آزمایش هیدرولیز ژلاتین : اصول، روش و نتایج مورد نظر
آزمایش هیدرولیز ژلاتین (Gelatin Hydrolysis Test) یک آزمایش بیوشیمیایی است که برای شناسایی استافیلوکوک، انتروکوک و سایر باسیل‌های گرم مثبت انجام می‌شود. ژلاتیناز یک آنزیم مهم در ارگانیسم‌های بیماریزا مختلف است زیرا به صورت خارج سلولی تولید می‌شود. این آنزیم ژلاتینی را هیدرولیز می‌کند که از کلاژن موجود در بافت‌های همبند مهره‌داران به دست می‌آید.
این آنزیم‌ها ممکن است به‌عنوان یک عامل حدت عمل کنند که بافت‌های همبند سلول‌های میزبان را حل می‌کند و به عفونت‌های مهاجم کمک می‌کند.
در ادامه قصد داریم به بررسی این تست و نحوه انجام آن بپردازیم.
آزمایش هیدرولیز ژلاتین چیست و چه زمانی مورد استفاده قرار می‌گیرد؟
این آزمایش با نام مایع ژلاتین نیز شناخته می‌شود. زیرا شامل مایع‌سازی ژلاتین در حضور آنزیم ژلاتیناز می‌گردد. هدف اصلی این تست، بررسی توانایی ارگانیسم در مایع‌سازی ژلاتین با تولید آنزیم ژلاتیناز است. این آزمایش برای سال‌ها به عنوان یک آزمایش احتمالی برای شناسایی طیف گسترده‌ای از ارگانیسم‌ها مانند سراشیا، سودوموناس، فلاووباکتریوم و کلستریدیوم مورد استفاده قرار گرفته است.
ژلاتین پروتئینی است که در حضور آنزیم ژلاتیناز به مایع تبدیل می‌شود. این آنزیم ساختار پیچیده ژلاتین را به اسیدهای آمینه مونومر تجزیه می‌کند.
این آزمایش استافیلوکوکوس اورئوس (ژلاتیناز مثبت) و بیماریزا را از استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (ژلاتیناز منفی) و غیر بیماریزا متمایز می‌کند.
همچنین می‌توان از آن برای افتراق جنس های باکتری های مولد ژلاتیناز مانند Serratia و Proteus از سایر اعضای خانواده Enterobacteriaceae استفاده کرد.
اصول آزمایش هیدرولیز ژلاتین
ژلاتین پروتئینی است که از بافت همبند حیوانی به دست می‌آید. در دماهای پایین‌تر ساختار جامدی را تشکیل می‌دهد. این پروتئین توسط گروهی از آنزیم‌ها به نام ژلاتیناز، متابولیزه یا تجزیه می‌شود. ژلاتینازها آنزیم‌های پروتئولیتیک هستند که ژلاتین را به پلی پپتیدها و اسیدهای آمینه منفرد هیدرولیز می‌کنند.
تجزیه ژلاتین، مانند بسیاری از پروتئین‌ها، در دو مرحله رخ می‌دهد. مرحله اول شامل تجزیه ژلاتین به پلی پپتید است. مرحله دوم نیز تبدیل پلی پپتیدها به اسیدهای آمینه است.
حضور ژلاتیناز در اکثر باکتری‌ها مهم است. زیرا ژلاتین یک پلیمر بزرگ است و نمی‌تواند به داخل سلول منتقل شود. بنابراین، ژلاتیناز ، ژلاتین را به واحدهای کوچک‌تری تجزیه می‌کند تا به داخل سلول منتقل شده و توسط باکتری‌ها استفاده شود.
در آزمایش هیدرولیز از محیط کشت حاوی ژلاتین استفاده می‌شود و هیدرولیز آن یا با مایع شدن محیط مشاهده می‌شود. ممکن است در محیط کشت از کلرید جیوه هم استفاده شود. کلرید جیوه سبب رسوب ژلاتین می‌شود.
محیط کشت، معرف و لوازم مورد استفاده
محیط کشت مغذی ژلاتین برای نشان دادن هیدرولیز استفاده می‌شود. ترکیب مواد مغذی ژلاتین در زیر آورده شده است:
| S.N | Ingredients | Gram/liter |
| ۱٫ | Tryptose | ۲۰٫۰ |
| ۲٫ | Beef extract | ۳٫۰ |
| ۳٫ | Gelatin | ۱۰٫۰ |
| ۴٫ | Manganese sulfate | ۰٫۰۱ |
| ۵٫ | Agar | ۱۵٫۰ |
| Final pH at 25°C: 6.8 ±۰٫۲ | ||
مراحل آزمایش هیدرولیز ژلاتین
الف. آماده سازی محیط کشت
حدود ۱۲۸ گرم از پودر محیط کشت را با ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر گرم (۵۰ درجه سانتیگراد) در یک بشر بریزید.
سپس آن را روی هات پلیت قرار دهید تا به جوش آید و محیط کشت کاملاً حل شود.
محیط کشت را در چندین لوله آزمایش بریزید و در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو کنید. می‌تواند محیط کشت را درون پتری دیش هم بریزید و اتوکلاو نمایید.
اجازه دهید محیط کشت تا دمای ۴۵ الی ۵۰ درجه سانتیگراد در حالت عمودی خنک شود.
ب- هیدرولیز ژلاتین
هیدرولیز ژلاتین را می‌توان به دو روش انجام داد.
۱- روش ضربه‌ای (Stab method)
محیط ژلاتینی داخل لوله را با ۴ الی ۵ قطره از براث ۲۴ ساعته تلقیح کنید.
لوله‌های تلقیح شده را در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ الی۴۸ ساعت انکوبه نمایید. اگر موجودات زنده در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد به خوبی رشد کنند، انکوباسیون باید در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد انجام شود.
پس از اولین انکوباسیون، لوله‌ها باید به مدت ۲۴ ساعت دیگر در دمای ۴ درجه سانتیگراد قرار گیرند.
۲- روش پلیت (Plate method)
یک تلقیح از یک کشت ۱۲ الی ۲۴ ساعته برداشته و روی محیط ژلاتین مغذی تلقیح نمایید.
سپس پلیت‌ها در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ الی۴۸ ساعت انکوبه کنید.
تفسیر نتایج آزمایش هیدرولیز ژلاتین
تست لوله
- مایع سازی جزئی یا کلی ژلاتین در لوله‌های آزمایش نشان دهنده نتیجه مثبت است.
- انجماد کامل ژلاتین در دمای ۴ درجه سانتیگراد نشان دهنده یک نتیجه منفی است.
تست پلیت
- یک منطقه شفاف در اطراف کلنی‌ها پس از افزودن کلرید جیوه (HgCl2) در آگار، نشان دهنده نتیجه مثبت است.
- اگر پس از افزودن کلرید جیوه، هیچ ناحیه شفافی در اطراف کلنی‌ها دیده نشد، نشان دهنده یک نتیجه منفی است.
محدودیت های آزمایش هیدرولیز ژلاتین
آزمایش هیدرولیز ژلاتین محدودیت‌هایی نیز دارد.
ژلاتیناز بیشتر در سطح محیط لوله عمل می‌کند. تکان دادن لوله در حالی که گرم است ممکن است منجر به یک نتیجه منفی کاذب شود.
نتایج مثبت کاذب ممکن است با روش لوله‌ای در برخی محیط‌ها یا طی انکوباسیون طولانی مدت، یعنی بیش از ۴ ساعت رخ دهد. این را می توان به کمک لوله کنترل تلقیح نشده تشخیص داد.
روش پلیت برای تعیین مایع ژلاتین توسط گونه های سختگیر و بی هوازی های اجباری توصیه نمی‌شود.
اگر لوله ها در دماهای بالاتر از ۲۰ درجه سانتیگراد انکوبه شوند، قبل از انجام واکنش، لوله‌ها باید تا دمای کمتر از ۲۰ درجه سانتیگراد سرد شوند.
سخن پایانی
ژلاتین پروتئینی است که از بافت همبند مهره داران یعنی کلاژن به دست می آید. زمانی که کلاژن در آب جوشانده می شود تولید می شود. هیدرولیز ژلاتین وجود ژلاتینازها را تشخیص می دهد. ژلاتینازها پروتئازهایی هستند که به صورت خارج سلولی توسط برخی باکتری ها ترشح می شوند
که ژلاتین را هیدرولیز یا هضم می کنند. تولید ژلاتینازها به عنوان یک آزمایش احتمالی برای شناسایی ارگانیسم‌های مختلف از جمله Staphylococcus sp.، Enterobacteriaceae و برخی باسیل‌های گرم مثبت استفاده می‌شود.
