تفاوت الایزا و وسترن بلات : مقایسه‌ی دو روش رایج سنجش ایمنی

اگر در آزمایشگاه کار می‌کنید و سنجش ایمنی انجام می‌دهید، احتمالاً در برخی مواقع مجبور شده‌اید بین روش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (الایزا) و تکنیک‌های وسترن بلات یکی را انتخاب کنید. هر دو روش مزایا و معایب خود را دارند، بنابراین تصمیم گیری برای اینکه از کدام استفاده کنید می‌تواند چالش برانگیز باشد. این مقاله نگاهی دقیق‌تر به تفاوت الایزا و وسترن بلات دارد تا به شما کمک کند مناسب ترین روش را برای گردش کار آزمایشگاه خود انتخاب کنید. پس در ادامه با ما همراه باشید.

سنجش‌ ایمنی چیست؟

پیش از اینکه به بررسی تفاوت الایزا و وسترن بلات بپردازیم، بهتر است ابتدا مروری کلی بر ایمونواسی‌ها داشته باشیم.

ایمونواسی‌ یا سنجش ایمنی بر مکانیزم اتصال آنتی بادی-آنتی ژن متکی است که به طور طبیعی در سیستم ایمنی رخ می‌دهد. آنتی‌بادی‌ای که توسط پاسخ ایمنی تطبیقی تولید می‌شود، فقط به یک آنتی‌ژن خاص پاسخ می‌دهد و آزمایش‌های ایمنولوژیکی از این خاصیت برای شناسایی مولکول مورد نظر – که معمولاً یک پروتئین است – در یک نمونه استفاده می‌کنند.

انواع مختلفی از آزمایش‌های سنجش ایمنی در چند دهه گذشته توسعه یافته است، از جمله ELISA و وسترن بلات که دو روش رایج هستند و در این مقاله به مقایسه و تفاوت آن‌ها پرداخته خواهد شد.

الایزا، یک سنجش ایمنی پرکاربرد

سنجش ایمنی الایزا، سنجش‌های بسیار اختصاصی و حساسی هستند که برای تشخیص غلظت‌های کمتر از ۰٫۰۱ نانوگرم آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در هر میلی‌لیتر نمونه استفاده می‌شوند.

تکنیک الایزا به طور کلی به ۴ روش انجام می‌شود:

مستقیم، غیرمستقیم، ساندویچ و رقابتی

این روش معمولاً در پلیت‌های ۹۶ چاهکی انجام می‌شوند. از کف چاهک‌های به عنوان یک سطح جامد برای بی‌حرکت کردن کمپلکس‌های آنتی‌بادی-آنتی‌ژن استفاده می‌شود. از آنجایی که آنزیم به صورت کووالانسی به یکی از مولکول‌های موجود در کمپلکس متصل می‌شود، اگر آنتی ژن یا آنتی‌بادی مورد نظر در نمونه وجود داشته باشد، افزودن یک سوبسترای خاص آنزیم منجر به یک محصول واکنش رنگی قابل تشخیص می‌شود.  به کمک تکنیک الایزا می‌توان به نتایج کیفی، نیمه کمی یا کمی دست یافت.  

مروری بر نام گذاری وسترن بلات

تکنیک وسترن بلات در سال ۱۹۸۱ توسط والتر نیل برنت^[۱]، فوق دکترا در آزمایشگاه نوینسکی^[۲] در مرکز سرطان فرد هاچینسون^[۳] در سیاتل انجام شد. قبل از پرداختن به جزئیات و روش‌های مربوط به وسترن بلاتینگ، اجازه دهید مروری بر تاریخچه نام‌گذاری ان داشته باشیم.

نام «وسترن بلات» به نوعی برگرفته از نام‌گذاری‌هایی است که قبلاً در روش‌های مشابه استفاده شده بود. این نام به «سانترن بلات» اشاره دارد که در سال ۱۹۷۵ توسط اد سانترن اختراع شد. همچنین به «نورترن بلات» که در سال ۱۹۷۷ توسط جیمز آلواین معرفی گردید. اما چرا «وسترن»؟

جیمز آلواین وقتی این روش را اختراع کرد، برای نام‌گذاری از جهت جغرافیایی استفاده کرد و به جای استفاده از  eastern (به معنای شرقی)، واژه western (به معنای غربی) را برگزید. دلیل این انتخاب هم این بود که آزمایشگاه او در سیاتل، واقع در سواحل غربی ایالات متحده، قرار داشت. بنابراین، نام «وسترن بلات» بیشتر به موقعیت جغرافیایی آزمایشگاه او اشاره دارد.

وسترن بلات، سنجش ایمنی رایج

به‌طور خلاصه، وسترن بلات (که به آن ایمونوبلات نیز گفته می‌شود) یک نوع سنجش ایمنی است که برای شناسایی یک پروتئین خاص، مانند یک آنتی‌ژن، در نمونه‌ای متشکل از ترکیبی از پروتئین‌ها استفاده می‌شود. برای این منظور، ابتدا پروتئین‌های نمونه باید دناتوره شده و بر اساس اندازه جدا شوند. سپس پروتئین‌ها به یک غشاء منتقل می‌شوند. از آنتی بادی‌ها برای تشخیص پروتئین مورد نظر استفاده می‌شود.

نتیجه این فرآیند از طریق یکی از روش‌های آنالیز رنگ‌سنجی (colorimetric)، شیمی‌لومینسانس (chemiluminescence) یا فلورسانس (fluorescence) قابل مشاهده است. روش تشخیص رادیواکتیو نیز امکان‌پذیر است، اما به دلیل خطرات بهداشتی و ایمنی، امروزه به‌ندرت مورد استفاده قرار می‌گیرد.در ادامه بخش‌های مختلف وسترن بلات را مورد بررسی قرار خواهیم داد.

مراحل وسترن بلات

به طور کلی می‌توانیم سنجش ایمنی وسترن بلات را به سه مرحله اصلی تقسیم کنیم:

• جداسازی پروتئین‎ها بر اساس اندازه
• انتقال پروتئین‌ها به غشاء
• برچسب‌گذاری (لیبل‌دار کردن) پروتئین‌ها با استفاده از آنتی‌بادی

در ادامه به تفکیک به بررسی هر مرحله خواهیم پرداخت.

مرحله اول، جداسازی پروتئین

مرحله اول این نوع سنجش ایمنی با استفاده از ژل الکتروفورز به دست می‌آید. نمونه‌‌ها در چاهک‌های بالای ژل بارگذاری می‌شوند. سپس یک جریان الکتریکی به ژل وارد می‌شود و باعث می‌شود پروتئین‌ها از طریق آن عبور کنند. دو عامل بر سرعت حرکت پروتئین‌های نمونه تأثیر می‌گذارد: اندازه و بار الکتریکی

برای جداسازی پروتئین‌ها بر اساس اندازه، نیاز است که پروتئین‌ها بار یکنواختی داشته باشند. بنابراین، از سدیم دودسیل سولفات (SDS) استفاده می‌شود که باعث می‌شود پروتئین‌ها به زنجیرهای خطی باز شوند و یک بار منفی دریافت کنند.

ترکیب متخلخل پلی‌آکریل‌آمید ژل باعث می‌شود پروتئین‌های کوچک سریع‌تر از پروتئین‌های بزرگ حرکت کنند، که منجر به تشکیل باندهایی می‌شود که حاوی پروتئین‌هایی با اندازه یکسان هستند. غلظت پلی‌آکریل‌آمید اندازه منافذ در شبکه ژل را تعیین می‌کند و می‌توان آن را تنظیم کرد تا توزیع یکنواخت پروتئین‌ها و نتیجه الکتروفورز رضایت‌بخش حاصل شود. به طور کلی، پروتئین‌های بزرگ در ژل‌هایی با درصد کم پلی‌آکریل‌آمید به راحتی جداسازی می‌شوند، در حالی که پروتئین‌های کوچک به ژل‌هایی با درصد بالای پلی‌آکریل‌آمید نیاز دارند.

مرحله دوم، انتقال پروتئین به غشاء

مرحله دوم فرآیند وسترن بلات شامل انتقال پروتئین‌های جابجا شده به غشای بلات است. رایج‌ترین تکنیک مورد استفاده، انتقال الکتروفورِتیک است، جایی که ژل و غشا بین کاغذ فیلتر قرار می‌گیرند و بین الکترودها قرار داده می‌شوند، سپس یک میدان الکتریکی پروتئین‌ها را از ژل به غشا منتقل می‌کند.

مرحله سوم، برچسب گذاری در سنجش ایمنی

مرحله سوم سنجش ایمنی وسترن بلات، شباهت زیادی به ELISA دارد. در این مرحله، شما باید غشا را با یک بافر مسدودکننده انکوبه کنید که به هر یک از سایت‌های باقی‌مانده اتصال پروتئین متصل می‌شود تا از اتصال غیر اختصاصی آنتی‌بادی‌ها به غشا جلوگیری کند.

پس از شستشو، می‌توانید یکی از روش‌های نشانه‌گذاری مستقیم یا غیرمستقیم را انتخاب کنید. در روش مستقیم، غشا با آنتی‌بادی‌های برچسب‌دار انکوبه می‌شود که به پروتئین‌های مورد نظر متصل می‌شوند، سپس آنتی‌بادی‌های غیر متصل شسته می‌شوند. در روش غیرمستقیم، از دو آنتی‌بادی استفاده می‌شود: آنتی‌بادی اولیه و آنتی‌بادی ثانویه. در مرحله اول، غشا با آنتی‌بادی‌های اولیه بدون برچسب انکوبه می‌شود که به پروتئین‌های مورد نظر متصل می‌شوند. پس از شستشو، مرحله دوم انکوباسیون انجام می‌شود، که در آن از آنتی‌بادی‌های ثانویه برچسب‌دار استفاده می‌شود که به آنتی‌بادی‌های اولیه متصل می‌شوند. پس از آن، یک مرحله شستشوی نهایی برای حذف هر مولکول غیر متصل انجام می‌شود.

مزایا و معایب انواع برچسب گذاری

هر دو پروتکل نشانه‌گذاری مزایا و معایب خود را دارند. نشانه‌گذاری مستقیم فرآیندی سریع‌تر است که می‌تواند در زمان و مواد مصرفی صرفه‌جویی کند. همچنین، خطر اتصال غیر اختصاصی آنتی‌بادی کاهش می‌یابد چون تنها از یک آنتی‌بادی استفاده می‌شود. از طرف دیگر، وسترن بلات غیرمستقیم حساسیت بیشتری دارد زیرا چندین آنتی‌بادی ثانویه می‌توانند به یک آنتی‌بادی اولیه متصل شوند و سیگنال قابل شناسایی را تقویت کنند. روش غیرمستقیم همچنین انعطاف‌پذیری بیشتری ارائه می‌دهد، زیرا آنتی‌بادی‌های ثانویه می‌توانند به چندین آنتی‌بادی اولیه از همان نوع و از یک گونه میزبان مشترک متصل شوند. این بدان معناست که از همان آنتی‌بادی ثانویه برچسب‌دار می‌توان در کاربردهای مختلف وسترن بلات غیرمستقیم استفاده کرد، در حالی که برای انجام پروتکل مستقیم، به چندین آنتی‌بادی اولیه برچسب‌دار نیاز است.

ملاحظات سنجش ایمنی وسترن بلات

لطفاً توجه داشته باشید که آکریل‌آمید غیرپلیمری سرطان‌زا و جهش‌زا است و باید همیشه در یک کابین ایمنی زیستی با استفاده از تجهیزات حفاظتی شخصی مناسب مورد استفاده قرار گیرد.

علاوه بر نمونه‌های خود، باید یک نشانگر مولکولی که حاوی چندین پروتئین با وزن مولکولی شناخته شده است را نیز به ژل اضافه کنید. این کار به شما کمک می‌کند تا بررسی کنید که آیا الکتروفورز موفقیت‌آمیز بوده است و آیا انتقال پروتئین‌ها به غشای بلات به درستی انجام شده است. علاوه بر این، به شما این امکان را می‌دهد که طول پروتئین‌های مورد نظر خود را برآورد کنید، زیرا می‌توانید مسیر حرکت آن‌ها از طریق ژل را با مسافتی که پروتئین‌های نشانگر مولکولی طی کرده‌اند مقایسه کنید. این روش اغلب به اختصار SDS-PAGE (الکتروفورز ژل پلی‌آکریل‌آمید با سدیم دودسیل سولفات) نامیده می‌شود، زیرا الکتروفورز ژل برای وسترن بلات از SDS و پلی‌آکریل‌آمید استفاده می‌کند.

آنالیز نتایج وسترن بلات

برای تجزیه و تحلیل سنجش ایمنی وسترن بلات، باید سیگنال تولید شده توسط آنتی‌بادی‎های نشاندار شده را اندازه‌گیری کنید. مراحل تشخیص و تجهیزات بسته به اینکه آنتی‌بادی‌ها با آنزیم یا فلوروفور برچسب‌گذاری شده باشند متفاوت است.

تشخیص آنزیمی سنجش ایمنی

اگر آنتی‌بادی شما با آنزیم برچسب‌گذاری شده باشد، می‌توانید از روش‌های رنگ سنجی یا تشخیص نورتابی شیمیایی برای تجزیه و تحلیل وسترن بلات خود استفاده کنید.

روش های رنگ سنجی

روش‌های رنگ‌سنجی در سنجش ایمنی نیاز به اعمال یک زیرلایه کروموژنیک خاص آنزیم به غشا دارند؛ واکنشی که توسط آنزیم‌های متصل به آنتی‌بادی‌ها کاتالیز می‌شود، یک محصول واکنش رنگی تولید خواهد کرد. سپس محلول توقف اضافه می‌شود تا فرایند توسعه رنگ متوقف شود، و محصولات کروموژنیک واکنش آنزیمی به‌صورت باندهایی قابل مشاهده با چشم غیر مسلح خواهند بود. تحلیل وسترن بلات رنگ‌سنجی می‌تواند سریع و مقرون به‌صرفه انجام شود، زیرا به تجهیزات خاص تشخیصی نیاز ندارد. با این حال، این روش حساسیت زیادی ندارد و برای تولید یک باند قابل مشاهده، پروتئین‌ها باید در محدوده نانوگرم باشند.

روش‎های شیمی لومینسانس

روش‌های تشخیص شیمی‌لومینسانس نیز به یک زیرلایه خاص آنزیم نیاز دارند، اما این بار زیرلایه‌ای که لومینسانس است به جای کروموژنیک. این بدان معناست که واکنش آنزیمی پس از اضافه کردن زیرلایه به غشا، نور به‌عنوان یک محصول جانبی تولید می‌کند. سپس این نور می‌تواند با استفاده از فیلم اشعه ایکس یا دوربین دستگاه متصل به بار (CCD) شناسایی شود. مزیت اصلی تشخیص شیمی‌لومینسانس حساسیت بالای آن است؛ این روش می‌تواند برای شناسایی و اندازه‌گیری حتی مقدار کمی از پروتئین مورد نظر، تا حد فمتوگرم، استفاده شود. با این حال، یکی از معایب این تکنیک این است که نور تنها به‌طور موقت تولید می‌شود، زمانی که آنزیم زیرلایه را به محصول تبدیل می‌کند، و بنابراین تشخیص باید بلافاصله پس از اضافه کردن زیرلایه انجام شود.

تشخیص فلورسانس

اگر در سنجش ایمنی آنتی‌بادی‌های شما با فلوروفور برچسب‌دار شده باشند، نیازی به اضافه کردن زیرلایه به غشا ندارید. درعوض، می‌توانید غشا را به‌طور مستقیم با استفاده از یک سیستم تصویربرداری فلورسانس تصویربرداری کنید، جایی که منبع نور فلوروفورها را تحریک کرده و سیگنال‌های فلورسانسی که منتشر می‌شوند، توسط فیلترهای خاص طول موج و سیستم‌های دوربین دیجیتال شناسایی می‌شوند.

برچسب‌گذاری آنتی‌بادی‌ها با فلوروفورها به جای آنزیم‌ها مزایای زیادی دارد. اولاً، برچسب‌گذاری آنتی‌بادی‌های مختلف با فلوروفورهای متفاوت این امکان را می‌دهد که به‌طور همزمان پروتئین‌های مختلف با وزن مولکولی مشابه را شناسایی کنید (چندگانه‌سازی). ثانیاً، ازآنجا که سیگنال‌های فلورسانسی هنوز بعد از ماه‌ها ذخیره‌سازی در دمای اتاق قابل شناسایی هستند، این روش انعطاف‌پذیری زیادی در تجزیه و تحلیل داده‌های آزمایش فراهم می‌آورد. ثالثاً، تشخیص فلورسانس آسان است زیرا نیازی به اضافه کردن زیرلایه ندارید. تنها معایب این روش تشخیص نیاز به یک سیستم تصویربرداری خاص و حساسیت کمتر نسبت به تشخیص شیمی‌لومینسانس است.

سنجش ایمنی الایزا در مقایسه با وسترن بلات

حالا که با نحوه انجام و تحلیل دو سنجش ایمنی اصلی آشنا شدید، چطور باید تصمیم بگیرید که کدام تکنیک را انتخاب کنید؟

به‌طور کلی، ELISA از وسترن بلات ساده‌تر و سریع‌تر است. زیرا پروتکل آن زمان کمتری می‌برد و مراحل کمتری دارد. علاوه بر این، ELISA برای آزمایشگاه‌هایی که نیاز به پردازش تعداد زیادی نمونه دارند (آزمایشگاه‌های با بازده بالا) مناسب‌تر است، زیرا این روش به حجم نمونه کمتری نیاز دارد و معمولاً در پلیت‌های ۹۶ چاهکی انجام می‌شود که این امکان را می‌دهد تا آزمایش‌ها به‌راحتی خودکار شوند. این ویژگی‌ها باعث می‌شود که ELISA انتخاب بهتری برای آزمایش‌های کم‌هزینه و پرحجم باشد، در حالی که وسترن بلات بیشتر برای آزمایش‌های خاص و دقیق‌تری که نیاز به تحلیل پروتئین‌های خاص دارند، استفاده می‌شود.

داده‌های کمی قابل اعتماد در ELISA و وسترن بلات

وقتی صحبت از به‌دست آوردن داده‌های کمی قابل اعتماد در ELISA می‌شود، می‌توان یک منحنی استاندارد ساده ایجاد کرد و از معادله آن برای محاسبه غلظت آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در نمونه‌ها بر اساس مقادیر جذب استفاده کرد. اما انجام وسترن بلات کمی پیچیده‌تر است. این روش نیازمند توجه به چندین عامل مانند بارگذاری بیش از حد نمونه‌ها، اشباع غشا و اشباع سیگنال است. علاوه بر این، کنترل‌های بارگذاری داخلی مانند پروتئین‌های خانه‌دار ضروری است، داده‌ها باید نرمال‌سازی شوند و سیگنال پس‌زمینه برای تحلیل کمی باید کم شود. با این حال، حتی اگر انجام وسترن بلات پیچیده و زمان‌بر باشد، برای برخی از کاربردها ترجیح داده می‌شود. اولین مزیت وسترن بلات این است که این روش بسیار خاص است و گاهی برای رد کردن نتایج مثبت کاذب و تایید نتایج مثبت ELISA در محیط‌های بالینی استفاده می‌شود. این به دلیل تفکیک اولیه اندازه پروتئین‌ها است که اطمینان می‌دهد سیگنال‌های غیر اختصاصی از آنالیت‌ها، که احتمالاً اندازه متفاوتی خواهند داشت، به‌راحتی به‌عنوان یک باند دوم در غشا قابل شناسایی هستند.

اطلاعات اضافی و مزایای سنجش ایمنی وسترن بلات

دومین مزیت وسترن بلات این است که اطلاعات بیشتری در مورد پروتئین هدف و نمونه به‌طور کلی فراهم می‌کند. برخلاف ELISA که تنها وجود یا عدم وجود یک آنالیت در نمونه را شناسایی می‌کند، وسترن بلات می‌تواند طول پروتئین را مشخص کرده و خلوص نمونه را تحلیل کند. بنابراین، پروتکل کمی طولانی‌تر و خسته‌کننده‌تر ممکن است ارزش انجام داشته باشد اگر آزمایش شما نیاز به اطلاعات گسترده‌تری داشته باشد.

شناسایی چندین پروتئین به‌طور هم‌زمان در وسترن بلات

مزیت سوم و مهم سنجش ایمنی وسترن بلات ، اگرچه فقط در صورتی که آنتی‌بادی تشخیصی با فلوروفور برچسب‌دار شده باشد صادق است، توانایی آن در شناسایی چندین پروتئین در هر نمونه به‌صورت هم‌زمان است. این ویژگی به شما این امکان را می‌دهد که در یک آزمایش، پروتئین‌های مختلف را به‌طور موازی شناسایی کنید.

سنجش ایمنی مبتنی بر مهره

در این آزمایش ایمنولوژیکی، مهره‌هایی با آنتی‌بادی‌های خاص پوشش داده شده و با رنگ فلوروسنت قرمز منحصربه‌فردی برچسب‌گذاری می‌شوند تا امکان شناسایی آن‌ها فراهم شود. آنتی‌بادی‌های تشخیصی که به فلوروفور سبز متصل هستند، به آنالیت‌های هدف متصل شده و کمپلکس‌هایی را تشکیل می‌دهند. سپس، این ترکیب با استفاده از سیتومتری جریان بررسی می‌شود. لیزر قرمز، شدت رنگ مهره‌ها را تحلیل کرده و نوع آنالیت متصل را مشخص می‌کند، درحالی‌که لیزر سبز وجود سیگنال فلوروسنت سبز را بررسی کرده و نشان می‌دهد که آنتی‌بادی‌های تشخیصی به آنالیت‌ها متصل شده‌اند یا نه.

ریزآرایه‌های پروتئینی

میکروآرایه‌های پروتئینی (که به آن‌ها چیپ‌های پروتئینی نیز گفته می‌شود) مشابه انجام چندین آزمایش ELISA نوع ساندویچی به‌طور همزمان روی یک سطح جامد هستند. سطح جامد – که می‌تواند غشا، شیشه میکروسکوپی یا چاهک‌های یک میکروپلیت باشد – از قبل با آنتی‌بادی‌های خاصی برای آنالیت‌های مورد نظر پوشش داده می‌شود. وقتی این سطح جامد با یک نمونه انکوبه می‌شود، آنالیت‌ها، در صورت وجود، به آنتی‌بادی‌های جذب‌کننده متصل می‌شوند و سپس می‌توانند با استفاده از آنتی‌بادی‌های برچسب‌گذاری شده شناسایی شوند. چون می‌دانید که رنگ شماره ۱ قرار است آنالیت A را متصل کند، رنگ ۲ آنالیت B را و به همین ترتیب، الگوی ایجاد شده پس از تجزیه و تحلیل به شما این امکان را می‌دهد که تعیین کنید کدام آنالیت‌ها در نمونه شما وجود دارند.

سخن پایانی

الایزا و وسترن بلات دو روش سنجش ایمنی هستند که می‌توانند برای شناسایی حضور یک پروتئین در یک نمونه استفاده شوند. هر کدام از این روش‌ها مزایا و معایب خاص خود را دارند. تکنیک‌های الایزا آسان‌تر و سریع‌تر انجام می‌شوند و برای آزمایشگاه‌های با بازده بالا مناسب‌تر هستند. در حالی‌که روش وسترن بلات دقیق‌تر است. می‌تواند اطلاعات بیشتری درباره پروتئین هدف و نمونه در اختیار قرار دهد و امکان انجام آزمایش‌های چندگانه را فراهم می‌کند. انتخاب روش مناسب بستگی به کاربرد خاص آزمایش دارد. علاوه بر این، تکنیک‌های جایگزینی مانند آزمایش‌های ایمنولوژیکی مبتنی بر مهره و میکروآرایه‌های پروتئینی وجود دارند که ممکن است برای انجام آزمایش‌های چندگانه با بازده بالا مناسب‌تر باشند.