تست حساسیت نووبیوسین: اصول، روش و نتایج

نووبیوسین (Novobiocin) عضوی از آنتی بیوتیک آمینوکومارین^[۱] است. این آنتی بیوتیک توسط استرپتومایسس نیوئوس اسینتوباکتر^[۲] تولید می‌شود و فرآیند سنتز DNA باکتری را مهار می‌کند. در این مقاله قصد داریم به بررسی نحوه انجام تست حساسیت نووبیوسین بپردازیم. پس با ما همراه باشید.

نووبیوسین و نحوه عملکرد آن علیه باکتری

نووبیوسین در ابتدا به عنوان یک آنتی بیوتیک برای درمان عفونت‌های ناشی از کوکسی‌های گرم مثبت پیشنهاد شد. در سپتامبر ۱۹۶۴ نیز، به عنوان یک گزینه درمانی مشخص برای درمان عفونت‌های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به سایر آنتی بیوتیک‌ها تایید گردید. با این حال، به دلیل سمیت و اثربخشی کمتر، در سال ۲۰۰۹، سازمان غذا و داروی امریکا (FDA) استفاده از آن‌را به عنوان یک اقدام درمانی ممنوع کرد.

اگرچه نووبیوسین دیگر یک گزینه درمانی نیست. اما همچنان در آزمایشگاه‌های برای شناسایی و تمایز گونه‌های استافیلوکوکوس مورد استفاده قرار می‌گیرد. در سال ۱۹۷۵، محققین دریافتند که استافیلوکوکوس اورئوس و بیشتر گونه‌های استافیلوکوک کواگولاز منفی هستند. این گونه‌ها به عنوان پاتوژن به نووبیوسین حساس هستند. اما S. saprophyticus به طور ذاتی به این دارو مقاوم است. بنابراین محققین با استناد به این موضوع، یک تست حساسیت نووبیوسین ابداع کردند تا S. saprophyticus را از سایر استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی متمایز کنند.

نووبیوسین به زیر واحد GyrB آنزیم DNA گیراز متصل می‌شود و روند رونویسی DNA را در باکتری مهار می‌کند.

اصول تست حساسیت نووبیوسین

نووبیوسین در فرآیند سنتز DNA باکتریایی تداخل ایجاد می‌کند. به این ترتیب از تکثیر باکتری‌ها و تشکیل کلونی جلوگیری می‌نماید. بسیاری از گونه‌های استافیلوکوک (هم کواگولاز مثبت و هم منفی) به نووبیوسین حساس هستند. در بین اعضای بیماری زا استافیلوکوکاسه، استافیلوکوکوس اورئوس، استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، استافیلوکوکوس هومینیس و استافیلوکوکوس همولیتیکوس شایع‌‌ترین هستند.

همه این پاتوژن‌ها به نووبیوسین حساس هستند به جز S. saprophyticus. این الگوی حساسیت ضد میکروبی اصلی است که بر اساس آن می‌توانیم به راحتی S. saprophyticus را در میان سایر موارد متمایز کنیم.

محیط کشت‌های مورد استفاده در تست حساسیت نووبیوسین

به‌طور کلی، مولر هینتون آگار یا آگار خون برای انجام تست حساسیت نووبیوسین ترجیح داده می‌شود. با این وجود می‌توان از سایر محیط کشت‌ها هم استفاده کرد. به طور کلی انتخاب محیط کشت برای انجام این تست بستگی به ترجیح آزمایشگاه دارد.

مراحل تست حساسیت نووبیوسین

به‌طور کلی، این آزمایش را می‌توان با استفاده از دو روش کمی متفاوت انجام داد.

روش هبرت با استفاده از آگار خون و روش انتشار دیسک کربی بائر با استفاده از مولر هینتون آگار.

اگر از آگار خون استفاده می کنید، سوسپانسیون باکتریایی آزمایشی را با آب مقطر استریل (یا براث تریپتیک سویا) در یک لوله آزمایش استریل با کدورت برابر با مک فارلند شماره ۱ تهیه کنید.

اگر از مولر هینتون آگار استفاده می‌کنید، سوسپانسیون باکتریایی را با آب مقطر استریل (یا براث تریپتیک سویا) در یک لوله آزمایش استریل با کدورت برابر با مک فارلند عدد ۰٫۵ تهیه کنید.

با استفاده از لوپ استریل، سوسپانسیون باکتریایی را در پلیت حاوی آگار تلقیح کنید.

*در آگار خون ، تلقیح را در یک بخش از پلیت و در یک جهت انجام دهید.

*در مولر هینتون آگار ، تلقیح را در سه جهت (به طور یکنواخت در سراسر پلیت) انجام دهید.

اجازه دهید سوسپانسیون به پلیت بچسبد و خشک شود. سپس پلیت را حدود ۵ تا ۱۰ دقیقه در وضعیت عمودی قرار دهید.

با استفاده از فورسپس استریل، دیسک آنتی بیوتیک نووبیوسین را در ناحیه تلقیح قرار دهید و به آرامی دیسک آنتی بیوتیک را فشار دهید تا مطمئن شوید کاملا روی سطحپلیت قرار گرفته است.

پلیت را به صورت هوازی در دمای ۲±۳۵ درجه سانتیگراد به مدت یک شب انکوبه کنید. ۱۸ ساعت برای مولرهینتون آگار و ۲۴ ساعت برای بلاد آگار.

پس از انکوباسیون، پلیت را از نظر وجود هاله عدم رشد ( ناحیه مهار) بررسی کنید. در صورت وجود هاله، قطر آن را اندازه‌گیری کنید.

کنترل کیفیت در تست حساسیت نووبیوسین

استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 25923 (حساس به نووبیوسین) به عنوان کنترل مثبت استفاده می‌‍شود. ناحیه مقاوم به آنتی بیوتیک ≥۲۲ میلی‌متر است.

S. saprophyticus ATCC 15305 (مقاوم در برابر نووبیوسین) به عنوان یک کنترل منفی استفاده می‌شود. منطقه مقاوم به آنتی بیوتیک ≤۱۵ میلی متر است.

نتیجه و تفسیر تست حساسیت نووبیوسین

نتایج منفی و مثبت تست حساسیت نووبیوسین به صورت زیر مشخص می‌شود.

برای بلاد آگار (روش هیبرت)

• اندازه منطقه ≥۱۲ میلی متر = حساس به نووبیوسین
• اندازه منطقه کمتر از ۱۲ میلی‌متر = مقاوم به نووبیوسین

برای مولر هینتون آگار (روش انتشار دیسک Kirby Bauer)

• اندازه منطقه > 16 میلی متر = حساس به نووبیوسین
• اندازه منطقه ≤۱۶ میلی متر = مقاوم به نووبیوسین

در صورتی که سویه باکتری از نمونه ادرار جدا شده، کواگولاز منفی و مقاوم به نووبیوسین باشد، آن را به عنوان استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس گزارش کنید.

برخی از استافیلوکوک‌های حساس به نووبیوسین:

• S.aureus
• S.epidermidis
• S.haemolyticus
• S.hominis
• S.capitis
• S.saccharolyticus

برخی از استافیلوکوک های مقاوم به نووبیوسین

• S. saprophyticus
• S. kloosii
• S. cohnii

موارد احتیاط

• قبل از انجام تست حساسیت نووبیوسین محل کار و تجهیزات را استریل کنید. از جهیزات حفاظت فردی مناسب استفاده کرده و قوانین ایمنی آزمایشگاه را رعایت کنید.
• قبل از اینکه دمای محیط کشت مذاب شده به کمتر از ۴۰ درجه سانتیگراد برسد، آن را در پتری دیش بریزید. در غیر این صورت ممکن است توده‌هایی تشکیل شوند.
• اطمینان حاصل کنید که حباب هوا در هنگام ریختن مواد تشکیل نشده است. پلیت‌های حاوی آگار را در یک منطقه استریل (داخل کابینت ایمنی زیستی) قرار دهید. درب آن‌ها را کمی باز بگذارید تا بخار خارج شود و قطرات آب روی محیط جامد وجود نداشته باشد.
• دیسک را در فاصله ۲۵ میلی‌متری از لبه پلیت قرار دهید. اگر از چند دیسک آنتی بیوتیک استفاده می‌کنید، دیسک‌ها را حداقل ۲۵ میلی‌متر از یکدیگر دور کنید.

محدودیت‌های تست حساسیت نووبیوسین

تست حساسیت نووبیوسین محدودیت‌هایی نیز دارد. تنها در صورتی می‌توان از آن به عنوان یک روش تاییدی برای شناسایی S. saprophyticus استفاده کرد که باکتری از نمونه ادرار جدا شده باشد.

علاوه براین، برای شناسایی قطعی باکتری به آزمایشات بیوشیمیایی دیگری نیاز دارید.

از آنجایی که این یک روش مبتنی بر کشت است، به مدت زمان طولانی‌تر و مواد شیمیایی مختلف نیاز دارد. همچنین احتمال بروز نتیجه مثبت کاذب یا منفی کاذب زیاد است.

سخن پایانی

استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس پس از E. coli به عنوان شایع‌ترین ارگانیسم مسبب عفونت‌های مجاری ادراری بدون عارضه (UTIs) در زنان جوان فعال از نظر جنسی، در رتبه دوم قرار دارد. بنابراین هنگامی که ارگانیسمی شبیه استافیلوکوک از یک زن در سن باروری جدا می شود، آزمایش کواگولاز انجام می‌شود. اگر ارگانیسم به کواگولاز منفی باشد، آزمایشگاه باید آن ایزوله را بیشتر شناسایی کند و بفهمد که آیا این یک پاتوژن واقعی مقاوم یا فلور طبیعی است.

شناسایی آزمایشگاهی S. saprophyticus بر اساس عدم وجود همولیز، منفی بودن کواگولاز و مقاومت به نووبیوسین انجام می‌شود.

واژه نامه