روش‌های ایزوله سازی میکروارگانیسم ها در میکروبیولوژی
ایزوله سازی میکروارگانیسم ها یکی از اجزای حیاتی در علم میکروبیولوژی به‌شمار می‌رود و برای کشف پیچیدگی‌های دنیای عمدتاً ناشناخته‌ی میکروب‌ها، امری ضروری است. این فرایند که از نظر ماهیتی پایه‌ای است، شامل جداسازی یک نوع خاص از میکروارگانیسم از یک کشت ترکیبی (مختلط) می‌باشد.
این تفکیک از اهمیت بالایی برخوردار است، چرا که امکان بررسی دقیق ویژگی‌های منحصر به‌فرد آن میکروارگانیسم را فراهم می‌سازد. چنین تحلیل عمیقی نه تنها ویژگی‌های اختصاصی آن ارگانیسم را روشن می‌کند، بلکه موجب ارتقای قابل توجه درک علمی ما از دنیای میکروبی نیز می‌شود. توانایی ایزوله سازی و مطالعه دقیق میکروارگانیسم‌ها، برای پیشرفت دانش ما از نقش‌ها و تعاملات آن‌ها در محیط‌های مختلف، کاملاً ضروری است.
به همین دلیل قصد داریم در این مطلب به بررسی تکنیک‌های ایزوله سازی در میکروبیولوژی بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.
سیر تکاملی تکنیک‌های ایزوله سازی میکروارگانیسم ها
پیشرفت تکنیک‌های ایزوله سازی میکروارگانیسم ها ، بازتابی از تحول گسترده‌تر علم میکروبیولوژی است. در ابتدا، این حوزه عمدتاً متکی بر روش‌های ساده و دستی برای جداسازی میکروارگانیسم‌ها بود. این تکنیک‌های پایه‌ای، هرچند ابتدایی، نقش کلیدی در آغاز مسیر شناخت و بررسی حیات میکروبی ایفا کردند. اما با رشد و توسعه علم میکروبیولوژی، روش‌های ایزوله سازی نیز دچار تحول شدند.
این رشته از آن آغاز ساده، به دوره‌ای گام نهاد که در آن روش‌های پیشرفته و مبتنی بر فناوری جایگزین روش‌های ابتدایی شده‌اند. امروزه میکروبیولوژی در فرآیندهای ایزوله سازی، از فناوری‌های نوین بسیاری بهره می‌گیرد که این خود، پیشرفتی چشمگیر در این حوزه به‌شمار می‌آید. ادغام فناوری با روش‌های جداسازی، نه تنها فرآیند ایزوله سازی را بهبود بخشیده، بلکه دامنه‌ی تحقیقات در میکروبیولوژی را نیز به طرز قابل توجهی گسترش داده است.
تکنیک‌های رایج ایزوله سازی میکروبی
در ادامه قصد داریم به بررسی روش‌های ایزوله سازی میکروارگانیسم ها بپردازیم.
کشت خطی (Streak Plating)
کشت خطی یکی از تکنیک‌های پایه در میکروبیولوژی است که به دلیل سادگی اجرا و کارایی بالا در جداسازی کلونی‌های میکروبی نقش به سزایی دارد. در این روش، نمونه‌ی میکروبی به‌وسیله‌ی ابزار استریل‌شده‌ای مانند لوپ تلقیح (Inoculation Loop) به‌صورت ملایم و کنترل‌شده روی سطح محیط آگار کشیده می‌شود. با هر مرحله‌ی کشیدن، تراکم میکروارگانیسم‌ها کاهش می‌یابد، به‌طوری‌که در نواحی انتهایی، سلول‌های منفرد قابل جداسازی هستند. این سلول‌های منفرد، کلونی‌های متمایزی را تشکیل می‌دهند که هرکدام از یک سلول منفرد یا گروهی همسان از میکروارگانیسم‌ها منشاء می‌گیرند.
ایزوله سازی میکروارگانیسم ها به روش کشت در پلیت (Pour Plating)
کشت در پلیت نیز از روش‌های مهم برای ایزوله سازی میکروارگانیسم ها در میکروبیولوژی به‌شمار می‌رود. به‌ویژه در مطالعات کمی (Quantitative) و بررسی گونه‌های متنوع باکتری‌ها.
در این روش، نمونه‌ی رقیق‌شده‌ی میکروبی با آگار مذاب مخلوط شده و سپس درون یک پلیت استریل ریخته می‌شود. پس از سرد شدن و جامد شدن محیط، باکتری‌ها در محیط محصور شده و رشد می‌کنند.
مزیت اصلی این روش در قابلیت شمارش کلونی‌ها است، چرا که امکان شمارش سلول‌های زنده‌ی موجود در نمونه را فراهم می‌سازد. همچنین این روش از رشد باکتری‌های هوازی و بی‌هوازی پشتیبانی می‌کند و به همین دلیل انتخابی چندمنظوره و انعطاف‌پذیر برای مطالعات میکروبی محسوب می‌شود. این ویژگی به‌ویژه در شرایطی که حساسیت میکروارگانیسم‌ها نسبت به اکسیژن اهمیت دارد، بسیار حائز اهمیت است، زیرا امکان رشد کلونی‌ها در هر دو ناحیه‌ی سطحی و زیرسطحی فراهم می‌شود.
استفاده از محیط کشت انتخابی (Selective Media)
محیط‌های کشت انتخابی، رویکردی هدفمند در ایزوله سازی میکروارگانیسم ها به‌شمار می‌روند. این محیط کشت‌ها به‌گونه‌ای طراحی شده‌اند تا رشد گروه خاصی از میکروارگانیسم‌ها را تقویت و هم‌زمان رشد سایرین را مهار کنند. این امر از طریق افزودن ترکیبات خاصی به محیط کشت حاصل می‌شود که از رشد ارگانیسم‌های ناخواسته جلوگیری می‌کند.
محیط‌های انتخابی برای جداسازی میکروارگانیسم‌های خاص از کشت‌های مختلط بسیار ضروری‌اند؛ مانند شناسایی پاتوژن‌ها در نمونه‌های بالینی یا جداسازی باکتری‌های خاص از نمونه‌های محیطی.
رایج‌ترین محیط‌های کشت برای ایزوله سازی میکروارگانیسم ها
محیط‌های کشت رایج برای ایزوله سازی میکروارگانیسم ها شامل آگار پلیت‌ها و محلول‌های مغذی هستند؛.برخی میکروارگانیسم‌ها به محیط‌های خاصی نیاز دارند. برخی از این میکروارگانیسم‌ها که به‌عنوان ارگانیسم‌های سخت‌گیر (Fastidious organisms) معروف هستند، به دلیل نیازهای پیچیده تغذیه‌ای به محیط‌های خاص نیاز دارند. به‌عنوان مثال، ویروس‌ها، که به‌عنوان انگل‌های داخل سلولی اجباری شناخته می‌شوند، به یک محیط کشت حاوی سلول‌های زنده نیاز دارند.
محیط‌های کشت: تعریف‌شده و غیرتعریف‌شده
در ایزوله سازی میکروارگانیسم ها تفاوت مهمی بین انواع محیط‌های کشت وجود دارد. یکی از این جنبه های مهم تفاوت بین محیط‌های کشت تعریف‌شده و غیرتعریف‌شده است.
یک محیط کشت تعریف‌شده دارای مقادیر مشخص از تمام ترکیبات است. برای میکروارگانیسم‌ها، این محیط‌ها شامل تأمین ریزمغذی‌ها و ویتامین‌هایی هستند که میکروب به آن‌ها نیاز دارد و به‌ویژه یک منبع تعریف‌شده از کربن و نیتروژن. گلوکز یا گلیسرول معمولاً به‌عنوان منابع کربنی استفاده می‌شوند و نمک‌های آمونیوم یا نیترات‌ها به‌عنوان منابع نیتروژن غیرآلی.
یک محیط کشت غیرتعریف‌شده حاوی برخی ترکیبات پیچیده مانند عصاره مخمر یا هیدرولیزات کازئین است که ترکیبی از بسیاری از گونه‌های شیمیایی در نسبت‌های ناشناخته است. محیط‌های غیرتعریف‌شده گاهی بر اساس قیمت یا گاهی به‌دلیل ضرورت انتخاب می‌شوند، زیرا برخی میکروارگانیسم‌ها هرگز در محیط‌های تعریف‌شده کشت داده نشده‌اند.
محیط‌های غنی‌شده (Enriched media)
محیط‌های غنی‌شده حاوی مواد مغذی مورد نیاز برای پشتیبانی از رشد انواع مختلف میکروارگانیسم‌ها هستند، از جمله برخی از ارگانیسم‌های سخت‌گیر. این محیط‌ها معمولاً برای ایزوله سازی بیشترین تعداد ممکن از میکروارگانیسم‌ها در نمونه‌ها استفاده می‌شوند.
آگار خون یک محیط غنی‌شده است که در آن خون کامل غنی از مواد مغذی، به محیط اصلی اضافه می‌شود. آگار شکلاتی نیز با خون حرارت‌دیده (در دمای ۴۰-۴۵ درجه سانتی‌گراد) غنی‌شده است که باعث تغییر رنگ قهوه‌ای و نامگذاری آن می‌شود.
محیط‌های انتخابی (Selective media) برای ایزوله سازی میکروارگانیسم ها
محیط‌های انتخابی فقط برای ایزوله سازی میکروارگانیسم های خاص استفاده می‌شوند. به‌عنوان مثال، اگر یک میکروارگانیسم نسبت به آنتی‌بیوتیک خاصی مقاوم باشد، مانند آمپی‌سیلین یا تتراسایکلین، می‌توان آن آنتی‌بیوتیک را به محیط کشت اضافه کرد تا از رشد دیگر سلول‌ها که مقاومتی به آن آنتی‌بیوتیک ندارند جلوگیری شود.
محیط‌های تفکیکی/شاخصی (Differential/indicator media)
این نوع محیط‌ها یکی از انواع میکروارگانیسم‌ها را از دیگری که در همان محیط رشد می‌کند، متمایز می‌کنند. این محیط‌ها از ویژگی‌های بیوشیمیایی یک میکروارگانیسم در حضور مواد مغذی یا نشانگرهای خاص (مانند قرمز خنثی، قرمز فنول، یوزین Y یا متیلن بلو) که به محیط اضافه شده‌اند، برای نشان دادن ویژگی‌های تعیین‌کننده یک میکروارگانیسم استفاده می‌کنند.
آگار TSI (Triple-Sugar Iron) یکی از محیط‌های کشت است که برای تمایز بیشتر انترواکتروباکتری‌ها استفاده می‌شود.
رشد در سیستم‌های کشت بسته
در سیستم‌های کشت بسته مانند کشت Batch در محلول LB که هیچ مواد مغذی جدیدی اضافه نمی‌شود و محصولات زائد از محیط حذف نمی‌شوند، رشد باکتری‌ها یک منحنی رشد پیش‌بینی‌شده را دنبال کرده و می‌تواند مدل‌سازی شود. ایزوله سازی میکروارگانیسم ها در این روش شامل موارد زیر است.
مراحل رشد
مرحله کمون (Lag phase)
در این مرحله، باکتری‌ها خود را با شرایط رشد تطبیق می‌دهند. این مرحله زمانی است که باکتری‌های فردی در حال بلوغ هستند و هنوز قادر به تقسیم نیستند. در این مرحله، سنتز RNA، آنزیم‌ها و سایر مولکول‌ها رخ می‌دهد.
مرحله نمایی (Exponential phase)
این مرحله که به‌طور گاهی به آن مرحله لاگ (Log phase) یا لوگاریتمی نیز گفته می‌شود، به دوره‌ای اطلاق می‌شود که با تقسیم سلولی همراه است. تعداد باکتری‌های جدید در هر واحد زمان به جمعیت موجود متناسب است.
مرحله ایستایی (Stationary phase)
مرحله ایستایی به دلیل یک عامل محدودکننده رشد به وجود می‌آید؛ این معمولاً ناشی از تخلیه یک ماده مغذی و یا تشکیل محصولات مهاری مانند اسیدهای آلی است.
مرحله مرگ (Death phase)
در این مرحله، باکتری‌ها از مواد مغذی تمام شده و می‌میرند.
کشت Batch برای ایزوله سازی میکروارگانیسم ها
کشت Batch رایج‌ترین روش کشت آزمایشگاهی است که در آن رشد باکتری‌ها مورد مطالعه قرار می‌گیرد، اما این تنها یکی از بسیاری از روش‌ها است. در این روش، کشت باکتری‌ها در یک ظرف بسته با یک دسته از محیط کشت انجام می‌شود.
در برخی رژیم‌های آزمایشی، بخشی از کشت باکتری به‌طور دوره‌ای حذف شده و به محیط استریل تازه افزوده می‌شود. در حالت افراطی، این کار منجر به تجدید مداوم مواد مغذی می‌شود. این حالت کشت شیمی‌استات (Chemostat) نامیده می‌شود که همچنین به‌عنوان کشت باز یا مداوم شناخته می‌شود.
دیدگاه تاریخی: از روش‌های سنتی تا روش‌های نوین ایزوله سازی میکروارگانیسم ها
برای ایزوله سازی میکروارگانیسم ها ، روش‌های سنتی مانند کشت خطی (Streak Plating) یا کشت در پلیت (Pour Plating)، بر پایه‌ی پخش کردن نمونه روی محیط کشت و فراهم‌سازی شرایطی بودند که در آن سلول‌های منفرد بتوانند به کلونی‌های مجزا رشد کنند. اگرچه این تکنیک‌ها مؤثر بودند، اما معمولاً نیاز به مهارت عملی بالا و صرف زمان قابل‌توجهی داشتند.
با گذر زمان و تحول در علم، رویکرد به سوی روش‌های مدرن، با تأکید بر دقت بالا، اتوماسیون و توانایی جداسازی اختصاصی‌تر و کارآمدتر میکروارگانیسم‌ها پیش رفته است.
پیشرفت‌های فناوری
ادغام فناوری‌های پیشرفته در تکنیک‌های ایزوله سازی میکروبی، تحولی چشمگیر در این حوزه به‌شمار می‌رود که دقت و کارایی بی‌سابقه‌ای را به این فرآیند افزوده است. استفاده از هوش مصنوعی (AI) و یادگیری ماشین، به‌ویژه در شناسایی و ایزوله سازی میکروارگانیسم‌ها، می‌تواند دقت و سرعت عملیات را در تحقیقات میکروبیولوژیکی به‌طرز چشمگیری افزایش دهد.
سخن پایانی
تکامل تکنیک‌های ایزوله سازی میکروارگانیسم ها، گواهی بر تلاش بی‌وقفه برای گسترش دانش در علم میکروبیولوژی است. این روش‌ها تاکنون و در آینده نیز در درک حیات میکروبی اساس خواهند بود. این تکنیک‌ها تنها ابزارهایی برای تحقیق علمی نیستند، بلکه در کاربردهای صنعتی گوناگونی همچون داروسازی و ایمنی غذایی نیز از اهمیت بالایی برخوردارند.
