آزمایش الایزا: آشنایی با انواع این آزمایش و اصول انجام آن

آزمون ایمنو-آنزیمی (ELISA) به عنوان استاندارد طلایی در میان آزمون‌های ایمنولوژیکی کنونی شناخته می‌شود. این روش پرکاربرد، که بر مبنای صفحات میکروچاهک است، برای شناسایی و اندازه‌گیری پپتیدها، پروتئین‌ها، آنتی‌بادی‌ها و هورمون‌ها به کار می‌رود. آزمایش الایزا در بسیاری از حوزه‌های تحقیقاتی و کاربردهای عملی، از جمله کاربردهای بالینی مانند شناسایی عفونت‌های ویروسی، به طور گسترده‌ای استفاده می‌شود. در این مقاله به بررسی انواع مختلف آزمون‌های ELISA، روش‌های تجزیه و تحلیل داده‌های حاصل از این آزمایش‌ها و مواد شیمیایی و تجهیزات مورد نیاز برای انجام آن‌ها در آزمایشگاه خواهیم پرداخت.

مقدمه‌ای بر انواع مختلف آزمایش الایزا

آزمون ELISA (آزمون ایمنو-آنزیمی) یک روش تحلیلی است که عمدتاً در تحقیقات علمی و کاربردهای بالینی استفاده می‌شود. این آزمون‌ها به‌ویژه برای شناسایی عفونت‌های ویروسی مانند ویروس هپاتیت B، ویروس هپاتیت C و ویروس نقص ایمنی انسانی (HIV) کاربرد دارند. در این مقاله، به بررسی انواع مختلف آزمایش الایزا خواهیم پرداخت، روش‌های تجزیه و تحلیل داده‌های حاصل از این آزمایش‌ها را توضیح خواهیم داد و همچنین نگاهی به مواد شیمیایی و تجهیزات مورد نیاز برای انجام این آزمایش‌ها خواهیم انداخت.

ELISA چیست؟

ابتدا با یک تعریف کلی از آزمون ELISA شروع می‌کنیم، پیش از آنکه به بررسی روش‌های مختلف آن بپردازیم:

آزمون ELISA (آزمون ایمنوآنزیمی) نوعی از آزمون‌های ایمنولوژیکی (EIA) است که به‌طور خاص و حساس برای شناسایی غلظت‌های بسیار پایین آنتی‌ژن‌ها یا آنتی‌بادی‌ها طراحی شده است. این آزمایش‌ها قادرند غلظت‌هایی معادل ۰.۰۱ نانوگرم از آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی را در هر میلی‌لیتر شناسایی کنند. طی انجام  آزمایش الایزا، کمپلکس‌های آنتی‌ژن-آنتی‌بادی به یک سطح جامد (مانند کف چاهک‌های میکروپلیت) متصل می‌شوند. سپس یک آنزیم به‌طور کووالانسی به یکی از مولکول‌های حاضر در این کمپلکس متصل می‌شود. با افزودن سوبسترای خاص آنزیم، یک واکنش رنگی تولید می‌شود که شدت آن می‌تواند برای اندازه‌گیری غلظت آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی مورد نظر در نمونه استفاده شود.

انواع مختلف آزمایش ELISA

آزمایش  ELISA به چهار نوع اصلی تقسیم می‌شوند: مستقیم^[۱]، غیرمستقیم^[۲]، ساندویچی^[۳] و رقابتی^[۴].

تمامی این آزمایش‌ها معمولاً در پلیت‌های ۹۶ چاهکی انجام می‌گیرند. به طوری که کف چاهک‌ها به‌عنوان سطح جامد برای ثابت کردن کمپلکس‌های آنتی‌ژن-آنتی‌بادی استفاده می‌شود. هر یک از این چهار نوع آزمون ویژگی‌ها، مزایا و معایب خاص خود را دارند که در بخش‌های بعدی به‌طور مفصل به آن‌ها پرداخته خواهد شد.

آزمایش الایزا مستقیم

پروتکل آزمایش  ELISA مستقیم برای شناسایی آنتی‌ژن‌ها طراحی شده و از چهار مرحله اصلی تشکیل می‌شود:

۱- پوشش پلیت: ابتدا نمونه‌ها با استفاده از بافر پوشش رقیق شده و سپس در چاهک‌های پلیت ریخته می‌شوند. پس از انکوباسیون، محلول را دور ریخته شده و پلیت با بافر شسته خواهد شد. به این ترتیب پروتئین‌های موجود در نمونه، از جمله آنتی‌ژن مورد نظر، به سطح صفحه متصل می‌شوند.

۲- انسداد صفحه: در این مرحله، بافر انسداد را به صفحه اضافه شده و انکوبه می‌شود. بافر انسداد به سایت‌های باقی‌مانده از اتصال پروتئین‌ها در چاهک‌های پوشش داده شده متصل می‌شود و این عمل از اتصال غیر اختصاصی آنتی‌بادی‌ها به سطح پلیت جلوگیری می‌کند. سپس پلیت دوباره با بافر شست و شو، شسته خواهد شد.

۳- انکوباسیون آنتی‌بادی: در این مرحله آنتی‌بادی‌های برچسب‌دار آنزیمی به پلیت منتقل شده و انکوباسیون انجام می‌شود. آنتی‌بادی‌ها به آنتی‌ژن‌های موجود در چاهک‌هایی که آنالایت (آنتی‌ژن) در آن‌ها وجود دارد، متصل می‌شوند. پس از انکوباسیون لازم است آنتی‌بادی‌های غیرمتصل با بافر شسته شوند.

۴- شناسایی: در این مرحله، یک سوبسترای خاص آنزیم به پلیت اضافه می‌شود. آنزیم‌های متصل به آنتی‌بادی‌ها واکنش رنگی تولید می‌کنند. پس از افزودن محلول توقف برای خاتمه دادن به توسعه رنگ، جذب هر چاهک را با دستگاه شمارشگر اندازه گیری می شود. شدت سیگنال به شما این امکان را می‌دهد که مشخص کنید آیا نمونه حاوی آنتی‌ژن مورد نظر است و در چه غلظتی است.

آزمایش الایزا غیرمستقیم

تنها تفاوت بین ELISA مستقیم و غیرمستقیم در این است که فرآیند انکوباسیون آنتی‌بادی به دو مرحله تقسیم می‌شود. پس از پوشش دادن و انسداد پلیت، آنتی‌بادی‌های اولیه که به آنتی‌ژن‌های مورد نظر متصل می‌شوند، به پلیت اضافه و سپس انکوبه می‌شوند. پس از مرحله شستشو، آنتی‌بادی‌های ثانویه برچسب‌دار آنزیمی – که به آنتی‌بادی‌های اولیه متصل می‌شوند ولی به آنتی‌ژن‌های هدف متصل نمی‌شوند – به پلیت اضافه می‌شوند. پس از انکوباسیون مجدد پلیت و شستن آنتی‌بادی‌های ثانویه غیرمتصل، مرحله شناسایی می‌تواند انجام شود.

تفاوت آزمایش ELISA مستقیم و غیرمستقیم

مزیت ELISA مستقیم صرفه‌جویی در زمان و مواد مصرفی  است. زیرا پروتکل آن کمی کوتاه‌تر است. علاوه بر این، خطر واکنش متقابل (cross-reactivity) کاهش می‌یابد. واکنش متقابل زمانی رخ می‌دهد که آنتی‌بادی‌ها به‌طور غیر اختصاصی به اپیتوپ‌های موجود در مولکول‌هایی که آنتی‌ژن هدف نیستند، متصل شوند. از آنجا که در ELISA مستقیم فقط از یک آنتی‌بادی استفاده می‌شود و نه دو آنتی‌بادی، این خطر کمتر است.

آزمایش الایزا غیرمستقیم با وجود پروتکل طولانی‌تر و خطر بالاتر آلودگی متقابل، مزایای زیادی نیز دارد. به‌عنوان مثال، این روش حساسیت بیشتری دارد، زیرا چندین آنتی‌بادی ثانویه می‌توانند به یک آنتی‌بادی اولیه متصل شوند و سیگنال قابل شناسایی را تقویت کنند.

علاوه بر این، ELISAهای غیرمستقیم انعطاف‌پذیری بیشتری را ارائه می‌دهند. یک آنتی‌بادی ثانویه می‌تواند به چندین آنتی‌بادی اولیه اختصاصی باشد، به شرطی که آن‌ها از نوع یکسان و از یک گونه میزبان مشابه باشند. این به این معنی است که همان آنتی‌بادی ثانویه برچسب‌دار می‌تواند در کاربردهای مختلف ELISA غیرمستقیم استفاده شود. در حالی که برای انجام پروتکل‌های مختلف ELISA مستقیم نیاز به چندین آنتی‌بادی اولیه برچسب‌دار است.

یکی دیگر از مزایای ELISAهای غیرمستقیم این است که آ‌ن‌ها نه تنها قادر به شناسایی آنتی‌ژن‌ها هستند، بلکه می‌توانند آنتی‌بادی‌ها را نیز شناسایی کنند. برای این کار، باید پلیت را با آنتی‌ژن‌هایی پوشش داد که به آنتی‌بادی‌های مورد نظر متصل شوند، سپس در مرحله اول انکوباسیون آنتی‌بادی، نمونه‌ها به جای آنتی‌بادی‌های اولیه اضافه شوند.

آزمایش الایزا ساندویچی

در روش ELISA ساندویچی، برخلاف سایر انواع، پلیت با آنتی‌ژن‌ها پوشش داده نمی‌شود. بلکه به جای آن، پلیت با آنتی‌بادی‌های گیرنده (capture antibodies) اختصاصی برای آنتی‌ژن مورد نظر پوشش داده می‌شود. پس از این مرحله، با استفاده از بافر مخصوصی که به سایت‌های غیر اشغال شده توسط آنتی‌بادی‌های گیرنده متصل می‌شود، سایت‌های باقی‌مانده برای اتصال پروتئین‌ها مسدود می‌شوند. سپس نمونه‌ها به چاهک‌ها اضافه می‌شوند. در طول مرحله انکوباسیون، آنتی‌ژن‌های مورد نظر به آنتی‌بادی‌های گیرنده متصل شده و در این مرحله کمپلکس آنتی‌ژن-آنتی‌بادی تشکیل می‌شود.

در مرحله بعدی، پلیت یا با آنتی‌بادی‌های شناسایی برچسب‌دار آنزیمی (که در ELISA ساندویچی مستقیم استفاده می‌شود) انکوبه می‌شود، یا با آنتی‌بادی‌های اولیه و سپس آنتی‌بادی‌های ثانویه برچسب‌دار آنزیمی (که در ELISA ساندویچی غیرمستقیم کاربرد دارد) انکوبه می‌شود. نکته مهم در ELISA ساندویچی غیرمستقیم این است که آنتی‌بادی‌های گیرنده و اولیه باید از گونه‌های میزبان مختلف باشند تا اختصاصیت آزمون افزایش یابد و از تداخل غیر اختصاصی جلوگیری شود.

این روش به دلیل استفاده از دو آنتی‌بادی که به بخش‌های مختلف اپیتوپ آنتی‌ژن متصل می‌شوند، دقت و حساسیت بالایی دارد و برای نمونه‌های پیچیده که ممکن است حاوی مولکول‌های مشابه باشند، مناسب است.مزیت ELISAهای ساندویچی این است که آن‌ها بسیار خاص هستند. دو آنتی‌بادی که آنتی‌ژن را شناسایی می‌کنند، به اپیتوپ‌های مختلف آن متصل می‌شوند، که این امر تقریباً غیرممکن می‌کند که هر دو آنتی‌بادی به‌طور غیر اختصاصی متصل شوند. بنابراین، ELISAهای ساندویچی روش مناسبی برای نمونه‌های پیچیده هستند.

یکی از معایب ELISAهای ساندویچی این است که گاهی اوقات پیدا کردن دو آنتی‌بادی که به خوبی با هم کار کنند و در عین حال به اپیتوپ‌های مختلف همان آنتی‌ژن متصل شوند، می‌تواند دشوار باشد.

آزمایش الایزا رقابتی

در ELISA رقابتی (که به آن‌ها ELISA مهار یا inhibition ELISA نیز گفته می‌شود)، مقدار مولکول‌های برچسب‌دار محدود است و آنتی‌ژن‌ها یا آنتی‌بادی‌های موجود در نمونه با آنتی‌ژن‌ها یا آنتی‌بادی‌های مرجع برای اتصال به این مولکول‌های برچسب‌دار رقابت می‌کنند. به عبارت دیگر، این روش به‌صورت غیرمستقیم میزان غلظت آنالایت را از طریق شناسایی تداخل سیگنال اندازه‌گیری می‌کند.

تمامی انواع ELISA از جمله مستقیم، غیرمستقیم و ساندویچی می‌توانند به این فرمت رقابتی تطبیق یابند. با این حال، پروتکل‌ها و مواد مصرفی در ELISA رقابتی ممکن است با سایر انواع تفاوت‌هایی داشته باشند.

پروتکل ELISA رقابتی مستقیم

برای انجام یک آزمایش الایزا رقابتی مستقیم، مراحل زیر به‌عنوان مثال می‌تواند دنبال شود:

۱- پوشش پلیت: پلیت را با آنتی‌ژن مرجع پوشش داده و سپس سایت‌های باقی‌مانده برای اتصال به آنتی‌بادی‌ها با استفاده از بافر مناسب مسدود می‌شود.

۲- انکوباسیون نمونه: نمونه‌ای که غلظت آنتی‌ژن آن ناشناخته است، با مقدار محدودی از آنتی‌بادی‌های برچسب‌دار انکوبه می‌شود. اگر غلظت آنتی‌ژن در نمونه کم باشد، بخش زیادی از آنتی‌بادی‌ها قادر نخواهند بود به آنتی‌ژن نمونه متصل شوند و بالعکس.

۳- انتقال مخلوط به پلیت: مخلوط آنتی‌بادی‌های برچسب‌دار و نمونه، به چاهک‌های پوشش داده شده با آنتی‌ژن مرجع منتقل می‌شود. در این مرحله، آنتی‌بادی‌هایی که نتواسته‌اند به آنتی‌ژن‌های نمونه متصل شوند، به آنتی‌ژن مرجع متصل خواهند شد.

۴- شستشوی پلیت: پلیت شسته می‌شود تا آنتی‌بادی‌های متصل به آنتی‌ژن‌های نمونه که به پلیت ثابت نشده‌اند، حذف شوند.

۵- شناسایی و اندازه‌گیری: یک سوبسترای خاص به پلیت اضافه می‌شود و تغییر رنگ ایجاد شده اندازه‌گیری می‌شود. هرچه تغییر رنگ بیشتر باشد، نشان‌دهنده این است که آنتی‌ژن کمتری در نمونه وجود دارد و بالعکس.

مزایا و معایب ELISA رقابتی

مزایا و معایب آزمایش الایزا رقابتی بستگی به نوع پایه‌ای دارد که برای انجام این آزمایش انتخاب شده است (مستقیم، غیرمستقیم یا ساندویچی). این نوع ELISA به‌ویژه زمانی مفید است که غلظت آنالایت‌ها در نمونه‌ها بسیار کم باشد یا در مواقعی که آنتی‌ژن‌ها یا آنتی‌بادی‌ها به شدت مشابه هستند و تشخیص دقیق آن‌ها بدون رقابت غیرممکن است.

مزایا: این روش می‌تواند برای اندازه‌گیری غلظت آنالایت‌ها در نمونه‌های پیچیده بسیار مؤثر باشد. به‌ویژه زمانی که آنالایت‌ها به صورت رقابتی و در حضور مقادیر محدود آنتی‌بادی‌های برچسب‌دار اندازه‌گیری می‌شوند، حساسیت بالایی به دست می‌آید.

معایب: این روش ممکن است به دلیل رقابت بین آنالایت‌ها و آنتی‌بادی‌های برچسب‌دار برای اتصال به آنتی‌ژن مرجع، دقت کمتری نسبت به سایر انواع ELISA داشته باشد. همچنین پروتکل‌های آن ممکن است پیچیده‌تر از دیگر انواع ELISA باشند و نیاز به کنترل دقیق‌تر مراحل داشته باشد.

چگونه نتایج ELISA را تحلیل کنیم

پس از بررسی اصول عملکرد انواع مختلف ELISA، اکنون زمان آن است که در مورد تحلیل داده‌ها صحبت کنیم. ELISAها می‌توانند نتایج مختلفی را در اختیار قرار دهند که به طور کلی به سه دسته تقسیم می‌شوند:

۱- نتایج کیفی

در این حالت، هدف فقط تعیین حضور یا عدم حضور آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در نمونه است. به عبارت دیگر، در این نوع نتایج، پاسخ به این سوال داده می‌شود که آیا آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در نمونه وجود دارد یا خیر. این نتایج برای کاربردهای ابتدایی مانند غربالگری‌های اولیه یا تایید حضور یک عامل خاص مفید هستند.

۲- نتایج نیمه‌کمی

در این نوع نتایج، شما نمی‌خواهید غلظت دقیق آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی را بدانید، بلکه می‌خواهید مقایسه‌ای انجام دهید بین غلظت این مولکول‌ها در نمونه‌های مختلف. به عنوان مثال، می‌توانید تعیین کنید که غلظت آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در نمونه A بیشتر یا کمتر از نمونه B است.

۳- نتایج کمی

در این نوع، هدف تعیین غلظت دقیق آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در نمونه است. این نتایج برای مطالعات دقیق‌تر، مانند بررسی تغییرات در سطح آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در طول زمان یا در پاسخ به درمان، بسیار مفید هستند.

اهمیت کنترل‌ها در تحلیل داده‌ها

برای به‌دست آوردن نتایج قابل اعتماد و دقیق در آزمایش الایزا ، ضروری است که کنترل‌های منفی و مثبت را در هر صفحه ELISA گنجانده شود.

کنترل منفی: این کنترل‌ها به شما کمک می‌کنند تا نتایج مثبت کاذب ناشی از اتصال غیر اختصاصی یا آلودگی را شناسایی و اصلاح کنید. کنترل منفی معمولاً شامل نمونه‌ای است که هیچ آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی هدفی ندارد.

کنترل مثبت: این کنترل‌ها برای تأیید عملکرد صحیح آزمایش طراحی می‌شوند. اگر آزمایش به درستی انجام شده باشد، باید نتایج مثبتی از کنترل‌های مثبت به دست آید، حتی اگر تمام نمونه‌ها منفی باشند.

ایجاد منحنی استاندارد برای نتایج کمی

برای به‌دست آوردن نتایج کمی آزمایش الایزا ، لازم است که یک منحنی استاندارد تنظیم کنید. این منحنی به شما امکان می‌دهد تا غلظت دقیق آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در نمونه‌های ناشناخته را محاسبه کنید.

مراحل ساخت منحنی استاندارد

یک نمونه با مقدار شناخته شده از آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی مورد نظر تهیه کنید.

این نمونه را به صورت سریالی رقیق کرده و هر رقت را در آزمایش ELISA قرار دهید.

پس از انجام آزمایش، مقادیر غلطت‌های شناخته شده را در مقابل مقادیر جذب به‌دست‌آمده رسم کنید.

با استفاده از نرم‌افزارهای تحلیل داده و انطباق منحنی‌ها، بهترین منحنی‌ای که داده‌های شما را به‌دقت نمایش می‌دهد، پیدا خواهید کرد. این منحنی به شما معادله‌ای می‌دهد که می‌توانید از آن برای محاسبه غلظت‌های آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در نمونه‌های ناشناخته استفاده کنید.

مثال

اگر نمودار خطی بهترین تطابق را با داده‌ها داشته باشد، منحنی استاندارد به صورت زیر خواهد بود:

محور X: غلظت آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی.

محور Y: مقادیر جذب.

مقدار R²: نشان‌دهنده میزان تطابق داده‌ها با خط روند است. مقدار R² بالاتر از ۰.۹۹ به این معناست که داده‌ها به دقت تطابق دارند و نتایج شما دقیق خواهند بود.

استفاده از یک منحنی استاندارد معتبر و گنجاندن کنترل‌های مناسب در طراحی آزمایش، به شما کمک می‌کند که نتایج کمی با دقت بالا و تحلیل‌های دقیق از داده‌های ELISA به دست آورید. از آنجا که ELISA یکی از روش‌های حساس و خاص برای شناسایی و اندازه‌گیری آنتی‌ژن‌ها و آنتی‌بادی‌ها است، رعایت اصول تحلیل داده‌ها برای افزایش دقت و اطمینان از نتایج آزمایش بسیار ضروری است.

برای محاسبه غلظت آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در نمونه‌ها با استفاده از منحنی استاندارد، از معادله خط رگرسیون خطی زیر استفاده می‌شود:

در این معادله:

• y معادل مقدار جذب است.
• x معادل غلظت است.
• m  شیب منحنی استاندارد است.
•  b  عرض از مبدا (مقدار جذب در غلظت صفر) است.

معادله خط رگرسیون خطی

معادله خط رگرسیون به‌صورت زیر است:

برای محاسبه غلظت از این معادله، باید آن را نسبت به غلظت حل کنیم:

مثال:

فرض کنید معادله خط رگرسیون منحنی استاندارد شما به‌صورت زیر است:

حال اگر مقدار جذب نمونه شما برابر با ۲ باشد، برای محاسبه غلظت از معادله بالا استفاده می‌کنیم:

بنابراین، غلظت آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در این نمونه برابر با ۷٫۹۷۸۸ است.

این روش به شما این امکان را می‌دهد که با استفاده از منحنی استاندارد و مقدار جذب، غلظت دقیق آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در نمونه‌های ناشناخته را محاسبه کنید.

کنترل اسپایک در آزمایش الایزا کمی

هنگام انجام آزمایش الایزا کمی با نمونه‌های پیچیده، استفاده از کنترل اسپایک بسیار مهم است. کنترل اسپایک به شما کمک می‌کند تا از دقت و صحت نتایج خود اطمینان حاصل کنید.

کنترل اسپایک شامل رقیق‌سازی سریالی یک نمونه است که در آن مقدار مشخصی از آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی مورد نظر به سرم (به جای بافر رقیق‌کننده) اضافه می‌شود. این اقدام به شما این امکان را می‌دهد که به‌طور دقیق‌تر تعاملات و تغییرات در ارتباط با پروتئین‌های موجود در نمونه را بررسی کنید.

کنترل اسپایک به شما این امکان را می‌دهد که تداخلات ناشی از پروتئین‌های غیرهدف را شناسایی کنید. اگر در نمونه شما پروتئین‌هایی غیر از آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی هدف وجود داشته باشد، این پروتئین‌ها ممکن است در اتصال آنتی‌ژن-آنتی‌بادی دخالت کنند و باعث شوند که غلظت آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی هدف به‌طور نادرست تخمین زده شود.

چگونه باید کنترل اسپایک را تجزیه و تحلیل کرد؟

پس از انجام ELISA و اندازه‌گیری جذب در کنترل اسپایک، شما می‌توانید مقایسه‌ای بین مقادیر جذب کنترل اسپایک و منحنی استاندارد انجام دهید. اگر تفاوت‌های معنی‌داری مشاهده کنید، این ممکن است نشان‌دهنده تأثیر پروتئین‌های غیرهدف بر دقت اندازه‌گیری‌های شما باشد. در چنین شرایطی، نتایج باید با دقت بیشتری تفسیر شوند تا اثرات تداخل شناسایی و اصلاح شود.

در نتیجه، کنترل اسپایک به شما این امکان را می‌دهد که دقت آزمون خود را ارزیابی کرده و مطمئن شوید که نتایج به‌درستی نمایانگر غلظت واقعی آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی هدف هستند.

دقت و تکرار در آزمایش

در انجام آزمایش‌های ELISA، برای افزایش دقت و قابلیت اطمینان نتایج، باید کنترل‌های مختلف و نمونه‌ها به صورت تکراری (دوبل یا سه‌تایی) انجام شوند. این کار به کاهش خطاهای تصادفی و افزایش دقت آزمون کمک می‌کند.

کاهش اشتباهات ناشی از پیپت‌کردن: استفاده از نمونه‌های تکراری باعث کاهش احتمال بروز خطاهایی مانند اشتباه در پیپت‌کردن می‌شود. اگر فقط از یک چاهک برای هر نمونه استفاده کنید، اشتباهات احتمالی به راحتی نمی‌توانند شناسایی شوند. اما وقتی از دو یا سه چاهک برای هر نمونه استفاده می‌کنید، احتمال مشاهده انحرافات بزرگ از میانگین کاهش می‌یابد.

افزایش دقت نتایج: تکرار نتایج در چاهک‌های مختلف و استفاده از میانگین مقادیر جذب برای هر نمونه، باعث می‌شود که نتایج به طور دقیق‌تری منعکس‌کننده غلظت واقعی آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در نمونه‌ها باشند.

تشخیص انحرافات غیرمنتظره: هنگامی که از نمونه‌های تکراری استفاده می‌کنید، در صورت بروز هرگونه انحراف یا اشتباه در یکی از چاهک‌ها، این انحرافات به راحتی قابل شناسایی خواهند بود. برای مثال، اگر یکی از چاهک‌ها به دلیل اشتباه در پیپت‌کردن یا آلودگی تحت تأثیر قرار گیرد، این تأثیر به وضوح در مقایسه با میانگین سایر چاهک‌ها مشخص می‌شود.

افزایش قابلیت اطمینان آزمایش: تکرار نمونه‌ها باعث می‌شود که قابلیت اطمینان نتایج افزایش یابد. برای آزمایش‌هایی که نیاز به دقت بالایی دارند، همچون آزمایش‌های ELISA کمی، انجام تکرارها ضروری است تا از صحت و دقت محاسبات اطمینان حاصل شود.

برای نمونه‌های دوبل، انحراف قابل قبول از میانگین باید کمتر از ۲۰٪ باشد. اگر انحراف از میانگین بیشتر از این مقدار باشد، این به‌طور بالقوه نشان‌دهنده مشکل در انجام آزمایش (مثل اشتباهات در پیپت‌کردن یا آلودگی) است که باید اصلاح شود.

مواد شیمیایی مورد نیاز برای ELISAها

مواد شیمیایی مورد نیاز برای آزمایش الایزا بستگی به پروتکل استفاده شده دارد، اما به‌طور کلی شامل بافرهای پوشش‌دهی، انسداد و شستشو، آنتی‌بادی‌ها یا آنتی‌ژن‌های برچسب‌دار با آنزیم، سوبسترا و محلول توقف است. برای شناسایی آنتی‌ژن‌ها و آنتی‌بادی‌های رایج، معمولاً می‌توانید کیت‌های ELISA آماده استفاده خریداری کنید که شامل تمام مواد مورد نیاز هستند.

مواد شیمیایی رایج در این کیت‌ها عبارتند از:

• بافر پوشش‌دهی^[۵]: دو بافر پوشش‌دهی رایج‌تر PBS (فیزیولوژیک) و بی‌کربنات هستند. این بافرها آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی را که برای پوشش دادن صفحه استفاده می‌شود، در طول انکوباسیون تثبیت می‌کنند.

• بافر انسداد^[۶]: برای جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی آنتی‌بادی‌های شناسایی به سطح پلیت، سایت‌های باقی‌مانده برای اتصال پروتئین باید مسدود شوند. این کار با استفاده از پروتئین‌های مسدودکننده‌ای مانند آلبومین سرم گاوی (BSA)، شیر خشک بدون چربی (NFDM)، کازئین یا کازئینات، سرم معمولی یا ژلاتین ماهی انجام می‌شود.

• بافر شستشو^[۷]: مراحل شستشو برای حذف مواد غیرمتصل معمولاً با استفاده از PBS انجام می‌شود که حاوی مقدار کمی از یک شوینده غیر یونی مانند Tween® ۲۰ است.

• آنتی‌بادی‌ها یا آنتی‌ژن‌های برچسب‌دار با آنزیم^[۸]: آنتی‌بادی‌ها یا آنتی‌ژن‌های مورد نیاز به نوع آنالایت بستگی دارند. برای برچسب‌دار کردن آنتی‌بادی‌ها یا آنتی‌ژن‌ها با آنزیم، معمولاً از پل استرپتاویدین-بیوتین برای اتصال آنتی‌بادی‌ها یا آنتی‌ژن‌ها به آنزیم شناسایی استفاده می‌شود. دو آنزیم رایج که برای این کار استفاده می‌شوند عبارتند از: پراکسیداز تربز (HRP) و فسفاتاز قلیایی (ALP).

• سوبسترای آنزیم و محلول توقف: سوبسترای آنزیم‌ها و محلول‌های توقف به‌طور خاص برای هر آنزیم طراحی شده‌اند.

• سوبسترای HRP : سوبسترای HRP شامل TMB (3,3′,۵,۵′-تترامتیل بنزیدین)، بافر سوبسترای مخصوص و هیدروژن پراکسید است. واکنش می‌تواند با استفاده از اسید سولفوریک متوقف شود.

• سوبسترای ALP فسفاتاز قلیایی: سوبسترای ALP شامل محلول p-Nitrophenyl Phosphate (pNPP) است، و واکنش می‌تواند با استفاده از NaOH (هیدروکسید سدیم) متوقف شود.

تجهیزات مورد نیاز برای ELISA

برای انجام آزمایش ELISA، شما به تجهیزات زیر نیاز دارید:

• پیپت‌ها برای افزودن مواد شیمیایی و نمونه‌ها به میکروچاهک
• انکوباتور برای نگه‌داشتن صفحه در دمای ثابت
• دستگاه شستشوی پلیت برای حذف مولکول‌های غیر متصل
• دستگاه خواننده پلیت (Plate reader) برای تحلیل نتایج آزمایش
• سانتریفیوژها برای جداسازی ذرات

اگر در آزمایشگاهی با بودجه محدود یا ظرفیت پایین کار می‌کنید، ممکن است دستگاه شستشو در دسترس نباشد. در این صورت، می‌توانید از پیپت‌ها به همراه سیستم مکش برای انجام مراحل شستشو استفاده کنید.

از سوی دیگر، آزمایشگاه‌های با ظرفیت بالا ممکن است به دنبال راه‌حل‌هایی برای افزایش بهره‌وری خود باشند. در این صورت، استفاده از انواع مختلف پیپت‌ها می‌تواند مفید باشد، از جمله:

• پیپت‌هایی با فاصله نوک قابل تنظیم برای انتقال نمونه‌ها بین فرمت‌های مختلف ظروف آزمایشگاهی
• پیپت‌های ۹۶ کاناله برای افزودن همزمان مواد شیمیایی به هر چاهک
• ربات‌های پیپت‌کاری کوچک رومیزی برای اتوماسیون جریان کار

سخن پایانی

آزمایش الایزا از دهه ۱۹۷۰ به‌طور گسترده‌ای در حوزه‌های مختلف علمی و پزشکی مورد استفاده قرار گرفته و به‌عنوان “استاندارد طلایی” در میان آزمایش‌های ایمنی‌شناسی شناخته می‌شود. این روش با دقت و حساسیت بالا توانسته است به ابزاری اساسی برای شناسایی و اندازه‌گیری مولکول‌های بیولوژیکی مانند آنتی‌ژن‌ها، آنتی‌بادی‌ها و پروتئین‌ها تبدیل شود.

در این مقاله، سعی کردیم تا با بررسی انواع مختلف ELISA، اصول عملکرد، مزایا و معایب هر یک از این روش‌ها، نحوه تجزیه و تحلیل داده‌ها و همچنین معرفی مواد شیمیایی و تجهیزات مورد نیاز، تصویری جامع از این تکنیک پیشرفته به شما ارائه دهیم. انتخاب نوع مناسب ELISA برای تحقیق یا کاربرد خاص شما، به عواملی مانند دقت مورد نیاز، نوع نمونه‌ها، و اهداف آزمایش بستگی دارد.

امیدواریم که این مقاله توانسته باشد به شما در درک بهتر و کاربرد مؤثرتر آزمایش‌های ELISA کمک کند و شما را در انتخاب روش مناسب برای پروژه‌های علمی و تحقیقاتی‌تان راهنمایی نماید. با درک اصول ELISA و تحلیل دقیق داده‌های آن، می‌توانید به نتایج قابل اعتماد و دقیقی در تشخیص و شناسایی انواع مولکول‌های بیولوژیکی دست یابید.

واژه نامه: