بلاتینگ چیست؟ معرفی انواع روش‌های بلاتینگ در آزمایشگاه
روش‌های بلاتینگ ابزاری ضروری در بیولوژی مولکولی و بیوشیمی هستند که به محققان اجازه می‌دهند اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها را شناسایی و تجزیه و تحلیل کنند. این تکنیک‌ها دانشمندان را قادر می‌سازد تا جزئیات پیچیده‌ای را در مورد مواد ژنتیکی، بیان ژن و تعاملات پروتئینی کشف کنند. تکنیک های بلاتینگ انواع مختلفی دارند که در این مقاله به بررسی هریک خواهیم پرداخت. پس با ما همراه باشید.
انواع روش‌های بلاتینگ
روش‌های بلاتینگ ابزارهای تحلیلی هستند که به طور گسترده برای شناسایی خاص قطعات DNA یا RNA مورد نظر محققین استفاده می‌شود. بلاتینگ به فرایند تثبیت اسیدهای نوکلئیک نمونه بر روی یک پشتیبان جامد اشاره دارد. سپس این اسیدهای نوکلئیک بلات‌شده به‌عنوان هدف در آزمایش‌های هیبریداسیون برای شناسایی اختصاصی آن‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند. اما انواع مختلف بلاتینگ چیست و هریک چه کاربردی دارد؟
ساترن بلاتینگ
روش اولیه بلاتینگ در سال ۱۹۷۵ توسط E. M. Southern توسعه یافت تا مکان ژن‌ها و سایر توالی‌های DNA را روی قطعات محدودشده‌ای که با روش الکتروفورز ژل جدا شده‌اند، شناسایی کند. به همین دلیل به نام ساترن بلاتینگ (Southern blotting) نام‌گذاری شد. تکنیک ساترن بلاتینگ روشی بسیار حساس است و برای نقشه‌برداری از سایت‌های برش آنزیم‌های محدودکننده در اطراف یک ژن خاص در هر ژنوم، تهیه نقشه‌های RFLP، اثر انگشت DNA و شناسایی ژن‌های منتقل‌شده استفاده می‌شود. از آنجا که کاغذ نیتروسلولزی بسیار شکننده است، امروزه با غشای نایلونی جایگزین شده است.
مراحل اولیه جداسازی DNA در روش ساترن بلاتینگ
در این نوع بلاتینگ، نمونه‌ای از DNA که حاوی قطعاتی با اندازه‌های مختلف است، تحت الکتروفورز با استفاده از ژل پلی‌آکریل‌آمید یا آگاروز قرار می‌گیرد. مولکول‌های DNA توسط آنزیم‌های محدودکننده به قطعات کوچکتر برش داده شده و از طریق روش الکتروفورز از میان ژل آگاروز عبور می‌کنند که باعث جداسازی مولکول‌های DNA بر اساس اندازه آن‌ها می‌شود. سپس، DNA با قرار گرفتن در معرض یک محلول قلیایی دناتوره شده و به رشته‌های تک‌رشته‌ای تبدیل می‌شود.
فرآیند بلاتینگ و تثبیت DNA روی غشا
در ادامه‌ی فرایند بلاتینگ، ژل روی یک کاغذ صافی اشباع‌شده از بافر قرار گرفته و با یک فیلتر نیتروسلولزی پوشانده می‌شود که روی آن کاغذ صافی خشک قرار دارد. بافر از پایین فیلتر از طریق عمل موئینگی حرکت کرده و DNA درون غشای نیتروسلولزی به دام می‌افتد. این فرآیند به بلاتینگ معروف است. سپس، غشای نیتروسلولزی از پشته بلاتینگ جدا شده و DNA با پخت در دمای ۸۰ درجه سانتی‌گراد یا اتصال متقابل ناشی از اشعه فرابنفش به‌طور دائمی روی غشا تثبیت می‌شود.
افزودن پروب برای شناسایی توالی‌های خاص
DNA تک‌رشته‌ای تمایل بالایی برای اتصال به غشای نیتروسلولزی دارد، بنابراین غشا با محلولی حاوی ۰٫۲% از فیکول، پلی‌وینیل‌پیرولیدون و آلبومین سرم گاوی تیمار می‌شود تا از اتصال غیراختصاصی پروب رادیواکتیو جلوگیری شود. سپس، غشا در محلول حاوی RNA نشاندارشده، DNA تک‌رشته‌ای یا الیگودئوکسی‌نوکلئوتید (پروب) قرار می‌گیرد. این نوکلئوتید نشاندارشده که حاوی توالی موردنظر است، برای شناسایی و مکان‌یابی توالی مکمل استفاده شده و به آن پروب گفته می‌شود. پروب حاوی توالی هدف با DNA تثبیت‌شده روی غشا هیبرید شده جفت می‌شود.
آشکارسازی نتایج با استفاده از فیلم اشعه ایکس
پس از واکنش هیبریداسیون، غشا برای حذف پروب‌های متصل‌نشده شسته شده و سپس در معرض فیلم X-ray قرار می‌گیرد تا وجود رادیواکتیویته در پروب متصل‌شده را تشخیص دهد. پس از ظاهر شدن فیلم، نوارهایی که نشان‌دهنده موقعیت قطعات DNA مکمل با پروب رادیواکتیو هستند، مشاهده می‌شوند.
نورترن بلاتینگ
نورترن بلاتینگ (Northern blotting) به طور عمده در مطالعات بیان ژن مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش همچنین برای تعیین این که یک ژن خاص در همه بافت‌های یک میکروارگانیسم یا فقط در برخی از بافت‌ها رونویسی می‌شود، به کار می‌رود.
در سال ۱۹۷۹، Alwine و همکارانش روشی را ابداع کردند که در آن نوارهای RNA از ژل به یک کاغذ شیمیایی فعال منتقل می‌شوند. برای این منظور، کاغذ آمینوبنزیلوکسی‌متیل سلولز از کاغذ واتمن ۵۴۰ پس از انجام یک سری واکنش‌های ساده تهیه شد. این کاغذ سپس دیازوتیزه شده و به کاغذی واکنش‌پذیر تبدیل می‌شود که قابلیت هیبرید شدن با پروب‌های DNA نشاندارشده با رادیواکتیو را دارد. پس از هیبریداسیون، نوارهای هیبریدشده با اتورادیوگرافی شناسایی می‌شوند. روش آل‌واین در واقع توسعه‌ای از روش سادرن بلاتینگ است و به همین دلیل اصطلاح “نورترن بلاتینگ” به آن داده شده است.
روش توماس و بهینه‌سازی انتقال RNA
در سال ۱۹۸۰، توماس کشف کرد که نوارهای mRNA را می‌توان مستقیماً روی کاغذ نیتروسلولزی تحت شرایط مناسب بلات کرد و سپس با یک پروب DNA یا RNA نشاندارشده هیبرید کرد. در این روش، هیبریدها با استفاده از آنزیم S-1 نوکلئاز و RNase تیمار می‌شوند که RNA تک‌رشته‌ای و پروب DNA/RNA را هضم می‌کند. ساختار mRNA با بررسی میزان حفاظت آن از پروب نوکلئوتیدی آشکار می‌شود. در این تکنیک، برخلاف روش آل‌واین، نیازی به تهیه کاغذ واکنش‌پذیر نیست.
وسترن بلاتینگ
در سال ۱۹۷۹، تووین و همکارانش روش وسترن بلاتینگ (western blotting) یا بلات پروتئینی یا الکتروبلاتینگ را برای شناسایی پروتئین‌های جدید کد شده توسط یک سلول تبدیل‌شده توسعه دادند. در این روش، از الکتروفورز ژل پلی‌آکریل‌آمید برای جداسازی و شناسایی پروتئین‌ها استفاده می‌شود. پروتئین‌ها از سلول‌های تبدیل‌شده استخراج شده و با استفاده از الکتروفورز ژل پلی‌آکریل‌آمید سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) جداسازی می‌شوند.
سدیم دودسیل سولفات به عنوان یک ماده دناتوره‌کننده برای پروتئین‌ها در حین الکتروفورز عمل می‌کند. پس از انجام الکتروفورز، پروتئین‌های فردی با استفاده از آنتی‌بادی‌های خاص شناسایی شده و پلی‌پپتیدها نیز می‌توانند به غشای نیتروسلولزی منتقل شوند. فرآیند انتقال پروتئین‌ها از ژل‌ها به غشاهای نیتروسلولزی وسترن بلاتینگ نامیده می‌شود. این کار با استفاده از جریان الکتریکی انجام می‌شود، به همین دلیل این روش الکتروبلاتینگ نیز نامیده می‌شود.
الکتروبلاتینگ
در این روش بلاتینگ، یک میدان الکتریکی به کار برده می‌شود تا پروتئین‌ها از ژل به کاغذ صافی نیتروسلولزی مهاجرت کنند. سپس، از غشای نیتروسلولزی برای انجام پروب زدن با آنتی‌بادی خاص نشاندارشده استفاده می‌شود. این آنتی‌بادی با استفاده از علامت‌دهی رادیواکتیو نشاندار شده و سیگنال آن دوباره با اتورادیوگرافی شناسایی می‌شود.
تکنیک دات و اسلات بلاتینگ
دات و اسلات بلاتینگ (Dot and slot blotting) برای شناسایی حضور یک توالی خاص از DNA/RNA در DNA غیرتفکیک‌شده استفاده می‌شود. این روش با حذف مراحل پیچیده‌ای چون پیوست‌سازی، الکتروفورز و بلاتینگ ژل ساده می‌شود. در این روش، نمونه‌های DNA یا RNA از افراد یا بافت‌های مختلف به صورت نقاط (dots) یا شیارها (slots) روی فیلتر نیتروسلولزی منتقل می‌شوند. به همین دلیل به این روش دات و اسلات بلاتینگ گفته می‌شود.
این فرایند به این صورت است که ابتداDNA دناتوره شده و سپس فیلتر در دمای ۸۰°C پخته می‌شود تا DNA ثابت شود. سپس، فیلتر نیتروسلولزی با پروب DNA تک‌رشته‌ای نشاندار شده رادیواکتیو تیمار می‌شود. پس از آن، غشا با پروب نشاندار شده رادیواکتیو (DNA یا RNA) هیبرید می‌شود و نقاط با استفاده از اتورادیوگرافی شناسایی می‌شوند. شدت هر نقطه نشان‌دهنده غلظت نسبی توالی مربوط به پروب در نمونه DNA است.
سخن پایانی
روش‌های بلاتینگ به طور کلی تکنیک‌هایی هستند که برای شناسایی، بررسی و تحلیل پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک یا دیگر مولکول‌های بیولوژیکی مورد استفاده قرار می‌گیرند. این روش‌ها معمولاً شامل انتقال مولکول‌های هدف از ژل‌ها به غشاهای خاص به کمک میدان الکتریکی و سپس شناسایی با استفاده از پروب‌های خاص هستند. در این مقاله به بررسی انواع روش‌های بلاتینگ پرداخته شد. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.
