آشنایی با تکنیک رنگ‌آمیزی کوماسی بریلینت بلو
تکنیک رنگ‌آمیزی کوماسی بریلینت بلو[1] (CBB) یک روش پرکاربرد برای بررسی و مشاهده روتین پروتئین‌های جدا شده روی ژل‌های پلی آکریل آمید است. CBB انواع مختلفی دارد. این تکنیک رنگ‌آمیزی معمولا در آزمایشگاه برای پروتکل‌های رنگ‌آمیزی پروتئین، پس از الکتروفورز ژل SDS-PAGE یا پلی آکریل آمید استفاده می‌شود. در این مطلب قصد داریم به بررسی اصول این تکنیک رنگ‌آمیزی بپردازیم. ضمن آن نیز با محدودیت‌ها و مزایای این روش آشنا خواهیم شد. پس در ادامه با ما همراه باشید.
مروری اجمالی بر کوماسی بریلینت بلو
- فرمول شیمیایی: C47H50N3NaO7S2 (نمک سدیم)
- جرم مولی: 3 گرم در مول
- حلالیت در آب: در آب سرد کمی محلول است اما د آب گرم کاملا حل می‌شود.
- حلالیت در اتانول: محلول
اصول تکنیک رنگ‌آمیزی کوماسی بریلینت بلو
Coomassie Brilliant Blue اولین بار توسط دانشمندی به نام Volker Neuhoff توصیف شد. این رنگ، نام خود را از یک شهر آفریقایی به نام Kumasi گرفت که قبلاً با نام Coomassie شناخته می‌شد. البته نام “Coomassie” یک علامت تجاری ثبت شده نیز است.
رنگ کوماسی بریلینت بلو دارای سه شکل آنیونی (آبی)، خنثی (سبز) و کاتیونی (قرمز) است. اگر این رنگ در یک محیط اسیدی قرار گیرد، رنگ قرمز پس از اتصال به پروتئین مورد نظر به شکل آبی تبدیل می‌شود. اگر هیچ پروتئینی به رنگ متصل نشود نیز محلول قهوه‌ای باقی می‌ماند.
CBB یک رنگ آلی است که با اسیدهای آمینه اساسی مانند لیزین، هیستیدین، تیروزین و آرژنین، تشکیل یک کمپلکس می‌دهد. در واقع کوماسی بریلینت بلو، یک بار منفی را به این پروتئین ها منتقل می‌کند و اجازه می‌دهد آن‌ها از ژل پلی آکریل آمید جدا شوند.
Coomassie Brilliant Blue پتانسیل تشخیص پروتئین‌هایی با وزن مولکولی 30 الی100 نانوگرم را دارد. اما حساسیت آن بستگی به نوع رنگ مورد استفاده در روش رنگ آمیزی بستگی دارد. حساسیت روش را می‌توان با انجام آن در دماهای بالا بهبود بخشید.
انواع کوماسی بریلینت بلو
رنگ کوماسی بریلینت بلو بر اساس خواص، ویژگی‌های مولکولی، توانایی رنگ‌آمیزی و حساسیت در دو نوع به بازار عرضه می‌شود.
Coomassie Brilliant Blue G-250
Coomassie Brilliant Blue G-250 (یا coomassie blue کلوئیدی) حاوی دو گروه متیل است که در نسخه R-250 وجود ندارد. حرف “G” که در نام‌گذاری این رنگ استفاده شده نیز، نشان می‌دهد که این رنگ مایل به سبز است.
Coomassie Brilliant Blue R-250
Coomassie Brilliant Blue R-250 شکل دیگری از رنگ کوماسی بریلینت بلو است. حرف “R” که در نام‌گذاری این رنگ استفاده شده نیز، نشان می‌دهد که این رنگ مایل به قرمز است.
کاربرد تکنیک رنگ‌آمیزی CBB
رنگ آمیزی Coomassie Brilliant Blue یک تکنیک رنگ آمیزی کارآمد، ساده، سریع و مقرون به صرفه است. از مهم‌ترین کاربردهای این تکنیک در آزمایشگاه می‌توان به موارد زیر اشاره نمود.
۱. یکی از کاربردهای تکنیک رنگ آمیزی CBB در الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید است. این تکنیک برای جداسازی پروتئین ها بر اساس وزن مولکولی آن‌ها برای آزمایش‌های زیست شناسی مولکولی و آنالیز پروتئین استفاده می‌شود. پروتئین‌های جدا شده را می‌توان با استفاده از رنگ کوماسی بریلینت بلو شناسایی کرد.
۲. تعیین غلظت پروتئین یکی از مطالعات تجربی ضروری در بسیاری از مطالعات پروتئومیک است. با استفاده از تکنیک رنگ آمیزی CBB می‌توان این کار را در آزمایشگاه انجام داد.
۳. رنگ Coomassie می‌تواند با گروه کوچکی از اسیدهای آمینه ازجمله آرژنین، هیستیدین، لیزین، فنیل آلانین، تیروزین و تریپتوفان تعامل داشته باشد. به همین دلیل یک تکنیک مفید برای تجزیه و تحلیل اثر انگشت در پزشکی قانونی است.
روش استفاده از تکنیک رنگ‌آمیزی کوماسی بریلینت بلو
برای استفاده از روش رنگ‌آمیزی کوماسی بریلینت بلو لازم است یکسری موارد احتیاطی رعایت شود.
- هنگام کار با CBB از دستکش و روپوش محافظ استفاده کنید.
- در صورت تماس رنگ با چشم، حتما چشم را کاملا با آب بشویید.
- کوماسی بریلینت بلو ممکن است در صورت قرار گرفتن در معرض پوست باعث تحریک پوست شود. پس احتیاط کنید.
- محلول رنگ‌آمیزی را در یک ظرف محکم در بسته نگهداری کنید و در مکانی خشک، خنک و دارای تهویه مناسب قرار دهید.
- در صورت ریختن رنگ در محیط، فوراً آن را با آب بشویید.
روش رنگ‌آمیزی کوماسی بریلینت بلو
رنگ کوماسی بریلینت بلو اغلب به صورت تجاری خریداری می‌شود. این رنگ ممکن است به صورت معرف‌های مختلفی ارائه شود که هریک پروتئین های خاصی را رنگ آمیزی می‌کنند. این رنگ آمیزی بر اساس وزن مولکولی پروتئین‌ها اتفاق می‌افتد. در ادامه به بررسی روش رنگ آمیزی CBB خواهیم پرداخت.
توجه داشته باشید که برای رنگ‌آمیزی کوماسی بریلینت بلو حتما از دستورالعمل‌های سازنده پیروی کنید.
مرحله اول
- ژل را در یک ظرف پلاستیکی مقاوم در برابر مایکروویو قرار دهید. روی ژل را با معرف A از محلول رنگ کوماسی بپوشانید.
- ژل را در مایکروویو حرارت دهید تا بجوشد (2 دقیقه).
- ژل را به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار دهید تا خنک شود. می‌توانید آن را به صورت ملایم تکان دهید.
- معرف استفاده شده A را دور بریزید و ژل را با H2 بشویید.
در این مرحله از تکنیک کوماسی بریلینت بلو ، نوارهای حاوی 100 نانوگرم پروتئین یا بیشتر قابل تشخیص هستند.
مرحله دوم
- 100 میلی لیتر از معرف B را اضافه کنید و ژل را در فر حرارت دهید تا محلول به جوش آید (80 ثانیه).
- معرف داغ B را دور بریزید و ژل را با H2 بشویید.
در این مرحله، نوارهای حاوی 50 نانوگرم پروتئین یا بیشتر قابل تشخیص هستند.
مرحله سوم
- 100 میلی لیتر از معرف C را به ژل اضافه کنید و ژل را حرارت دهید تا محلول به نقطه جوش خود برسد. (80 ثانیه)
- معرف داغ C را دور بریزید و ژل را با H2 بشویید.
در این مرحله، نوارهای حاوی 25 نانوگرم پروتئین یا بیشتر قابل تشخیص هستند.
مرحله چهارم ، رنگ زدایی
- 100 میلی‌لیتر از معرف D را به ژل اضافه کنید و ژل را در فر حرارت دهید تا محلول به جوش بیاید. (80 ثانیه).
- یک تکه کوچک از دستمال آزمایشگاهی را در محلول قرار دهید تا رنگ اضافی جذب شود.
- ژل را به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قار دهید تا خنک شود.
در این مرحله از تکنیک کوماسی بریلینت بلو ، نوارهای حاوی 5 نانوگرم پروتئین یا بیشتر قابل تشخیص هستند.
نقاط قوت و محدودیت‌ها
کوماسی بریلینت بلو حساسیت بالایی دارد. سهولت استفاده از این تکنیک نیز باعث شده برای شناسایی پروتئین‌های جدا شده توسط ژل بسیار کاربردی باشد. با استفاده از CBB می‌توان پروتئین‌های بین 5/2 تا 100 نانوگرم را شناسایی کرد. با وجود اینکه رنگ آمیزی CBBکاربرد زیادی در بیوشیمی، تشخیص پزشکی و انگشت نگاری دارد. اما رنگ‌آمیزی و رنگ‌زدایی زمان زیادی میطلبد و به معرف‌های زیادی نیاز دارد.
سخن پایانی
تکنیک رنگ‌آمیزی کوماسی بریلینت بلو یک روش متداول در آزمایشگاه‌های بیوشیمی و پزشکی قانونی است. این روش برای تجسم روتین پروتئین‌های جدا شده روی ژل‌های پلی آکریل آمید بسیار کاربرد دارد. این کار برای جداسازی و تجزیه و تحلیل ماکرومولکول‌ها (DNA , RNA و پروتئین‌ها) و قطعات آن‌ها با توجه به اندازه و بار آن‌ها است. در این مطلب سعی کردیم به مرور این روش و نحوه انجام آن بپردازیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.
واژه نامه
| Coomassie Brilliant Blue | [1] |
