رنگ‌آمیزی قارچ ها: با انواع تکنیک‌های رنگ آمیزی قارچ آشنا شویم

تکنیک رنگ‌آمیزی قارچ یکی از بخش‌های مهم در تشخیص قارچ‌ها در آزمایشگاه است. این کار به تجسم واضح قارچ‌ها کمک می‌کند. به این ترتیب مطالعه ویژگی‌های مورفولوژیکی قارچ‌ها میسر خواهد شد.

اگر در آزمایشگاه کار می‌کنید، قطعا می‌دانید که روش‌های مختلفی برای رنگ‌آمیزی نمونه های مشکوک به عفونت قارچی وجود دارد.

اما شاید ندانید که هرکدام به چه دلیل و چگونه انجام می‌شود؟

با توجه به اهمیت تشخیص عفونت‌های قارچی، در این مقاله قصد داریم به بررسی انواع تکنیک‌های رنگ‌آمیزی قارچ ها در آزمایشگاه بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

انواع تکنیک‌های رنگ‌آمیزی قارچ‌ ها

تکنیک‌های رنگ‌آمیزی قارچی را می‌توان به‌طور کلی در دو دسته‌ی  زیر جای داد:

• Wet mount
• رنگ‌آمیزی افتراقی

الف/ تکنیک Wet mount برای آماده سازی و رنگ‌آمیزی قارچ ‌ها

روش Wet mount یک تکنیک رنگ آمیزی قارچی است. در این روش ابتدا نمونه در یک معرف حل می‌شود. سپس زیر میکروسکوپ بررسی می‌گردد.  استفاده از مواد و رنگ‌های زیر در روش Wet mount بسیار رایج است.

• پتاسیم هیدروکسید (KOH)
• لاکتوفنل کاتن بلو (LPCB)
• جوهر هندی (india ink)
• رنگ نیگروزین (Nigrosin)
• کالکوفلور سفید (calcofluor white)
• رنگ قرمز خنثی (neutral red stain)
• رنگ دیازونیوم بلو بی (DBB)
• رنگ PHOL

ب/ روش افتراقی برای رنگ‌آمیزی قارچ‌ ها

رنگ آمیزی افتراقی (Differential staining) یک تکنیک رنگ آمیزی قارچی است که در آن از بیش از یک رنگ استفاده می‌شود. در واقع، تضاد رنگی به شناسایی قارچ‌ها کمک می‌کند.

تکنیک‌های افتراقی رایج  برای شناسایی قارچ‌ها عبارتند از:

• رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (HE)
• رنگ آمیزی می گرونوالد گیمسا ^[1] (MGG)
• رنگ آمیزی diff quick
• رنگ آمیزی اسید پریودیک شیف (PAS)
• رنگ آمیزی قارچی گریدلی (Gridley’s fungal stain)
• رنگ آمیزی متنامین گوموری سیلور (Gömöri methenamine silver)
• رنگ موسیکارمین مایر (Mayer’s mucicarmine)
• رنگ فونتانا- ماسون (Masson-Fontana)
• رنگ ملانین اشمورل (Schmorl’s melanin)
• رنگ آمیزی تولویدین بلو او (Toluidine blue O)
• رنگ آکریدین نارنجی (acridine orange)
• رنگ آنتی بادی فلورسنت (fluorescent-antibody)

رنگ‌آمیزی گرم و رنگ‌آمیزی اسید فست اصلاح شده نیز برای تشخیص قارچ‌ها در آزمایشگاه مفید هستند.

در ادامه قصد داریم به بررسی هریک از این تکنیک‌های رنگ‌آمیزی قارچ‌ها در آزمایشگاه بپردازیم.

رنگ‌آمیزی قارچ با پتاسیم هیدروکسید

پتاسیم هیدروکسید (KOH) یک باز قوی است. این ماده، مواد بافتی موجود در پوست، مو، ناخن یا نمونه خلط را هضم و حل می‌کند. به این ترتیب مشاهده قارچ‌ها زیر میکروسکوپ راحت ‌خواهد شد. استفاده از پتاسیم هیدروکسید معمولا به روش wet    mount  انجام می‌شود. به این صورت که مقداری از KOH روی لام ریخته شده و سپس یک قطره از نمونه در آن حل می‌شود.

رنگ آمیزی قارچ با پتاسیم هیدروکسید یک غربالگری اولیه برای شناسایی عناصر قارچی در نمونه‌های بالینی است. این روش در تشخیص عفونت‌های زیر مفید است:

۱. درماتوفیتوز (dermatophytosis): درماتوفیتوز یک عفونت مو، پوست یا ناخن است که اغلب توسط Trichophyton ایجاد می‌شود.

۲. موکورمایکوز (mucormycosis): موکورمایکوزیس، که به عنوان قارچ سیاه نیز شناخته می شود، یک عفونت قارچی جدی است. این عفونت معمولاً در افرادی که دارای نقص ایمنی هستند، ایجاد می‌شود.

۴. عفونت بلاستومایسس درماتیتیدیس (Blastomyces dermatitidis infection): علائم بلاستومیکوز شبیه علائم عفونت‌های ریوی است. مانند تب، سرفه، عرق شبانه، درد عضلانی یا مفاصل، درد قفسه سینه و… .

رنگ‌آمیزی قارچ با لاکتوفنل کاتن بلو

لاکتوفنل کاتن بلو یک روش آزمایشگاهی رایج برای تشخیص قارچ‌ها است.

 این ماده دارای چند جزء اصلی است:

• فنل به عنوان ضدعفونی کننده عمل می‌کند و قارچ زنده را از بین می‌برد.
• اسید لاکتیک مورفولوژی قارچ را حفظ می‌کند.
• گلیسرول از خشک شدن جلوگیری می‌کند.
• کاتن بلو نیز دیواره خارجی قارچ را رنگ می‌کند.

در این روش، عناصر قارچی به رنگ آبی مشاهده خواهند شد.

رنگ‌آمیزی قارچ با PHOL

نام رنگ PHOL مخفف چهار نام Pal, Hasegawa, ono, and Lee است. این اسامی نام ابداع‌کنندگان این روش رنگ‌آمیزی هستند.

اصول رنگ‌آمیزی قارچ ها باPHOL مشابه لاکتوفنل کاتن بلو است. اما این دو ترکیبات متفاوتی دارند. در رنگ آمیزی PHOL، فرمالین جایگزین فنل و متیلن بلو جایگزین لاکتوفنل بلو می‌شود.

رنگ‌آمیزی PHOL در بررسی گونه‌های پروتوتکا مفید است.

رنگ‌آمیزی گرم برای قارچ‌ها

رنگ‌آمیزی گرم یک روش متداول برای شناسایی باکتری‌ها است. اما گاهی برای رنگ‌آمیزی قارچ‌ها نیز استفاده می‌شود. رنگ‌آمیزی گرم حین بررسی نمونه‌های بالینی، به شناسایی عناصر قارچی (هیف، مخمر یا میسلیوم) و تشخیص عفونت قارچی کمک می‌کند. قارچ‌ها معمولا به صورت گرم مثبت (رنگ بنفش) ظاهر می‌شوند.

رنگ‌آمیزی قارچ‌ها به روش گرم، دو نوع است:

• رنگ آمیزی گرم اصلاح شده توسط Weigert : به شناسایی کیست‌های پنوموسیستیس کمک می‌کند.
• رنگ آمیزی گرم اصلاح شده توسط براون و برن: برای شناسایی گونه‌های نوکاردیا، اکتینومایسس و میکروسپوریدیوم استفاده می‌شود.

رنگ‌آمیزی جوهر هندی و نیگروزین

ایندیا اینک یا جوهر هندی و نیگروزین رنگ‌های اسیدی هستند. این رنگ‌ها سبب رنگ‌آمیزی کپسول می‌شوند. هر دو تقریبا کاربرد یکسانی دارند. اما رنگ نیگروزین بر ایندیا اینک ارجحیت دارد. زیرا طول عمر بیشتری دارد.

ایندیا اینک و نیگروزین قارچ‌های کپسول‌ساز مانند Cryptococcus neoformans را که باعث مننژیت کریپتوکوکی می‌شود، شناسایی می‌کنند. کپسول به صورت هاله‌ای شفاف در یک پس زمینه تاریک ظاهر می‌شود.

رنگ‌آمیزی قارچ با کالکوفلور سفید

رنگ‌آمیزی کالکوفلور سفید برای تشخیص هیف، شبه هیف و مخمر استفاده می‌شود. این روش نوعی رنگ فلورسنتی است که کیتین موجود در دیواره سلولی قارچ‌ها را رنگ می‌کند.. هنگامی که کالکوفلور سفید در میکروسکوپ فلورسنت در معرض نور ماوراء بنفش قرار می‌گیرد به رنگ آبی روشن فلورسانس می‌شود.

رنگ‌آمیزی قارچ با کالکوفلور سفید به شناسایی قارچ‌های غیرقابل کشت مانند Pneumocystis jirovecii نیز کمک می‌کند.

رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین

رنگ‌آمیزی قارچ‌ها به روش  H&E به تمایز بخش‌های هسته‌ای و سیتوپلاسمی کمک می‌کند. هماتوکسیلین اجزای هسته‌ای مانند هتروکروماتین و هسته را به رنگ آبی در می‌آورد. ائوزین اجزای سیتوپلاسمی مانند کلاژن و فیبر الاستیک، فیبرهای عضلانی و گلبول‌های قرمز را به رنگ صورتی در می‌آورد.

از رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین برای بررسی مقاطع یخ زده بافت‌ها، آسپیراسیون‌های سوزنی ظریف و بافت پارافین‌گیری شده استفاده می‌شود.

رنگ‌آمیزی قارچ‌ها به روش  H&E به تجسم هیف‌ها، سلول‌های مخمر (هسته)، دیواره سلولی انکساری مضاعف بلاستومایسس و کوکسیدیوئیدس کمک می‌کند.

رنگ‌آمیزی قارچ با می گرونوالد گیمسا

می گرونوالد-گیمسا از دو رنگ می گرونوالد و گیمسا ساخته می‌شود.

• رنگ می گرونوالد از متیلن بلو و ائوزین تشکیل شده است.
• رنگ گیمسا از متیلن بلو، ائوزین و لاجورد B تشکیل شده است.

رنگ‌آمیزی قارچ‌ها به روش می گرونوالد-گیمسا، بیشتر برای خون و اسمیر مغز استخوان کاربرد دارد. این روش به تشخیص هیستوپلاسما کپسولاتوم (Histoplasma capsulatum) در اسمیر خون محیطی کمک می‌کند.

رنگ‌آمیزی قارچ‌ها به روش Diff-Quik

رنگ Diff-Quick برای رنگ آمیزی سریع اسمیرها مانند لام خون و واژینال مفید است. در این روش، قارچ‌ها به رنگ آبی تیره ظاهر می‌شوند.

این تکنیک بر اساس اصلاح رنگ رایت گیمسا به وجود آمده است. اما سریع‌تر از آن عمل می‌کند.

رنگ‌آمیزی پریودیک اسید شیف

پریودیک اسید شیف (PAS) یک تکنیک رنگ آمیزی است که حضور گلیکوژن، پلی‌ساکاریدها و موسین را در بافت شناسایی می‌کند. در رنگ‌آمیزی قارچ‌ها به روش PAS هسته و قارچ به رنگ صورتی تیره یا سرخابی مشاهده می‌شوند.

رنگ آمیزی PAS برای شناسایی کریپتوکوکوس نئوفرمانس، هیستوپلاسما کپسولاتوم، آسپرژیلوس فومیگاتوس و بلاستومایسس در نمونه‌های بافتی مفید است.

رنگ‌آمیزی قارچی گریدلی

رنگ آمیزی قارچ‌ها به روش گریدلی مانند رنگ PAS است. اما در این روش از اسید کرومیک به عنوان عامل اکسید کننده استفاده می‌شود. این تکنیک ترکیبی از تکنیک‌های بائر، شیف و آلدهید فوشین است.

رنگ‌آمیزی گریدلی میسلیوم‌ها و کنیدی‌ها را به رنگ ارغوانی تیره و بافت کشسان و زمینه موسین را به رنگ زرد رنگ می‌کند. این روش برای اکتینومیست‌ها مفید نیست.

رنگ‌آمیزی گوموری متنامین سیلور برای قارچ

تکنیک رنگ‌آمیزی گوموری متنامین سیلور به‌طور گسترده‌ای برای نمایش قارچ‌ها کاربرد دارد. برای نشان دادن محتوای پلی ساکارید قارچ در بخش های بافتی مفید است. این روش برای رنگ‌آمیزی کربوهیدرات‌ها نیز مفید است. به‌طور مثال از این تکنیک می‌توان برای شناسایی قارچ پنوموسیستیس جیرووسی^[2] استفاده کرد. که باعث بروز نوعی پنومونی به نام پنوموسیستیس پنومونی  می‌شود. با استفاده از تکنیک رنگ‌آمیزی گوموری متنامین سیلور دیواره‌های سلولی این موجودات به رنگ قهوه‌ای مایل به سیاه مشخص می‌شود. قارچ ها و باکتری ها را به رنگ سیاه، موکوپلی ساکارید خاکستری تیره و بافت سبز کم رنگ می کند.

رنگ‌آمیزی قارچ با موسیکارمین مایر

رنگ آمیزی قارچ با موسیکارمین مایر برای بررسی موسین کاربرد دارد. موسین، مایعی است که توسط سلول‌های اپیتلیال مختلف ترشح می‌شود.  سلول‌های اپیتلیال در حین کارسینوم یا در برخی التهابات به مقدار زیاد موسین تولید می‌کنند.

رنگ موسیکارمین مایر گونه‌های کریپتوکوک و رینوسپوریدیوم را شناسایی می ‌کند. در این تکنیک، قارچ به رنگ قرمز ، هسته‌ها سیاه و بافت به رنگ زرد دیده می‌شود.

استفاده از فونتانا-ماسون برای قارچ‌ها

با استفاده از رنگ فونتانا-ماسون می‌توان گرانول‌های آرژانتافین و ملانین سلول را تشخیص داد. ملانین رنگدانه قهوه‌ای و سیاه رنگی است که در مو، پوست، شبکیه چشم و عنبیه بدن انسان نیز وجود دارد. گرانول‌های آرژانتافین در تومورهای کارسینوئیدی وجود دارند. در رنگ آمیزی قارچ با فونتانا-ماسون، گرانول‌های ملانین و آرژانتافین به رنگ سیاه و هسته به رنگ قرمز مشاهده می‌شوند.

رنگ آمیزی فونتانا-ماسون (MF) قارچ‌های پوستی (فائوئید) حاوی ملانین مانند Curvularia lunata و Bipolaris hawaiiensis را در بافت تشخیص می‌دهد.

رنگ‌آمیزی قارچ با ملانین اشمورل

Schmorl’s Melanin روش رنگ‌آمیزی مبتنی بر ملانین است. با استفاده از این روش می‌توان وجود مواد کاهنده در بافت‌ها مانند ملانین، کراتین، کراتوهیالین و غیره را تشخیص داد. ملانین در دیواره سلولی قارچ‌های پیگمانته (فائوئید) وجود دارد. در این روش گرانول‌ها به رنگ سبز آبی دیده می‌شوند. هسته‌ها صورتی مایل به قرمز و سیتوپلاسم را به رنگ صورتی کم رنگ است.

رنگ آمیزی ملانین Schmorl برای تشخیص فئوهیفومیکوز در بیوپسی بافت مفید است.

رنگ‌آمیزی قارچ با تولوئیدین بلو

تولوئیدین بلو یک رنگ متاکروماتیک است. گرانول‌های متاکروماتیک حاوی فسفات پلیمریزه شده است و ذخیره سازی فسفات معدنی را بر عهده دارند.

رنگ آمیزی قارچ با تولویدین بلو O ، برای کیست مناسب است و برای تروفوزوئیت‌ها کاربرد ندارد. در این روش، کیست‌های قارچی به رنگ آبی مایل به قرمز یا بنفش تیره در پس زمینه آبی روشن مشاهده می‌شوند.

رنگ آمیزی تولویدین بلو O برای تشخیص پنوموسیستیس جیرووسی در بیوپسی ریه و مایع برونکوآلوئولار لاواژ (BAL) مفید است.

رنگ آمیزی قارچ با آکریدین نارنجی

رنگ آکریدین نارنجی یک رنگ فلوروکرومی است. یعنی به اسیدهای نوکلئیک سلول‌ها متصل می‌شود. هنگامی که قارچ‌ها با رنگ آکریدین رنگ آمیزی می‌شوند و تحت نور ماوراء بنفش قرار می‌گیرند، RNA به رنگ قرمز نارنجی و DNA به رنگ سبز فلورسانس دیده می شود. در مقابل سلول‌های اپیتلیال ، سلول‌های التهابی و بقایای پس زمینه به رنگ سبز کم رنگ تا زرد به نظر می‌رسند.

رنگ آکریدین نارنجی برای نشان دادن قارچ‌ها در مقاطع بافتی و اسمیر مفید است. همچنین برای شناسایی قارچ‌های زیر در مقاطع بافتی کاربرد دارد.

• Aspergillus spp.
• Blastomyces dermatitidis
• Candida albicans
• Coccidioides immitis
• Cryptococcus neoformans
• Histoplasma capsulatum
• Rhinosporidium seeberi

رنگ قرمز خنثی

رنگ قرمز خنثی یک رنگ محلول در آب است. این رنگ می‌تواند از غشای پلاسمایی سالم عبور کند. لیزوزوم سلول‌های زنده این رنگ را به خود می‌گیرند. هنگامی که غشای سلولی و لیزوزوم‌ها آسیب می بینند، جذب رنگ کاهش می‌یابد.

رنگ قرمز خنثی برای افتراق قارچ زنده از غیر زنده استفاده می‌شود. این رنگ، سلول زنده را قرمز رنگ کرده و سلول غیرزنده را رنگ نمی‌کند.

لکه دیازونیوم آبی B

رنگ آمیزی دیازونیوم آبی B در تمایز گونه‌های دو جنس قارچ، بازیدیومیست‌ها و آسکومیست‌ها مفید است.

زیگومیست‌ها، بازیدیومیست‌ها و برخی از آسکومیست‌ها واکنش مثبت نشان می‌دهند. اما سویه‌های آسکومیست‌ها اغلب واکنش منفی نشان می‌دهند.

واکنش مثبت به صورت قرمز تیره یا بنفش و واکنش منفی بی‌رنگ است.

جمع‌بندی

رنگ ‌آمیزی قارچ یک ابزار مهم تشخیصی در آزمایشگاه‌های بافت شناسی است. این روش‌ها بسته به نوع نمونه و عفونت احتمالی متفاوت هستند.

تشخیص سریع و به موقع عفونت‌های قارچی از اهمیت زیادی برخوردار است.

درماتومیکوزها یا عفونت‌های قارچی سطحی که پوست را درگیر می‌کنند، به ندرت یک مشکل سلامتی جدی در انسان هستند. اما ارگانیسم‌هایی مانند کریپتوکوکوس نئوفورمانس و کاندیدا آلبیکنس می‌توانند باعث عفونت‌های تهدیدکننده زندگی شوند. استفاده از تکنیک‌های رنگ‌آمیزی قارچ به تشخیص نوع و گونه‌ی عفونی کمک زیادی خواهد کرد.

شما از کدام روش بیشتر استفاده می‌کنید؟

واژه نامه