رنگ آمیزی دیواره سلولی : آشنایی با اصل و روش و نتیج حاصل از آن
رنگ آمیزی دیواره سلولی یکی از فعالیت‌های آزمایشگاهی برای تشخیص ارگانیسم‌های مختلف است. دیواره سلولی ساختاری سفت و سخت است که به باکتری شکل می‌دهد. رنگ‌آمیزی دیواره سلولی در آزمایشگاه آسان نیست. زیرا این دیواره به راحتی رنگ نمی‌گیرد. به‌طور کلی برای رنگ آمیزی دیواره سلولی در آزمایشگاه از سه تکنیک استفاده می‌شود که عبارتند از:
- روش Chance
- روش Ringen
- روش Dyar
در این مطلب قصد داریم به مرور این سه روش بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.
مروری بر دیواره سلولی
سلول باکتری از اجزای ساختاری مختلفی تشکیل شده است. دیواره سلولی یکی از مهمترین اجزا است. دیواره سلولی خارج از غشای سلولی باکتری وجود دارد و به سلول باکتری استحکام می‌‌بخشد. بر اساس ساختار دیواره سلولی، همه باکتری‌ها به دو گروه تقسیم می‌شوند :
- گرم مثبت
- گرم منفی
دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت از یک لایه پپتیدوگلیکان همگن (موسوم به مورئین یا موکوپپتید) به ضخامت 20 تا 80 نانومتر با اسیدهای تیکوئیک در خارج از غشای پلاسما تشکیل شده است. اما دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی حاوی 2 تا 7 نانومتر پپتیدوگلیکان است که توسط غشای خارجی به ضخامت 7 تا 8 نانومتری احاطه شده است و از فسفولیپیدها و لیپوپلی ساکاریدها تشکیل شده است.
اساسی‌ترین دلیل رنگ آمیزی سلول‌ها، افزایش تجسم سلول یا اجزای سلولی خاص در زیر میکروسکوپ است. رنگ آمیزی دیواره سلولی باکتری نیز به همین منظور صورت می‌گیرد تا اجزای سلولی باکتری برجسته‌تر شوند و به کمک مورفولوژی آن‌ها، بتوان به جزئیات بیشتری در مورد یک سلول خاص پی برد. ترکیب شیمیایی دیواره سلولی در ارگانیسم‌های مختلف، متفاوت است. به همین دلیل رنگ‌آمیزی دیواره سلولی به مطالعه دیواره سلولی ارگانیسم‌های گرم مثبت و همچنین گرم منفی کمک می‌کند.
آیا رنگ آمیزی گرم همان رنگ آمیزی دیواره سلولی است؟
رنگ‌آمیزی گرم یک تکنیک رنگ‌آمیزی افتراقی است که به ما امکان می‌دهد سلول‌های گرم منفی را از سلول‌های گرم مثبت متمایز کنیم. این تمایز بر اساس شیمی و ساختار دیواره سلولی صورت می‌گیرد. در رنگ آمیزی گرم از رنگ کریستال ویوله استفاده می‌شود. این رنگ پایه، دارای بار مثبت است و بنابراین به غشای سلولی سلول‌های گرم منفی و مثبت می‌چسبد.
تفاوت بین غشای سلولی و دیواره سلولی چیست؟
دیواره سلولی (cell wall) بیشتر مسئول شکل دادن به سلول است. در حالی که غشای سلولی (cell membrane) آنچه را که به سلول داخل و یا از آن خارج می‌شود را تنظیم می‌کند. ترکیب دیواره سلولی و غشای سلولی نیز متفاوت است.
در ادامه به بررسی سه مورد از رایج‌ترین انواع رنگ آمیزی دیواره سلولی خواهیم پرداخت.
الف/ رنگ آمیزی دیواره سلولی به روش Chance
در حالت عادی دیواره سلولی و سیتوپلاسم خاصیت اسیدی دارند. دیواره سلولی اسیدیتر از سیتوپلاسم است. از این خاصیت می‌توان برای تمایز دیواره سلولی از سیتوپلاسم در رنگ آمیزی استفاده نمود.
در رنگ آمیزی دیواره سلولی به روش Chance ابتدا رنگ فوشسین را اعمال میکنیم. این رنگ هم سیتوپلاسم و هم دیواره سلولی را رنگ‌آمیزی می‌کند. سپس رنگ کنگو رد اضافه می‌شود. کنگو رد یک عامل رنگ‌زدایی انتخابی است. به این معنی که قسمت‌هایی که خاصیت اسیدی کمتری دارند را رنگ‌زدایی می‌کند. بنابراین پس از اعمال این ماده روی سلول، سیتوپلاسم بی‌رنگ شده و دیواره سلولی همچنان رنگ دارد.
مراحل رنگ آمیزی دیواره سلولی به روش Chance
- یک لام میکروسکوپ تمیز و بدون چربی بردارید.
- با استفاده از لوپ استریل، یک اسمیر از سوسپانسیون باکتریایی روی لام تهیه کنید.
- اجازه دهید اسمیر در هوای اتاق خشک شود. سپس آن را به کمک حرارت فیکس کنید.
- محلول نیو فوشسین 0.5% را روی اسمیر بریزید و اجازه دهید به مدت 3 دقیقه بماند تا واکنش ایجاد شود.
- پس از 3 دقیقه، رنگ اضافی تخلیه کنید. سپس محلول کنگو رد 0.5% را روی لام ریخته و اجازه دهید حدود 4 دقیقه بماند.
- پس از گذشت 4 دقیقه، لام را به آرامی با آب بشویید.
- اجازه دهید لام رنگ‌آمیزی شده در هوای اتاق خشک شود. سپس می‌توانید آن‌را به کمک روغن ایمرسیون زیر میکروسکوپ مشاهده کنید. دیواره سلولی صورتی رنگ و سیتوپلاسم بی رنگ خواهد بود.
ب) روش Ringen
اصول رنگ آمیزی دیواره سولی با روش Ringen نیز مانند روش chance است. اما در این روش به جای رنگ فوشین از رنگ کریستال ویوله استفاده می‌شود. همچنین از تانیک اسید نیز به عنوان ماده خشک کننده استفاده می‌شود. این ماده باعث افزایش ضخامت دیواره سلولی و میل ترکیبی بیشتر رنگ کریستال ویوله به دیواره سلولی می‌شود.
در جدول 1 به مقایسه رنگ آمیزی دیواره سلولی به روش Chance و روش Ringen پرداخته‌ایم.
| پارامتر | روش Ringen | روش Chance’s |
| تثبیت کننده | Tannic acid | _ |
| رنگ | 1% Crystal violet | 0.5% New fuchsin |
| رنگ زدا (ضدرنگ) | 1% Congo red | 0.5 % Congo red |
| نتایج | دیواره سلولی بنفش با سیتوپلاسم بی رنگ | دیواره سلولی صورتی با سیتوپلاسم بی رنگ |
ج) رنگ آمیزی دیواره سلولی به روش Dyar
در روش Dyar برای رنگ آمیزی دیواره سلولی از ماده‌ای به نام ستیل پیریدینیوم کلراید (Cetylpyridinium chloride) استفاده می‌شود. این ماده یک ترکیب کاتیونی است. هنگامی که ستیل پیریدینیوم کلراید با آب مواجه می‌شود، یون‌های مثبت و منفی ایجاد می‌شوند. سطح سلول باکتری دارای بار منفی است. به همین دلیل یون‌های دارای بار مثبت به سطح سلول باکتری با بار منفی متصل می‌شوند و سطح باکتری با یون‌های مثبت پوشانده می‌شود.
از طرف دیگر رنگ کنگو رد، یک رنگ اسیدی است و بار منفی دارد. به همین دلیل به دیواره سلولی چسبیده و آن را به رنگ قرمز در می‌آورد.
سپس متیلن بلو اضافه می‌شود تا سیتوپلاسم را به رنگ آبی رنگ کند. به این ترتیب زیر میکروسکوپ، می‌توانیم دیواره سلولی قرمز رنگ و سیتوپلاسم آبی رنگ را مشاهده کنیم.
شکل زیر رنگ آمیزی دیواره سلولی به روش Dyar را نشان می‌دهد.
مراحل رنگ آمیزی دیواره سلولی به روش Dyar
- یک لام میکروسکوپ تمیز و بدون چربی بردارید.
- با استفاده از لوپ استریل، یک اسمیر از سوسپانسیون باکتریایی روی لام تهیه کنید.
- اجازه دهید اسمیر در هوای اتاق خشک شود. سپس آن را به کمک حرارت فیکس کنید.
- 3 الی 4 قطره از محلول ستیل پیریدینیم کلرید 0.35 درصد را به اسمیر اضافه کنید.
- یک قطره از کنگو رد 0.5 درصد را نیز روی لام بریزید و لام را به آهستگی حرکت دهید تا دو محلول با یکدیگر ترکیب شوند.
- اجازه دهید رنگ 2 دقیقه روی لام بماند. سپس لام را با آب بشویید.
- چند قطره متیلن بلو را روی لام بریزید و اجازه دهید حدود 20 ثانیه روی لام بماند.
- لام را با آب بشویید
- سپس می‌توانید آن‌را به کمک روغن ایمرسیون زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.
جمع‌بندی
رنگ آمیزی دیواره سلولی یک از تکنیک‌های آزمایشگاهی به منظور بررسی ساختار سلول باکتریایی است. شاید تصور کنید که معمولا رنگ آمیزی گرم به این منظور انجام می‌شود. اما باید گفت که رنگ آمیزی گرم در واقع برای بررسی غشاء سلولی مناسب است. در این مقاله سعی کردیم سه مورد از رایج‌ترین تکنیک‌های رنگ آمیزی دیواره سلول باکتریایی را بیان کنیم.
دقت داشته باشید که ممکن است آزمایشگاه‌های مختلف از روش های مختلفی برای این کار استفاده کنند. شما در آزمایشگاه خود از کدام روش رنگ آمیزی استفاده می‌کنید؟
برای مطالعه سایر مقالات ما در حوزه رنگ آمیزی ، کلیک کنید.
