تست هیدرولیز Tween 80: اصول انجام و نتایج حاصل از آن

لیپاز، آنزیمی است که توسط میکروارگانیسم‌های مختلف به ویژه باکتری‌ها تولید می‌شود و در صنایع غذایی و دارویی کاربردهای گسترده‌ای دارد. به همین دلیل جداسازی و شناسایی باکتری‌های مولد لیپاز اهمیت بالایی در این صنایع دارد. تست هیدرولیز Tween 80 عمدتاً برای شناسایی و افتراق باکتری‌های تولید کننده لیپاز مورد استفاده قرار می‌گیرد. در ادامه قصد داریم شما را با اصول و روش انجام این تست و همچنین نتایج حاصل از آن آشنا کنیم.

اهیمت تست هیدرولیز Tween 80

همانطور که در بخش مقدمه گفته شد، آنزیم لیپاز در زمینه‌هایی از علم بیوتکنولوژی کاربرد دارد. بخشی از این کاربردها در ادامه ذکر شده است.

• در آزمایشگاه‌ها‌ی صنایع لبنی برای آماده سازی پنیر، بهبود و توسعه طعم، تولید پنیر اصلاح شده آنزیمی
• در صنایع ارایشی برای تولید شوینده‌ها
• تولید مواد دارویی (ایبوپروفن، ناپروکسن)
• تولید مواد شیمیایی کشاورزی مانند آفت کش‌ها و حشره کش‌ها

همچنین پیش بینی می‌شود که لیپاز در سال‌های آینده در بسیاری از زمینه‌های جدیدتر به عنوان یک بیوکاتالیست بالقوه کاربرد داشته باشد.

یکی از راه‌های تولید آنزیم لیپاز، شناسایی و کشت باکتری‌های تولید کننده این آنزیم است. تست هیدرولیز Tween 80 از جمله آزمایش‌هایی است که به این منظور انجام می‌شود. از همین رو، آشنایی با روش انجام این تست و نتایج حاصل از آن اهمیت بالایی در صنایع مختلف دارد.

اصول تست هیدرولیز Tween 80

Tween 80نام تجاری ماده‌ای به نام پلی اتیلن مشتق سوربیتان مونو اولئات^[1] است. برخی از گونه‌های باکتری دارای آنزیم لیپاز هستند که با ترکیبات این ماده واکنش نشان داده و  اسید اولئیک (oleic acid) و سوربیتول پلی اکسی اتیل (polyoxyethylated sorbitol) شده آزاد می‌کنند.

در تست هیدرولیز Tween 80، ارگانیسم مورد آزمایش در یک بستر بافر Tween 80 که حاوی یک نشانگر قرمز خنثی است، انکوبه می‌شود. در صورتی که ارگانیسم قادر به تولید لیپاز باشد، نشانگر هیدرولیز Tween 80 به دلیل تولید اسید اولئیک تغییر رنگ می‌دهد. لازم به ذکر است که این تغییر رنگ به دلیل تغییر در pH نیست. بلکه به دلیل هیدرولیز Tween 80 است که چرخش نور عبوری از بستر را تغییر می‌دهد.

واکنش‎های مثبت طی 1 تا 4 روز انکوباسیون رخ می‌دهد. اما برای تایید واکنش‌های منفی 10 روز انکوباسیون لازم است.

تست هیدرولیز Tween 80 در کجا کاربرد دارد؟

این آزمایش برای شناسایی مایکوباکتریوم کانزاسی (که می‌تواند در عرض 3 تا 6 ساعت نتایج مثبت ایجاد کند) مفید است. مایکوباکتریوم کانزاسی (Mycobacterium kansasii) یک مایکوباکتریوم با رشد آهسته است که مانند سایر گونه‌های مایکوباکتریومی، تمایل به ایجاد شش الگوی بالینی عفونت دارد: بیماری ریوی، بیماری پوست و بافت نرم، عفونت‌های اسکلتی عضلانی از جمله آرتریت سپتیک تک مفصلی و بیماری تنوسینوویت، بیماری‌های منفصل و دیسمینویتیس.

یکی دیگر از کاربردهای تست هیدرولیز Tween 80 ، افتراق M.gordonae  و M.scrofulaceum  است. هردوی این میکروارگانیسم‌ها، اسکوتوکروموژن هستند. اسکوتوکروموژن‌ها، مایکوباکتریوم‌هایی هستند که در حضور نور و تاریکی ،کلنی‌های پیگمان دار ایجاد می‌کنند. M.gordonae  و M.scrofulaceum  کلنی‌های مشابهی دارند. اما  در این تست، M.gordonae مثبت و M.scrofulaceum  منفی است.

نمونه و مواد مورد نیاز برای هیدرولیز Tween 80

کلنی بالغ گونه‌های ناشناخته مایکوباکتریوم که از نمونه‌های بالینی گرفته شده است و روی Lowenstein Jensen بازیابی شده است.

• اپلیکاتور استریل
• لوله‌های درب دار 12×100
• محیط کشت
• معرف هیدرولیز Tween-80
• معرف Difco

روش انجام تست هیدرولیز Tween 80

درون لوله‌های آزمایش حدود 2 میلی‌لیتر آب دیونیزه بریزید. 2 قطره معرف Difco به آب مقطر اضافه کنید. سپس دو قطره از معرف توئین را آب مقطر استریل در لوله‌های درپوش‌دار اضافه کنید.

یک لوپ از میکروارگانیسم مورد آزمایش بردارید و آن را در ماده درون لوله تلقیح کنید.

لوله ها را در دمای 35 درجه سانتیگراد در تاریکی انکوبه کنید.

پس از گذشت 24 ساعت لوله‌ها را بررسی کنید. اگر تغییر رنگی مشاهده نکردید، مجددا لوله‌ها را به مدت 5 روز انکوبه کنید و نتایج را بررسی کنید. اگر بازهم نتیجه‌ای مشاهده نشد، پنج روز دیگر انکوباسیون را ادامه دهید.

اگر پس از گذشت 10 روز، هیچ تغییر رنگی در محیط مشاهده نکردید، نتیجه منفی است. یعنی باکتری قادر به تولید لیپاز نیست.

نتیجه مثبت زمانی ثبت می‌شود که مایع از نارنجی روشن به صورتی یا قرمز تبدیل شود. به عنوان مثال M.kansaii معمولاً در عرض 24 ساعت مثبت می‌شود.

کنترل کیفیت

هر تست بیوشیمیایی نیاز به کنترل کیفیت دارد. به این صورت که هم زمان با آزمایش، یک میکروارگانیسم که کاملا شناخته شده باشد، در همان محیط کشت و با همان شرایط انکوبه می‌شود. به این ترتیب می ‌توان نتایج تست را با این لوله مقایسه کرد. در تست هیدرولیز Tween  80 از میکروارگانیسم‌های زیر به عنوان کنترل مثبت و منفی استفاده می‌شود: 

کنترل مثبت: M.kansasii (ATCC-12478) به مدت 12 روز انکوبه شد.

کنترل منفی: کشت استوک M. intracellulare (ATCC-13950) به مدت 12 روز انکوبه شد.

سخن پایانی

همانطور که گفته شد، آنزیم لیپاز یکی از آنزیم های پرکاربرد در بسیاری از حوزه های آزمایشگاهی از جمله صنایع غذایی و لبنی است. این آنزیم از منابع مختلفی به دست می‌آید که یکی از آن‌ها باکتری‌ها هستند.  به همین دلیل افتراق و کشت باکتری‌های تولید کننده این آنزیم در آزمایشگاه اهمیت دارد. آزمایش هیدرولیز Tween 80 یک تست رایج برای شناسایی باکتری های تولید کننده لیپاز است. در این تست، چنانچه باکتری قادر به تولید این آنزیم باشد رنگ محیط از نارنجی به قرمز یا صورتی تغییر خواهد کرد. در این مقاله سعی کردیم مروری بر اصول این تست داشته باشیم. امیدواریم این مقاله مورد توجه شما قرار گرفته باشد.

واژه نامه