب شوند.
تلقیح بیش از حد یا آزمایش از کلونی‌های موکوئیدی ممکن است مثبت کاذب ایجاد کند.
تلقیح ناکافی یا مصرف بیش از حد KOH ممکن است منفی کاذب بدهد.

محیط آگار Spirit Blue

استفاده به همراه معرف لیپاز برای شمارش و تشخیص میکروارگانیسم‌های لیپولیتیک (چربی‌کُش).

آزمون هیدرولیز نشاسته (Starch Hydrolysis Test)

اغلب برای تمایز گونه‌های جنس‌های Clostridium و Bacillus استفاده می‌شود.
به افتراق گونه‌های جنس‌های Corynebacterium, Clostridium, Bacillus, Bacteroides, Fusobacterium و اعضای Enterococcus spp. کمک می‌کند.

محیط براث تیوگلیکولات (Thioglycollate Broth)

کاربردها

کشت میکروارگانیسم‌های هوازی، میکروآئروفیل و بی‌هوازی
تفکیک ارگانیسم‌های هوازی اجباری، بی‌هوازی اجباری، بی‌هوازی اختیاری، میکروآئروفیل و هوازی تحمل‌کننده
برای تست استریل بودن برخی محصولات زیستی کدر یا با ویسکوزیته بالا که کشت آنها در محیط‌های معمول مشکل است
تست استریل بودن آنتی‌بیوتیک‌ها، فرآورده‌های زیستی و مواد غذایی
تعیین ضریب فنول و اثربخشی ضدعفونی‌کننده‌ها
ایزوله کردن بی‌هوازی‌های سخت‌گیر در صورت شک به عفونت بی‌هوازی از خون
بررسی ویژگی‌های رشد باکتری‌ها بر اساس نیاز به اکسیژن

محدودیت‌ها

باید محیط تازه آماده شود یا حداکثر ظرف ۴ ساعت پس از جوشاندن و سرد شدن استفاده شود.
نگهداری در دمای پایین باعث افزایش جذب اکسیژن می‌شود.
نباید بیش از یک بار گرم شود چون رادیکال‌های اکسیژن سمی تولید می‌کند.

آزمون سه‌قند-آهن (Triple Sugar Iron – TSI)

هدف

تعیین توانایی ارگانیسم در تخمیر گلوکز، لاکتوز و ساکارز و تولید سولفید هیدروژن (H2S)

نتایج مورد انتظار

واکنش قلیایی/اسیدی (شیب قرمز/کف زرد): تخمیر فقط دکستروز
واکنش اسیدی/اسیدی (شیب زرد/کف زرد): تخمیر دکستروز، لاکتوز و/یا ساکارز
واکنش قلیایی/قلیایی (شیب قرمز/کف قرمز): عدم تخمیر قند
سیاه شدن محیط: وجود H2S
تولید گاز: حباب یا ترک در آگار نشان‌دهنده تولید گاز (CO2 و H2)

کاربردها

عمدتاً برای تمایز خانواده Enterobacteriaceae از باکتری‌های گرم منفی دیگر
افتراق درون Enterobacteriaceae بر اساس الگوهای تخمیر قندها

محدودیت‌ها

باید برای شناسایی کامل، سایر تست‌های بیوشیمیایی، ایمنی‌شناسی، مولکولی یا طیف‌سنجی روی کلونی خالص انجام شود
نوک سوزن باید وارد کف محیط شود؛ اگر سوزن وارد کف نشود، آزمون نامعتبر است
باید کلاهک لوله را هنگام انجام تست کمی باز نگه داشت
تفسیر نتایج باید بین ۱۸ تا ۲۴ ساعت پس از انکوباسیون انجام شود؛ خواندن زودتر یا دیرتر می‌تواند منجر به نتایج نادرست شود.
تولید H2S ممکن است اسیدی شدن کف را پنهان کند اما وجود H2S نیازمند محیط اسیدی است.
TSI نسبت به سایر محیط‌های آهن‌دار مانند محیط SIM حساسیت کمتری دارد.
برخی گونه‌ها یا سویه‌ها ممکن است واکنش تأخیری داشته یا تخمیر قند را انجام ندهند.

آزمون اوره‌آز (Urease Test)

واکنش مثبت

ایجاد رنگ بنفش تیره تا صورتی روشن در مدت ۱۵ دقیقه تا ۲۴ ساعت

مثال گونه‌های مثبت

Proteus spp., Cryptococcus spp., Corynebacterium spp., Helicobacter pylori, Yersinia spp., Brucella spp.

واکنش منفی

بدون تغییر رنگ

مثال گونه‌های منفی

Escherichia, Shigella, Salmonella

محدودیت‌ها

برخی گونه‌ها مثل Brucella و pylori سریعاً اوره را تجزیه می‌کنند، برخی کندتر.
شناسایی قطعی نیازمند سایر تست‌های بیوشیمیایی یا سرولوژیکی است.
نباید از سوسپانسیون مایع برای تلقیح استفاده شود.
پس از انکوباسیون طولانی، ممکن است واکنش قلیایی کاذب رخ دهد؛ استفاده از کنترل توصیه می‌شود.
نباید محیط اوره را حرارت داد چون اوره به راحتی تجزیه می‌شود
برای شناسایی Proteus باید ظرف ۶ ساعت پس از تلقیح بررسی شود
اوره‌آز برای تعیین مقدار فعالیت آنزیم مناسب نیست
بستن درب لوله‌ها به صورت کامل ممکن است باعث نتایج اشتباه شود
اوره حساس به نور است و باید در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد و در تاریکی نگهداری شود

آزمون VP (Voges-Proskauer Test)

هدف

افتراق باکتری‌ها بر اساس توانایی تولید استوآین (acetoin) به عنوان محصول نهایی تخمیر گلوکز
شناسایی و تمایز باسیل‌های گرم منفی عمدتاً Enterobacterales و Actinobacteria

تفسیر نتیجه

رنگ صورتی-قرمز روی سطح محیط = مثبت
عدم ایجاد رنگ یا رنگ مسی = منفی

کاربردها

شناسایی و افتراق باکتری‌های گرم منفی، به ویژه Enterobacteriaceae
افتراق Actinobacteria

محدودیت‌ها

تست قطعی نیست و نیاز به سایر تست‌های بیوشیمیایی دارد
گاهی نتیجه مثبت ممکن است پس از ۳۰ دقیقه تا ۱ ساعت ظاهر شود؛ خواندن بعد از ۱ ساعت ممکن است مثبت کاذب باشد
افزودن معرف‌ها باید به ترتیب و مقدار مشخص انجام شود

آزمون عوامل X و V

هدف

افتراق گونه‌های Haemophilus بر اساس نیازشان به عوامل رشد X (پورفیرین) و V (NAD)

نتایج مورد انتظار

رشد فقط اطراف دیسک XV = نیاز به هر دو عامل X و V
رشد اطراف دیسک V، بدون رشد اطراف دیسک X، و رشد ضعیف اطراف XV = نیاز به عامل V
رشد روی کل سطح آگار = بدون نیاز به عوامل X و V

کاربردها

افتراق گونه‌های Haemophilus و همچنین Aggregatibacter aphrophilus بر اساس نیاز به عوامل رشد

محدودیت‌ها

توصیه می‌شود برای شناسایی کامل، سایر تست‌های بیوشیمیایی، ایمنی‌شناسی، مولکولی یا طیف‌سنجی روی کلونی خالص انجام شود.
به دلیل شباهت در نیاز عوامل رشد گونه‌های Haemophilus، نباید تنها بر اساس این تست شناسایی شود.
هنگام تلقیح باید دقت شود که مواد مغذی از نمونه به محیط منتقل نشود تا تداخل ایجاد نکند.

biochemical test for bacterial identification

دیدگاهتان را بنویسید لغو پاسخ

درجستجوی سلامتی
بسم الله الرحمن الرحیم به اذن خدای متعال خوشحالم که خبر های...
رسول
سلام یک روزی همه انسان ها به این ویروس دچار خاهند شد اون روز...
قاسمی
خیلی مطلب مفیدی بود، عکس های مرتبط و توضیحات خوب.متشکرم...
روح الله شمس الدینی کرکی
یکی از بزرگترین موانع کندی پیش فت علم پزشکی همین اسامی قلمبه...
ناشناس
صحیح...