آشنایی بیشتر با رنگ‌آمیزی ویابیلیتی (زنده مانی سلول ها) در آزمایشگاه

در مورد رنگ‌آمیزی ویابیلیتی و کمی در آزمایشگاه چه می دانید؟

بسیاری از محققین علاقه‌مند به تعیین کمیت تعداد کل سلول‌ها و همچنین تعیین کمیت سلول‌های زنده در مقابل سلول‌های مرده در یک محیط هستند. تا به این طریق زیست توده باکتریایی را تعیین نمایند. در ادامه نگاهی اجمالی به تکنیک‌های رنگ‌آمیزی متداول مورد استفاده برای شمارش سلول‌ها و بررسی ویابیلیتی یا میزان زنده ماندن آن‌ها خواهیم داشت.

ویابیلیتی سلول چیست؟

ویابیلیتی سلول (Cell viability) به معنی بررسی تعداد سلول‌های سالم در یک نمونه است. بررسی این موضوع یک شاخص حیاتی برای درک مکانیزم‌های عملکرد ژن‌ها، پروتئین‌ها و مسیرهای دخیل در بقا یا مرگ سلولی پس از قرار گرفتن در معرض عوامل سمی است.

ویابیلیتی سلول معمولاً با اندازه‌گیری ظرفیت سلول‌ها برای حذف رنگ‌های حیاتی مانند DAPI تعیین می‌شود. کسری از سلول‌هایی که DAPI را حذف می‌کنند یا مورفولوژی هسته‌ای طبیعی را نشان می‌دهند، قبلاً عملکرد میتوکندری را از دست داده‌اند. از این رو به‌طور غیرقابل جبرانی متعهد به مرگ هستند.

در ادامه به بررسی رنگ‌های مورد استفاده و رایج در رنگ‌آمیزی ویابیلیتی سلول‌ها خواهیم داشت.

رنگ‌آمیزی ویابیلیتی

رنگ‌های مورد استفاده در رنگ‌آمیزی ویابیلیتی، بین سلول‌های باکتریایی زنده و مرده در یک نمونه تمایز قائل می‌شوند. تمایز این رنگ‌های فلورسنت بر اساس سالم بودن یا نبودن غشای سیتوپلاسمی سلول است. یک رنگ قرمز و سبز به نمونه اضافه می‌شود. رنگ سبز در تمام سلول‌ها (زنده و مرده) نفوذ می‌کند. در حالی که رنگ قرمز که حاوی یدید پروپیدیوم است و تنها به سلول‌هایی نفوذ می‌کند که غشای سلولی آن‌ها دیگر دست نخورده نیست (و در نتیجه مرده هستند). بنابراین، سلول‌هایی که رنگ سبز را حفظ می‌کنند زنده هستند، در حالی که سلول‌هایی که لکه قرمز را می‌گیرند مرده هستند.

رنگ آمیزی فلورسنت با استفاده از DAPI

DAPI یک رنگ رایج برای شمارش باکتری‌ها یا شمارش سلول‌ها است. این یک رنگ DNA غیرقابل نفوذ است. این ماده تا حد زیادی توسط غشای پلاسمایی سلول‌های زنده حذف می‌شود. اما می‌تواند وارد یک غشای آسیب‌دیده شود که در آن رنگ با DNA سلول تعامل می‌کند. این رنگ در واقع مخفف (4′, 6-diamido- 2-phenylindole) می‌باشد. DAPI یک رنگ فلورسنت است که اسیدهای نوکلئیک را رنگ‌آمیزی می‌کند و نسبتاً با مواد بی اثر و غیر بیولوژیکی واکنش نشان نمی‌دهد. بنابراین می‌تواند در تمایز بین اجزای زنده و غیر زنده در نمونه مفید باشد. سلول‌های رنگ آمیزی شده با DAPI در زیر میکروسکوپ فلورسنت، آبی به نظر می‌رسند. اما لازم به ذکر است که این رنگ غیر اختصاصی است. به این معنی که تمام سلول‌ها را رنگ می کند و بین سلول های زنده و مرده یا گونه‌ها یا موجودات خاص تمایز قائل نمی‌شود.

آنتی بادی های فلورسنت برای رنگ‌آمیزی ویابیلیتی

آنتی بادی‌های فلورسنت می‌توانند برای شناسایی یا ردیابی یک ارگانیسم خاص در یک جمعیت میکروبی پیچیده و یا متنوع استفاده شوند. آنتی بادی‌های خاصی در آزمایشگاه برای اتصال با ارگانیسم‌های خاص ایجاد می شوند. ایجاد آن‌ها اغلب وقت گیر و پرهزینه است. اما می‌تواند یک ماده مهم در رنگ‌آمیزی ویابیلیتی سلول‌ها باشد.

پروتئین فلورسنت سبز (GFP)

این نوع رنگ‌آمیزی شامل وارد کردن یک ژن کدکننده پروتئین، یک پروتئین فلورسنت سبز (GFP) به ژنوم یک باکتری از طریق مهندسی ژنتیک است. هنگامی که نمونه با میکروسکوپ فرابنفش مشاهده می‌شود، سلول‌های دارای برچسب GFP سبز فلورسانس می‌شوند. GFP را نمی‌توان در مطالعه جمعیت‌های طبیعی استفاده کرد. زیرا GFP باید در ژنوم وارد شود. با این حال، سلول‌های دارای برچسب GFP را می‌توان به یک محیط معرفی کرد و در طول زمان از زمانی که GFP به فرزندان منتقل می‌شود، نظارت کرد.

محدودیت‌های رنگ‌آمیزی ویابیلیتی

در حالی که رنگ‌آمیزی ویابیلیتی در آزمایشگاه برای به دست آوردن بینش در مورد تعداد کل سلول‌های باکتری در یک محیط مفید است، اما محدودیت‌های متعددی نیز دارد. برخی از محدودیت‌های کلیدی در زیر ذکر شده است.

• مشاهده سلول‌های کوچک حتی با کمک میکروسکوپ ممکن است دشوار باشد. این سلول‌ها ممکن است نادیده گرفته شوند یا در پشت ذرات غیر زنده در یک نمونه پنهان شوند.
• ممکن است تعیین کمیت تعداد زیادی سلول دشوار باشد و نیاز به رقیق شدن نمونه داشته باشد.
• ممکن است شمارش توده‌های سلولی یا سلول‌های متصل به بسترها دشوار باشد. زیرا سلول‌های منفرد را نمی‌توان در توده سلولی از یکدیگر متمایز کرد.
• ممکن است در نمونه های طبیعی رنگ آمیزی شده برای زنده ماندن، تمایز بین سلول‌های مرده و مواد غیر زنده دشوار باشد.
• این رنگ‌ها نمی‌توانند بین گونه‌ها تمایزی ایجاد کنند. بنابراین نمی‌توانند تنوع گونه‌ها را در یک نمونه مخلوط اندازه گیری کنند.

سخن پایانی

در حالی که رنگ‌آمیزی ویابیلیتی محدودیت‌هایی دارد، اما کاربردهای زیادی در آزمایشگاه دارند و  معمولاً در توصیف جزء زیستی یک نمونه استفاده می‌شوند. این روش‌ها ممکن است همراه با سایر روش‌های مولکولی، مانند روش‌هایی که از ژنتیک برای تمایز بین گونه‌ها استفاده می‌کنند، تقویت شوند.

در این مطلب سعی کردیم مروری مختصر بر نحوه عملکرد رنگ‌آمیزی ویابیلیتی داشته باشیم. شما برای بررسی ویابیلیتی سلول از چه روشی در آزمایشگاه خود استفاده می‌کنید؟