VRBL آگار : محیطی طلایی برای ردیابی کلیفرمها در صنایع غذایی و آزمایشگاه
در صنایع غذایی، لبنی و نظارت بر کیفیت آب، شناسایی باکتری‌های کلیفرم (به‌ویژه اشریشیا کلی و انتروباکتریاسه) یکی از چالش‌های اصلی آزمایشگاه‌هاست. این باکتری‌ها به عنوان شاخص آلودگی میکروبی شناخته می‌شوند و حضور آن‌ها می‌تواند نشان‌دهنده نقص در فرآیندهای بهداشتی باشد. محیط کشت VRBL آگار(Violet Red Bile Lactose Agar) یک محیط انتخابی-افتراقی است که به‌طور گسترده برای جداسازی و شمارش باکتری‌های تخمیرکننده لاکتوز (کلیفرمها) در نمونه‌های آب، شیر، مواد لبنی و سایر فرآورده‌های غذایی استفاده می‌شود.
در ایران، با توجه به چالش‌هایی مانند عدم دسترسی به محیط‌های کشت وارداتی یا مشکلات در استانداردسازی روش‌های تشخیصی، آشنایی دقیق با ترکیبات، اصول کار و محدودیت‌های این محیط کشت ضروری است. این مقاله به بررسی علمی VRBL آگار، روش تهیه، تفسیر نتایج و کاربردهای آن در آزمایشگاه‌های تشخیصی می‌پردازد.
ترکیبات شیمیایی VRBL آگار
این محیط کشت با فرمولاسیون دقیق خود، ابزاری کارآمد برای جداسازی انتخابی باکتری‌های کلیفرم محسوب می‌شود. هر یک از ترکیبات آن نقش خاصی در عملکرد محیط ایفا می‌کنند که در ادامه ذکر شده است:
- پپتون و عصاره مخمر: تأمین مواد مغذی ضروری برای رشد باکتری‌ها
- لاکتوز: عامل تفریقی برای شناسایی باکتری‌های تخمیرکننده
- نمک‌های صفراوی و کریستال ویوله: مهارکننده‌های قوی برای باکتری‌های گرم مثبت
- رد خنثی: نشانگر pH برای تشخیص تولید اسید از تخمیر لاکتوز
جدول زیر ترکیبات اصلی این محیط کشت را نشان می‌دهد:
| ماده تشکیل‌دهنده | مقدار در هر لیتر |
| پپتون | ۷ گرم |
| عصاره مخمر | ۳ گرم |
| سدیم کلرید | ۵ گرم |
| لاکتوز | ۱۰ گرم |
| نمک‌های صفراوی (نوع ۳) | ۱.۵ گرم |
| کریستال ویوله | ۰.۰۰۲ گرم |
| رد خنثی | ۰.۰۳ گرم |
| آگار | ۱۵ گرم |
| آب مقطر/دیونیزه | ۱۰۰۰ میلی‌لیتر |
- pH نهایی: ۷.۴ ± ۰.۲ در دمای ۲۵°C
- شرایط نگهداری:
- محیط آماده شده VRBL آگار را در دمای۲-۸۲ درجه سانتی گراد و دور از نور مستقیم نگهداری شود.
- پودر خشک محیط در ظروف درب بسته، در دمای۱۵ الی ۲۵درجه سانتی گراد و دور از رطوبت و نور قرار گیرد.
در صورت تغییر رنگ پودر یا به هم چسبیدگی ذرات، محیط کشت غیرقابل استفاده است.
مکانیسم عملکرد VRBL آگار
VRBL آگار بر اساس محیط مکانیکی طراحی شده و با استفاده از عوامل بازدارنده و نشانگرهای pH، امکان تشخیص تفریقی باکتری‌های تخمیرکننده لاکتوز را فراهم می‌کند.
- نمک‌های صفراوی و کریستال ویوله: از رشد باکتری‌های گرم‌مثبت و برخی گرم‌منفی‌های ناخواسته جلوگیری می‌کنند.
- لاکتوز: تنها منبع کربوهیدرات در محیط است. باکتری‌های تخمیرکننده لاکتوز (مانند کلیفرمها) با تولید اسید، رنگ محیط را تغییر می‌دهند.
- رد خنثی: نشانگر pH است. در صورت تخمیر لاکتوز، کلنی‌ها به رنگبنفش-قرمز با هاله‌ای هم‌رنگ ظاهر می‌شوند.
- کلنی‌های غیرتخمیرکننده لاکتوز: بی‌رنگ یا سبز-کمرنگ دیده می‌شوند.
افزایش انتخابی بودن:
- انکوباسیون در شرایطبی‌هوازی یا دمای بالای ۴۲°سانتی گراد (برای ۱۸ ساعت) رشد باکتری‌های مزاحم را کاهش می‌دهد.
از آزمایشگاه تا خط تولید: یک پروتکل بی‌نقص
تهیه صحیح VRBL آگار نیازمند رعایت نکات کلیدی است:
- حل کردن پودر: ۳۸.۵ گرم پودر را در ۱ لیتر آب مقطر حل کرده و ۵ دقیقه صبر کنید تا جذب کامل شود.
- حرارت دادن: محیط را به آرامی حرارت داده و هم بزنید تا به نقطه جوش برسد. از اتوکلاو کردن اجتناب کنید.
- خنک‌کردن: محیط را تا ۴۵°سانتی گراد خنک کرده و pH را در صورت نیاز به ۷.۴ ± ۰.۲ تنظیم کنید.
- ریختن در پلیت: محیط را در پلیت‌های استریل ریخته و حداکثر تا ۴ ساعت پس از تهیه استفاده کنید.
تفسیر نتایج پس از انکوباسیون
پس از ۱۸-۲۴ ساعت انکوباسیون در ۳۷°C، کلنی‌ها به صورت زیر مشاهده می‌شوند:
| باکتری | رشد | رنگ کلنی |
| Escherichia coli | خوب | بنفش-قرمز با هاله |
| Enterobacter aerogenes | خوب | صورتی |
| Salmonella typhimurium | خوب | بنفش با هاله |
| Pseudomonas aeruginosa | خوب | بژ-صورتی |
| Staphylococcus aureus | عدم رشد | – |
- کلنی‌های بنفش-قرمز با قطر ≥۰.۵ میلی‌متر به عنوان کلیفرم گزارش می‌شوند.
کاربردهای VRBL آگار در صنعت و آزمایشگاه
محیط کشت VRBL آگار در حوزه آزمایشگاهی زیر کاربرد دارد
- کنترل کیفیت مواد غذایی: تشخیص آلودگی در شیر، پنیر و آب.
- پایش محیطی: نظارت بر بهداشت تجهیزات لبنی.
- مطالعات پژوهشی: بررسی حضور کلی‌فرم‌های ترموتولران (مقاوم به حرارت).
محدودیت‌ها و ملاحظات ایمنی
۱. حساسیت به دما: برخی سویه‌های آسیب‌دیده کلیفرم ممکن است رشد نکنند.
۲. جایگزین‌ها: در صورت نیاز به بازیابی کلی‌فرم‌های آسیب دیده، از محیط FCA استفاده شود.
۳. از لباس محافظ و دستکش استفاده نمایید و جهت جلوگیری از انتشار آلودگی پلیت‌های آلوده را مطابق با دستورالعمل‌های زیست‌ایمنی دفع نمایید.
توصیه‌های کاربردی
- VRBL آگار یک محیط قابل اعتماد برای تشخیص کلیفرمها در نمونه‌های غذایی و آب است.
- برای نتایج دقیق‌تر،تست‌های تأییدی مانند تست ( IMViC برای coli ) انجام شود.
- در صورت نیاز به تشخیص سریع‌تر، روش‌های مولکولی مانندPCR می‌توانند مکمل این روش باشند.
- استفاده ازنمودار مقایسه‌ای محیط‌های کشت انتخابی کلیفرم (مقایسه VRBL با EMB آگار) می‌تواند به درک بهتر انتخاب محیط کمک کند.
سخن پایانی
محیط کشت VRBL آگار به‌عنوان یک ابزار کلیدی در کنترل کیفیت میکروبی مواد غذایی و آب، نقش حیاتی در تضمین سلامت عمومی ایفا می‌کند. با توجه به چالش‌های آزمایشگاه‌های ایران در تأمین محیط‌های کشت وارداتی، تسلط بر روش‌های استاندارد تهیه و تفسیر این محیط ضروری است. به کارگیری دقیق پروتکل‌های ذکرشده و توجه به محدودیت‌های آن، دقت نتایج را افزایش می‌دهد. توصیه می‌شود برای تأیید نهایی نتایج، از تست‌های تکمیلی استفاده شود. در نهایت، تلفیق این روش با فناوری‌های نوین تشخیصی، راهکاری مؤثر برای پایش سریع‌تر آلودگی‌ها خواهد بود.
